CN109082366A

CN109082366A - 一种分离稻瘟病菌单孢菌株的装置及方法

Info

Publication number: CN109082366A
Application number: CN201811032793.XA
Authority: CN
Inventors: 董丽英; 刘树芳; 杨勤忠; 李家瑞
Original assignee: Institute of Agricultural Environment and Resources of Yunnan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Agricultural Environment and Resources of Yunnan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-09-05
Filing date: 2018-09-05
Publication date: 2018-12-25

Abstract

本发明涉及一种分离稻瘟病菌单孢菌株的装置及方法，属于农业植物保护技术领域。本发明提供的分离稻瘟病菌单孢菌株的装置，包括显微镜，所述显微镜包括经改装后的集光器；所述经改装后的集光器包括：集光器外围固定圆环、镶嵌在所述集光器外围固定圆环内的中空软木塞圆环和一端固定在所述中空软木塞圆环上的玻璃毛细管；所述玻璃毛细管的另一端拉制为针尖，所述针尖与玻璃毛细管呈钝角。本发明所述装置能够实现稻瘟病菌单孢菌株的快速、简单分离。

Description

一种分离稻瘟病菌单孢菌株的装置及方法

技术领域

本发明涉及农业植物保护技术领域，具体涉及一种简单、快速分离稻瘟病菌单孢菌株的装置及方法。

背景技术

水稻Oryza sativa是世界上最重要的粮食作物之一，全球约一半以上的人口以稻米作为主食。由真菌Magnaporthe oryzae(Couch and Kohn，2002)引起的稻瘟病是世界水稻生产区危害最为严重的病害之一，全球每年因稻瘟病危害所造成的经济损失超过70亿美元；发病田块通常可造成10-30％的水稻减产，严重的田块甚至绝收(Khush and Jena，2009；Wilson and Talbot，2009；Liu et al.，2010；Dean et al.,2012；Scheuermann etal.，2012)。稻瘟病菌和水稻品种之间的特异性互作符合Flor“基因对基因”假说，持有特定抗病基因的水稻品种与病原菌互作时，只有病原菌持有与该特定基因相对应的无毒基因时，品种才表现出抗性，其它任何一种情况品种均表现感病(Flor H H.,1971；Valent,1991；Ebbole,2007)。因此，抗病品种的利用、选育和推广是水稻生产上控制该病最经济、有效和环境友好的防治措施，然而，由于病原菌生理小种的遗传复杂性和易变性，新选育出来的抗性品种在推广种植时易因新生理小种的出现而导致抗性丧失(Ou,1980；Jeach etal.,2001；Suh et al.,2009；Scheuermann et al.,2012；杨勤忠，林菲等，周瑚、任佐华等，2017)。研究结果表明，水稻品种的抗病性能否长时间不丧失与其所在地区稻瘟病菌无毒基因的变化有着紧密的联系(Valent el at.,2010)。因此，开展田间稻瘟病菌群体的致病种群结构分析及监测，研究田间的稻瘟病菌致病种群构成以及生理小种快速产生的机制，掌握稻区稻瘟病菌群体组成及生理小种变化动态，有助于了解稻瘟病菌和水稻之间的互作机制，对于解决品种抗性快速丧失的问题至关重要(董丽英等，2012；雷财林等，2014；周瑚、任佐华等，2017；Liu et al.,2013；Singh et al.,2014)；还有助于抗病种质资源的筛选和培育、科学合理地品种布局以及有效发掘该地区的稻瘟病抗性资源奠定基础，也为该地区稻瘟病流行的合作监测、预警和防控提供理论依据；明确各地稻瘟病菌遗传多样性的组成情况，为水稻育种部门提供可靠的参考。

常规稻瘟病菌分离的方法。在超净工作台上将3～5cm的叶瘟或穗瘟标样在75％酒精中浸泡30s，移入到0.1％升汞中浸渍2～3min，再将处理后的标样在无菌水中冲洗反复冲洗干净，并剪成1cm左右的小段放入到无菌的平板上，放入25℃～28℃的培养箱中培养5～7天后，挑取一小块已长出的稻瘟病菌丝到新的平板上进行纯化。并放入25℃～28℃的培养箱中培养5～7天后，再取一小块纯化好的稻瘟病菌丝放到试管斜面上培养保存。常规分离稻瘟病菌：第一，分离过程繁琐，浪费人力，分离成本相对较高，在分离过程中使用0.1％的汞对工作人员和环境造成危害；第二，分离、纯化时间周期较长；第三，每个时间周期分离的稻瘟病标样有限；第四，整个分离过程中容易发生污染；第五，分离到的稻瘟病菌不可能是单孢菌株。目前缺乏一种高效分离稻瘟病菌的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分离稻瘟病菌单孢菌株的装置及方法。本发明所述装置能够实现稻瘟病菌单孢菌株的快速、简单分离。

本发明提供了一种分离稻瘟病菌单孢菌株的装置，所述装置包括显微镜，所述显微镜包括经改装后的集光器；

所述经改装后的集光器包括：集光器外围固定圆环、镶嵌在所述集光器外围固定圆环内的中空软木塞圆环和一端固定在所述中空软木塞圆环上的玻璃毛细管；所述玻璃毛细管的另一端拉制为针尖，所述针尖与玻璃毛细管呈钝角。

优选的是，所述中空软木塞圆环的制备用原料包括木屑或纸屑。

优选的是，所述中空软木塞圆环的内径与外径差为3～5mm。

优选的是，所述玻璃毛细管的直径为0.9～1.2mm，长度为100～120mm。

优选的是，所述钝角为100～180°。

优选的是，所述针尖的直径为30～80μm。

优选的是，所述装置还包括倒置培养容器；在集光器旋转调节至玻璃毛细管的针尖最低时，所述针尖不能碰到倒置培养容器底部，在集光器旋转调节所述玻璃毛细管针尖上升时，所述针尖能够与倒置培养容器底部接触。

本发明还提供了基于上述技术方案所述装置的分离稻瘟病菌单孢菌株的方法，包括以下步骤：

1)将培养有稻瘟病菌分生孢子的倒置培养容器放置在显微镜上；

2)调节集光器至目镜中可以看到针头，移动步骤1)所述含有稻瘟病菌分生孢子的倒置培养容器，使针头正对一个分生孢子；

3)调节集光器使针头上升，将单个分生孢子附着在针头上；

4)将步骤3)得到的单个分生孢子转移至标记区域进行培养，实现稻瘟病菌单孢菌株的分离。

优选的是，步骤1)所述稻瘟病菌分生孢子培养用培养基包括水琼脂培养基。

优选的是，所述水琼脂培养基的厚度为1～2mm。

本发明提供了一种分离稻瘟病菌单孢菌株的装置。本发明所述装置能够简单、快速地分离稻瘟病菌单孢菌株，只需在整洁无风的环境都可以操作，污染几率小，分离周期短，且分离数量多，有利于稻瘟病菌种群多样性、无毒基因和抗病基因的克隆，为抗病品种布局及水稻育种部分提供参考。试验结果表明，利用本申请所述装置，每天可保存100个以上单孢菌株，分离得到的菌株污染率小，无需纯化，操作时间缩短2～3.5倍。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的集光器外围固定圆环内镶嵌的装置结构示意图；

图2为本发明实施例1提供的玻璃毛细管针尖实物图；

图3为本发明实施例1提供的改装后的分离稻瘟病菌单孢菌株装置示意图；

图4为本发明实施例2提供的标样在保湿滤纸片的培养皿上、在25～28℃的培养箱中培养产孢12～24h的图片；

图5为本发明实施例2提供的含有单孢的水琼脂培养皿图片；

图6为本发明提供的玻璃毛细管针尖上升后的图片。

具体实施方式

本发明对所述显微镜没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规显微镜(含集光器部分)即可。本发明所述装置对显微镜的集光器进行了改装，所述改装的过程优选包括：拆除集光器中的光圈和透镜，在集光器外围固定圆环内镶嵌中空软木塞圆环，所述中空软木塞圆环用于固定玻璃毛细管，所述玻璃毛细管的另一端拉制为针尖，用于挑取稻瘟病菌单孢菌株。在本发明中，所述中空软木塞圆环的制备用原料包括木屑或纸屑。在本发明中，所述中空软木塞圆环的侧面高度优选为120～150mm。在本发明中，所述中空软木塞圆环的内径与外径差为3～5mm。本发明所述中空软木塞圆环内径与外径的差值设计，有利于对玻璃毛细管进行固定，本发明对所述固定的具体方法没有特殊的限定，在本发明中，优选先将玻璃毛细管插入软木塞圆环中，再点滴点燃的蜡烛液体进行固定。在本发明中，所述玻璃毛细管的直径为0.9～1.2mm，长度为100～120mm。本发明所述玻璃毛细管的针尖优选与玻璃毛细管呈钝角，便于实现稻瘟病菌单孢菌株的分离。在本发明中，所述钝角为100～180°，更优选为110～150°，最优选为120°。在本发明中，在与中空软木塞圆环半径平行的方向上，所述针尖距离圆心的距离为0～1/2半径，所述针尖位置的设定有利于在轻轻调节集光器上的软木塞后，使针尖调整到目镜的视野中。在本发明中，所述针尖优选比稻瘟病菌分生孢子略大，所述针尖的直径优选为30～80μm，更优选为40～60μm。本发明对所述针尖的拉制方法没有特殊的限定，具体地，本发明优选将玻璃毛细管的一端进行灼烧，当所述玻璃毛细管发红变软时，优选采用镊子将玻璃毛细管拉成玻璃毛细管针。具体在本发明实施例中，所述显微镜除了包括集光器外围固定圆环、镶嵌在所述集光器外围固定圆环内的中空软木塞圆环和一端固定在所述中空软木塞圆环上的玻璃毛细管，优选还包括：镜座、镜柱、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、左右调节器、前后调节器、调节器(包括：粗螺旋和细准焦螺旋)、集光器调节旋钮、反光镜、目镜和物镜。在本发明中，所述目镜和物镜的总放大倍数优选为150～200倍，若放大倍数太小，稻瘟病菌分生孢子不易辨别，若放大倍数太大，产孢少的情况下，不容易找到稻瘟病菌分生孢子，具体地，本发明更优选选择10X的目镜和15X物镜。

在本发明中，所述装置还包括倒置培养容器；在集光器调节旋钮旋转至玻璃毛细管的针尖最低时，所述针尖不能碰到倒置培养容器底部，在集光器调节旋钮旋转所述玻璃毛细管针尖上升(如图6所示)时，所述针尖能够与倒置培养容器底部接触。在本发明中，所述倒置培养容器用于培养稻瘟病菌分生孢子，在本发明中，所述稻瘟病菌分生孢子培养用培养基优选包括水琼脂培养基。本发明对所述水琼脂培养基没有特殊的限定，采用常规的水琼脂培养基即可，在本发明中，所述水琼脂培养基每1L水优选包括15g琼脂粉。在本发明中，所述水琼脂培养基的厚度优选为1～2mm，所述厚度的设置能够保证在显微镜下透过培养基能够看到玻璃毛细管针尖。

3)调节集光器使针头上升，将单个分生孢子附着在针头上；

本发明将培养有稻瘟病菌分生孢子的倒置培养容器放置在显微镜上。在本发明中，所述稻瘟病菌分生孢子培养用培养基包括水琼脂培养基。本发明对所述水琼脂培养基没有特殊的限定，采用常规的水琼脂培养基即可，在本发明中，所述水琼脂培养基每1L水优选包括15g琼脂粉。在本发明中，所述水琼脂培养基的厚度优选为1～2mm，所述厚度的设置能够保证在显微镜下透过培养基能够看到玻璃毛细管针尖。本发明优选先对稻瘟病菌进行产孢培养，然后将孢子粘附在水琼脂培养基上。在本发明中，所述产孢培养优选包括：采集含病斑的叶瘟或穗瘟标样，在25～28℃的培养箱中培养12～24h。在本发明中，所述倒置培养容器优选包括倒置培养皿，本发明对所述培养皿的规格没有特殊限定。本发明将含有稻瘟病菌分生孢子的倒置培养容器放置在显微镜的载物台上后，优选调节粗准焦螺旋和细准焦螺旋，在目镜视野中找到单孢。

在目镜视野中找到单孢后，本发明调节集光器旋钮至目镜中可以看到针头，移动所述含有稻瘟病菌分生孢子的倒置培养容器，使针头正对一个分生孢子。调节集光器使针头上升，将单个分生孢子附着在针头上。将针头上的单个分生孢子转移至标记区域进行培养，实现稻瘟病菌单孢菌株的分离。本发明对所述标记区域没有特殊的限定，所述标记区域优选位于倒置培养容器不含分生孢子的培养基上；或者优选位于另一新的倒置培养容器中均可。本发明得到单孢菌株后，优选将单孢菌株进行培养和保存，本发明对所述培养和保存方法没有特殊的限定，采用常规培养保存方法即可。在本发明中，所述培养条件优选为25～28℃培养4～5d。本发明优选将培养好的菌株在PDA试管斜面里进行保存。本发明优选挑选产孢标样在水琼脂培养基中弹开的单孢进行挑取，在进行多个单孢分离过程中，不会涉及其它单孢，在连续分离过程中无需对针头进行灭菌，操作迅速，分离周期短。本发明优选在所有分离操作开始前，对整个装置进行消毒，之后不再进行消毒处理，在无风洁净环境中进行操作即可。在本发明中，所述消毒的方法优选为蘸取75％乙醇水溶液对装置进行擦拭。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种分离稻瘟病菌单孢菌株的装置及方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

分离稻瘟病菌单孢菌株装置的制作

将普通显微镜的集光器进行改装，将组成集光器部件的聚光镜和光圈拆除，仅留下固定聚光镜的外围部分(仅剩下一个中空的圆环)，将一个跟集光器外围圆环内径接近的中空软木塞镶嵌在内，其中软木塞圆环外径与内径差在在3～5mm；将0.9～1.2mm×100～120mm的玻璃毛细管的一端在酒精灯上灼烧，在玻璃毛细管发红变软时，用镊子将玻璃毛细管拉成一个大于100°而小于180°钝角的玻璃毛细管针，针尖直径比稻瘟病菌分生孢子略大(大小30～80μm)，将玻璃毛细管的另一端插入到软木塞中，玻璃毛细管的长度范围在集光器的旋钮调节针尖最低时，针尖未碰到载物台上倒扣的直径为90mm的培养皿底部，但在集光器旋钮调节针尖上升时要可以碰到培养皿的底部，调节反光镜的角度直到目镜视野明亮，然后调节粗准焦螺旋和细准焦螺旋在目镜里能够找到针尖后，通过点滴点燃的蜡烛液体对玻璃毛细管进行固定。目镜和物镜的放大倍数在150或200倍。集光器外围固定圆环内镶嵌的装置结构(包括中空软木塞圆环和一端固定在所述中空软木塞圆环上的玻璃毛细管)如图1所示；所述玻璃毛细管针尖实物图如图2(包括图2-1和图2-2)所示；改装后的分离稻瘟病菌单孢菌株装置如图3所示，其中，图3-1为不含倒置培养皿的分离稻瘟病菌单孢菌株装置，图3-2为含倒置培养皿的分离稻瘟病菌单孢菌株装置。

实施例2

稻瘟病菌单孢菌株的分离

第一，将采集到含有病斑1～2cm的叶瘟或穗瘟标样放在含有折叠保湿滤纸片(纯净水完全浸湿)的培养皿中，放在25～28℃的培养箱中培养12～24h产孢，标样在保湿滤纸片的培养皿上、在25～28℃的培养箱中培养产孢12～24h的图片如图4所示；

第二，制作水琼脂培养基，1L水中加入15克琼脂粉，同时跟直径为90cm的培养皿一起湿热灭菌后，在每个培养皿中倒入10mL左右的水琼脂培养基后，轻轻倾斜使水琼脂均匀刚好覆盖了整个培养皿，水琼脂的厚度在1～2mm之间，在倒扣的培养基下可以在显微镜里看到玻璃毛细细管针。

第三，用标记笔将整个培养皿的底部分成面积比为1:2的两个区域，在1/3的区域用消毒后的镊子夹住标样在水琼脂培养基上轻轻粘几下，产孢后的分生孢子就散落在了培养基上，将培养皿倒扣在载物台上，接着集光器调节旋钮旋转到针尖最低(避免旋转培养皿时把针头弄断)，将含有水琼脂的培养皿到扣在载物台上，并把培养皿上含有稻瘟病菌分生孢子的位置对准物镜，调节粗准焦螺旋和细准焦螺旋，直到在目镜里可以清晰看到稻瘟病的分生孢子，接着调节集光器旋钮，使玻璃毛细管针慢慢上升，当在目镜中可以模糊看到针头时，轻轻旋转在载物台上调节器，使单孢正对针头，再旋转集光器上的调节旋钮，使得玻璃毛细细管针刚好碰到水琼脂上的单孢，轻轻旋转载物台上调节器，单孢就可以吸附在针头上，然后向下旋转集光器上的调节螺旋(避免转动培养皿时把针弄断)；

第四、将培养皿底部2/3的区域转到显微镜视野下，画小圆圈，将单孢放在画有小圆圈水琼脂上，每个培养皿根据实际情况可以挑取并放置3～5个单孢，含有单孢的水琼脂培养皿图片如图5所示。将挑有单孢的水琼脂放入25～28℃的培养箱中培养4～5天，就可以转移到PDA试管斜面里。

实施例3

采用实施例2的方法对稻瘟病菌单孢菌株进行分离，与常规分离方法(1.燕麦培养基平板制备：称取200g燕麦、15g蔗糖、15g琼脂在锥形瓶中，加水至1升，同时跟直径为90cm的培养皿一起湿热灭菌后，在每个培养皿中倒入30mL左右的燕麦培养基，待用。2.消毒：叶瘟或穗瘟经自来水冲洗后，在超净工作台上将3～5cm的叶瘟或穗瘟标样在75％的酒精中浸泡30s；3.移入0.1％的升汞中浸渍2～3min，将处理后的标样在无菌水中清洗2-3次；4.分离：将在无菌水中清洗的标样用消毒的剪子剪成3-4块，放入燕麦培养基平板上，放在25～28℃的培养箱中培养4～5天；5.纯化：挑取含有稻瘟病菌菌丝的培养基重新转入到燕麦培养基上再次纯化；6.将纯化好的含有稻瘟病菌菌丝的培养基转入到试管斜面里)相比，结果如表1所述：

表1本发明分离方法与常规分离方法分离结果对比

本发明所述分离过程只需要在整洁无风的环境都可以操作；每天可以挑取100个左右的单孢，保存菌株数量是常规分离保存法无法比拟的；分离周期大大缩短，而且获得的是单孢菌株，这利于研究稻瘟病菌种群多样性、无毒基因和抗病基因的克隆，抗病品种布局及水稻育种部门提供参考；污染机率小；节约成本；不会对工作人员和环境造成影响。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种分离稻瘟病菌单孢菌株的装置，其特征在于，所述装置包括显微镜，所述显微镜包括经改装后的集光器；

2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述中空软木塞圆环的制备用原料包括木屑或纸屑。

3.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于，所述中空软木塞圆环的内径与外径差为3～5mm。

4.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述玻璃毛细管的直径为0.9～1.2mm，长度为100～120mm。

5.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述钝角为100～180°。

6.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述针尖的直径为30～80μm。

7.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述装置还包括倒置培养容器；在集光器旋转调节至玻璃毛细管的针尖最低时，所述针尖不能碰到倒置培养容器底部，在集光器旋转调节所述玻璃毛细管针尖上升时，所述针尖能够与倒置培养容器底部接触。

8.基于权利要求1所述装置的分离稻瘟病菌单孢菌株的方法，包括以下步骤：

3)调节集光器使针头上升，将单个分生孢子附着在针头上；

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤1)所述稻瘟病菌分生孢子培养用培养基包括水琼脂培养基。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述水琼脂培养基的厚度为1～2mm。