CN113174335B - 一种香蕉炭疽病菌的分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种香蕉炭疽病菌的分离方法。该方法采用一种特制的孢子离散丝，直接从香蕉炭疽病标样中将单个分生孢子分离出来，培养形成一个遗传组成单一的香蕉炭疽病菌菌株。分离培养的实施操作步骤如下：1)香蕉炭疽病标样的准备；2)孢子离散丝的制备；3)孢子离散板的制备；4)分生孢子的离散；5)载有单孢子小方块的切取；6)单孢子分离菌株的形成。本发明具有如下优点：1)分离孢子用的关键器具简单易制，分离操作简单易行；2)分离与取得单孢菌株能一次到位；3)分离工作耗工少耗时短；4)能显著提高香蕉炭疽病菌分离的工作效率及分离结果的可靠性。

Description

一种香蕉炭疽病菌的分离方法

技术领域

本发明涉及植物病理学技术。具体是一种香蕉炭疽病菌的分离方法。

背景技术

香蕉炭疽病是我国香蕉产业的一种重大病害，该病害由香蕉炭疽病菌(Colletotrichum musae)侵染引起。开展香蕉炭疽病菌的生物学研究是香蕉炭疽病防控的重要基础。而开展香蕉炭疽病菌生物学研究的前提，必需要拥有香蕉炭疽病菌材料。一般实验室往往需要从病害标样中分离获得香蕉炭疽病菌。

香蕉炭疽病菌群体的遗传组成复杂，不同菌株的生物学特性及致病性往往存在较大差异。正常的研究通常需要取得遗传组成单一的香蕉炭疽病菌材料，或者说单克隆菌株材料。本领域一般认为由单一孢子生长形成的菌株材料属遗传组成单一的病菌材料。因此香蕉炭疽病菌的分离菌株材料一般需要获得单孢分离菌株材料。

至今公开的香蕉炭疽病菌的分离方法，主要是常规的组织分离培养方法和分生孢子稀释分离培养方法。

组织分离培养方法的主要技术特征是，需要将带菌组织进行表面消毒，再将消毒后的组织块转移到培养基上培养。该方法容易被腐生杂菌污染，重要的是分离获得的纯培养菌一般不属于遗传组成单一的香蕉炭疽病菌。

分生孢子稀释分离培养方法主要技术特征是，将发病部位的分生孢子洗涤到水介质中，并对孢子悬浮液进行适度的稀释分散，再通过微量移液枪、或毛细管、或移植针等器具，将悬浮液中的孢子分开，挑取单个分生孢子进行培养。这类方法需要实施孢子液的孢子定量及稀释操作过程，比较费时费工，而且很容易出现杂菌污染而影响分离工作的效率与效果。

发明内容

本发明的目的是，提供一种分离培养获得遗传组成单一的香蕉炭疽病菌纯培养的分离方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种香蕉炭疽病菌的分离方法，采用一种特制的孢子离散丝，直接从香蕉炭疽病标样中将单个分生孢子分离出来，培养形成一个遗传组成单一的香蕉炭疽病菌菌株，分离培养的操作步骤如下：

1.香蕉炭疽病标样的准备：将普通熟化处理的香蕉果实进行常规保湿培养，直至香蕉果上潜伏侵染的炭疽病发展成典型的病斑及孢子粘液，作为待分离病菌的香蕉炭疽病标样。

2.孢子离散丝的制备：取出1000μl普通移液枪的枪头，将枪头的尖端放在火焰上灼烧，枪头尖端燃火处熔化，安全熄火后，用尖头镊子夹住一点熔化的枪头，轻轻拉长，至形成一根发丝状的细丝，冷却后剪去多余的细丝，形成一支分离香蕉炭疽病菌分生孢子使用的孢子离散丝，该离散丝包括滑动丝a、丝柄b部分。

3.孢子离散板的制备：

①琼脂平板基质的制备：按照琼脂15g、水1000ml的配比，配制含有常规营养的琼脂基质，常规高温高压灭菌后，成为琼脂平板基质备用。

②琼脂平板的倒制与平板表层净化：将操作①制备的琼脂平板基质加热充分熔化，趁热倒入培养皿制成薄层平板，并将该热液状的平板置于能继续保持热液状的保温装置内，保温静置20分钟以上，然后将该静置的液状薄层平板，平稳转移到无菌工作台面，待液状薄层平板冷凝后，成为表层净化的琼脂平板。

③孢子离散板的切制与装片：用灭菌刀片将操作②制成的琼脂平板，切割成长条状的琼脂条块，该琼脂条块就是起分散孢子作用的离散板；用灭菌刀片将该离散板挑起装放到灭菌载玻片上，成为备待分散孢子用的离散板c。

4.分生孢子的离散：将步骤2制备的孢子离散丝进行常规表面消毒和清洁，然后手执孢子离散丝的丝柄b，将滑动丝a的端部，在步骤1准备的标样病斑表面轻轻点触孢子粘液而粘附分生孢子，将粘有孢子的滑动丝a转移到步骤3准备的孢子离散板c的一端，并贴放于离散板面上，沿着离散板面滑移滑动丝a，滑动丝a在离散板面的相对滑动，导致滑动丝a上粘附的孢子脱开散落在离散板面上。

5.载有单孢子小方块的切取：将步骤4得到的载有分生孢子的离散板c，置于显微镜下观察，沿着滑动丝a的滑动轨迹寻找离散的孢子，找出单一出现的孢子，选择与左右相邻孢子间隔距离远的单一孢子，用灭菌刀片将该单一孢子左右的离散板c切断及移开，得到只载有唯一1个分生孢子的小方块。

6.单孢子分离菌株的形成：用刀片将步骤5切出的载有单一分生孢子的小方块，转移到香蕉炭疽病菌的常规培养基上，常规培养，直到孢子萌发生长形成单孢子菌落。移植单孢子菌落的菌丝扩大繁殖，形成香蕉炭疽病菌单孢子分离菌株。

本发明的优点是：

1)分离孢子用的关键器具(孢子离散丝)简单易制，分离操作简单易行，无需难度较大的显微操作技术训练。

2)分离与取得单克隆菌株能一次到位，无需再行专门的单孢分离程序。

3)分离操作耗工少耗时短。

4)承载分生孢子的板面经过表层净化，显微镜观察到的有效视野较均匀干净，在寻找识别香蕉炭疽病菌分生孢子操作过程中，不容易受到非熔杂质的干扰，能显著提高分离工作的效率及分离结果的可靠性。

附图说明

图1是孢子离散丝示意图。图中，滑动丝a，丝柄b。

图2是摆放在载玻片上的孢子离散板示意图。图中，离散板c，载玻片d。2-1图示意正面观，2-2图示意侧面观。

图3是孢子滑散操作示意图。图中，滑动丝a，丝柄b，离散板c，载玻片d，滑动丝的滑动方向e。

图4是显微镜观察到的离散板表面图。图中，分生孢子a，杂质b。4-1图是表层净化的离散板，4-2图是表层未净化的离散板。图中黑色短棒长50μm。

图5是离散丝的滑动丝粘带分生孢子后，在离散板上滑动导致孢子散落在离散板面上的过程。图中，分生孢子a。5-1图是滑动丝与离散板开始接触之处，大量聚集的孢子脱离滑动丝散落在离散板上。5-2图是在滑动轨迹中孢子逐步稀散变少。5-3图是滑动轨迹中出现离散独立的单孢子。5-4图是与左右相邻孢子距离较远的独立单一孢子。图中黑色短棒长50μm。

图6是采用本发明的方法从标样1分离获得香蕉炭疽病菌单孢菌落的过程与结果。6-1图是标样1的香蕉炭疽病标样。6-2图是在一个培养皿平板上摆放3块小方块，各小方块上均载有从6-1图的香蕉炭疽病标样中分离出来的单一个分生孢子。6-3图是6-2图的分生孢子置于28℃培养2天后，萌发生长形成明显的小菌落。6-4图是6-3图的小菌落继续于28℃再培养1天后，生长成较大的菌落。图中黑色短棒长5mm。

图7是采用本发明的方法从标样1分离获得香蕉炭疽病菌单孢菌落的过程与结果。7-1图是标样1的香蕉炭疽病标样。7-2图是在一个培养皿平板上摆放3块小方块，各小方块上均载有从7-1图的香蕉炭疽病标样中分离出来的单一个分生孢子。7-3图是7-2图的分生孢子置于28℃培养2天后，萌发生长形成明显的小菌落。7-4图是7-3图的小菌落继续于28℃再培养1天后，生长成较大的菌落。图中黑色短棒长5mm。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明作进一步描述。

香蕉炭疽病菌可侵染香蕉的叶片与香蕉果实，在发病部位可形成香蕉炭疽病菌的分生孢子。本发明采用巧妙的手段从香蕉炭疽病标样上将单一个分生孢子分离出来，培养形成遗传组成单一的香蕉炭疽病菌纯培养。具体实施方式如下。

1.香蕉炭疽病标样的准备

香蕉炭疽病的危害部位包括叶片与香蕉果实，该病害普遍存在潜伏侵染现象。在未成熟的香蕉果实上通常看不到炭疽病的病斑，但将成熟的香蕉置于适宜的温度环境中放置，潜伏在果实组织中的炭疽病菌能快速生长、扩展为害导致病斑形成，并在病斑表面形成红色的分生孢子粘液。将田间采摘的果实进行成熟处理后，或者从市场上购取成熟的香蕉，置于28℃环境下保湿处理3～7天，多数香蕉果上能看到典型的炭疽病病斑和红色的孢子粘液。将具有炭疽病病斑和孢子粘液的香蕉果标样，备作分离香蕉炭疽病菌的标样。

2.孢子离散丝的制备

取出1000μl普通移液枪的枪头，将枪头的尖端放在火焰上灼烧，枪头尖端燃火处熔化，用酒精灯灭火罩等用具安全熄灭枪头上的燃火，用尖头镊子夹住一点熔化的枪头，轻轻拉长，至形成一根发丝状的细丝，冷却后剪去多余的细丝，保留约3cm长的细丝连在枪头上，即形成一支分离香蕉炭疽病菌孢子使用的孢子离散丝，该离散丝工具包括滑动丝a和丝柄b部分，如图1所示，这两部分天然连接成一体，关键技术作用是滑动丝a。滑动丝a细小、柔软且兼有弹性。

分离不同的标本使用时，可先用75％的酒精棉球擦拭滑动丝a作表面消毒，也可以重复前面的操作再烧制及拉伸新的滑动丝。

3.孢子离散板的制备

按如下方法制备。

先配制琼脂平板基质：

按照琼脂15.0g、水1000.0ml的配比，配制含有常规营养的琼脂基质。香蕉炭疽病菌的常规营养可以用马铃薯蔗糖(PS)培养基，按常规用量添加在琼脂基质中，常规高温高压灭菌后成为含有营养的琼脂平板基质。实际应用时，琼脂的使用量可依据从市面所购的琼脂质量而定，每升基质的琼脂用量可以在10.0g～15.0g变动，原则上是用量少、且冷凝后切割成小琼脂条时，小琼脂条仍具有较好的弹性为宜。

然后倒制表面净化的琼脂平板：

常规的琼脂培养基平板的琼脂含量为2.0g/升，按常规方式倒制的平板，显微镜下容易看到琼脂平板表层中的非熔杂质。发明人经过探索发现采取如下的制备技术，可以有效减少琼脂平板表层中的非熔杂质：将高温熔化倒制的平板保持热熔状态20分钟以上再冷凝。具体可以按如下操作：

用普通器具与材料组配形成一个保温装置，比如，将普通食品包装铁盒，罩盖在盛装热水的普通小钢盆上面，即获得一个有热度的铁盒面板(利用该铁盒面板放置培养皿)，再用一个塑料盆倒过来扣罩住铁盒与热水钢盆，并在塑料盆上面铺盖毛巾之类的保温材料，即能组配成一个适合本发明用的保温装置。

工作时先将普通小钢盆放置在无菌工作台上，将刚烧沸的热水倒入小钢盆，再罩上铁盒，将平底培养皿放置在铁盒面板上，扣罩塑料盆把培养皿预热5分钟，然后打开扣罩塑料盆，将已加热充分熔化的琼脂平板基质，趁热倒入预热的培养皿内，形成厚度约为1.0mm的薄层平板，罩回塑料盆并铺放保温材料，保持薄层平板处于热液状保温静置20分钟以上，热液状平板表层的非熔杂质可缓慢沉降到下层中，考虑到长时间高温造成热液状平板水分的过度蒸发，以及影响琼脂的凝固性能，保温时间宜控制在30分钟内。然后打开扣罩塑料盆，将液状薄层琼脂平板平稳转移到无菌工作台面冷却，冷凝后即获得表层净化的琼脂平板。

在后续步骤中该琼脂平板用来承载香蕉炭疽病标样的分生孢子，考虑到可能存在的细菌污染，可以在倒制平板前，按常规方式在琼脂基质中添加抗细菌药物，如链霉素等。

再将琼脂平板切割与装片形成孢子离散板：

用灭菌手术刀片将上述制备的琼脂平板切割成狭长的琼脂条块，可以切成宽度为3mm，长度为4～5cm的长条状琼脂块，再用手术刀片将该长条状琼脂块挑转到灭菌载玻片上，长条琼脂块长向沿着载玻片长向摆放，如图2所示，将该摆放好的长条琼脂块作为分散孢子用的离散板c。

4.分生孢子的离散

用酒精和无菌水按常规方式将制备好的孢子离散丝表面清洁和消毒，手执离散丝的丝柄b，将滑动丝a在已经产孢处置的香蕉炭疽病标样表面轻轻点触，滑动丝a表面能粘附许多分生孢子，将粘有孢子的滑动丝a转移到已备好的孢子离散板c，并贴放于离散板面的一端，然后拖拉滑动丝a沿着离散板面，向离散板c的另一端滑动，如图3所示，滑动丝a在离散板面的接触滑动，导致滑动丝a上粘附的孢子脱落并分散在离散板面上。

5.载有单孢子小方块的切取

将上述操作得到的载有孢子的离散板c，置于普通显微镜下观察，可见经过净化的离散板c，表面杂质明显减少，如图4所示，因而能显著提高对病菌或杂菌孢子识别判断的准确性。

通常在滑动丝a与离散板面首先接触之处，脱落大量的分生孢子，跟随滑动丝a滑动的轨迹观察，可见脱落到离散板面的孢子逐步稀散变少，并出现离散的单个孢子，继续沿着滑动丝轨迹寻找，能找到与左右相邻孢子间隔距离较远的独立单一孢子，如图5所示。通常一条离散板上能滑出1～5个远距离独立的单一孢子。

当移动显微镜的载物台，确认单一出现的孢子与左右相邻孢子距离较远时，用灭菌手术刀片将该单一孢子左右的离散板切断及移开，得到只载有独立一个分生孢子的小方块。

显微观察过程主要使用10倍物镜，必要时转换到40倍物镜观察细微特征，确认属于单一的香蕉炭疽病菌分生孢子。切割操作可以离开显微镜目镜，直接肉眼观察操作，无需显微操作。操作要领是：将显微镜台下的聚光光阑调小，并上下调节聚光模块，至肉眼可见光源聚集成一个小光点穿过载玻片上的离散板，该小光点直径约2mm，普通显微镜10倍物镜视野所覆盖实物的直径也是大约2mm，参比这两个参数来判断切割孢子离散板时的下刀位置，而且10倍物镜的镜头与观察物之间通常有1cm的距离，适合用尖头刀片(如23号手术刀片)的切割操作。切割后，可以返回显微镜目镜观察检查切割结果，包括下刀切割位置是否恰当，切割前后离散板上的孢子存在状况。

6.单孢子分离菌株的形成

用手术刀片将切出的载有单一分生孢子的小方块，转移到香蕉炭疽病菌的常规平板培养基(如马铃薯蔗糖琼脂PSA)上常规培养。考虑到可能出现细菌污染，培养基平板倒制时，可按常规添加抗细菌药物(如链霉素等)。分生孢子在小方块上正常萌发和生长，一般在28℃条件下培养2天后就能形成明显的小菌落，继续培养，菌落扩大形成较大的菌落。从单一菌落移植菌丝扩大繁殖，就获得香蕉炭疽病菌单孢子分离菌株。

实施例1

采用本发明一种香蕉炭疽病菌的分离方法，分离香蕉炭疽病标样1的香蕉炭疽病菌，分离培养结果如图6所示。

实施例2

采用本发明一种香蕉炭疽病菌的分离方法，分离香蕉炭疽病标样2的香蕉炭疽病菌，分离培养结果如图7所示。

Claims (1)

1.一种香蕉炭疽病菌（ Colletotrichum musae ） 的分离方法，其特征是，采用一种特制的孢子离散丝，直接从香蕉炭疽病标样中将单个分生孢子分离出来，培养形成一个遗传组成单一的香蕉炭疽病菌菌株，分离培养的操作步骤如下：

1)香蕉炭疽病标样的准备：将普通熟化处理的香蕉果实进行常规保湿培养，直至香蕉果上潜伏侵染的炭疽病发展成典型的病斑及孢子粘液，作为待分离病菌的香蕉炭疽病标样；

2)孢子离散丝的制备：取出1000μl普通移液枪的枪头，将枪头的尖端放在火焰上灼烧，枪头尖端燃火处熔化，安全熄火后，用尖头镊子夹住一点熔化的枪头，轻轻拉长，至形成一根发丝状的细丝，冷却后剪去多余的细丝，形成一支分离香蕉炭疽病菌分生孢子使用的孢子离散丝，该离散丝包括滑动丝(a)、丝柄(b)部分；

3)孢子离散板的制备：

①琼脂平板基质的制备：按照琼脂15g、水1000ml的配比，配制含有常规营养的琼脂基质，常规高温高压灭菌后，成为琼脂平板基质备用；

②琼脂平板的倒制与平板表层净化：将操作①制备的琼脂平板基质加热充分熔化，趁热倒入培养皿制成薄层平板，并将该热液状的平板置于能继续保持热液状的保温装置内，保温静置20分钟以上，然后将该静置的液状薄层平板，平稳转移到无菌工作台面，待液状薄层平板冷凝后，成为表层净化的琼脂平板；

③孢子离散板的切制与装片：用灭菌刀片将操作②制成的琼脂平板，切割成长条状的琼脂条块，该琼脂条块就是起分散孢子作用的离散板；用灭菌刀片将该离散板挑起装放到灭菌载玻片上，成为备待分散孢子用的离散板(c)；

4)分生孢子的离散：将步骤2)制备的孢子离散丝进行常规表面消毒和清洁，然后手执孢子离散丝的丝柄(b)，将滑动丝(a)的端部，在步骤1)准备的标样病斑表面轻轻点触孢子粘液而粘附分生孢子，将粘有孢子的滑动丝(a)转移到步骤3)准备的孢子离散板(c)的一端，并贴放于离散板面上，沿着离散板面滑移滑动丝(a)，滑动丝(a)在离散板面的相对滑动，导致滑动丝(a)上粘附的孢子脱开散落在离散板面上；

5)载有单孢子小方块的切取：将步骤4)得到的载有分生孢子的离散板(c)，置于显微镜下观察，沿着滑动丝(a)的滑动轨迹寻找离散的孢子，找出单一出现的孢子，选择与左右相邻孢子间隔距离远的单一孢子，用灭菌刀片将该单一孢子左右的离散板(c)切断及移开，得到只载有唯一1个分生孢子的小方块；

6)单孢子分离菌株的形成：用刀片将步骤5)切出的载有单一分生孢子的小方块，转移到香蕉炭疽病菌的常规培养基上，常规培养，直到孢子萌发生长形成单孢子菌落；移植单孢子菌落的菌丝扩大繁殖，形成香蕉炭疽病菌单孢子分离菌株。

Images