CN107446824B - 一种小麦白粉病菌的单孢分离方法 - Google Patents

一种小麦白粉病菌的单孢分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种小麦白粉病菌的单孢分离方法，属于植物病原专性寄生菌分离方法的应用技术领域。该方法包括：(1)采集田间小麦白粉菌病样，室内产孢备用；(2)电子氟化液制备孢子悬浮液；(3)悬浮液涂布、制作单孢菌碟；(4)挑取单孢菌碟并倒贴在小麦离体叶段上；(5)接种叶段放入光照培养箱培养10天以后，长出纯化的小麦白粉病菌菌落。该方法简便易行，并且能够以较高的成功率分离得到小麦白粉病菌单孢的纯培养，解决了传统真菌分离方法不适用于小麦白粉病菌单孢分离的问题。

Description

一种小麦白粉病菌的单孢分离方法
技术领域
本发明属于植物病原专性寄生菌分离方法的应用技术领域，具体涉及一种小麦白粉菌单孢分离方法。
背景技术
病原菌的单孢分离是真菌病害研究的基本技术，广泛应用于真菌的遗传变异、生理生化特性和菌种的纯化与保存工作中。目前常用的单孢分离方法有：琼脂平板稀释法(方中达.植病研究方法(3版).北京:中国农业出版社,1998:137-139.Choi Y W,Hyde K D,HoW H.Single spore isolation of fungi.Fungal Diversity,1999,3:29-38.)；印痕移取单孢子分离法(赵宁.印痕移取单孢子分离法.植物保护,1988,14(1):48-49.)；小玻片单孢子分离法(王国良.介绍一种改进的单孢分离技术－小玻片注射法.植物保护,1986,12(3):43.)；连续变倍体视显微镜单孢分离法(张书建,何月秋.介绍一种简单的真菌单孢子分离法.云南农业大学报,2003,18(3):315-316.)等。
由于小麦白粉病菌是一种专性寄生菌，需要从活体的寄主组织中获取必要的养分，无法在合成培养基上生长，上述方法并不适用于小麦白粉病菌的单孢分离。并且已有的文献资料中，一般是获得其“单孢子堆分离物”，这种肉眼可见的单孢子堆，不能排出其来自2-多个单孢子萌发而形成的“单”菌落，从而影响致病机理、单孢子测序等研究。因此，若要深入开展小麦白粉病菌机理的相关的研究，开发一种简便易行、成功率高的适用于此病菌的单孢分离方法迫在眉睫。
发明内容
针对现有技术中无有效的小麦白粉病菌单孢分离方法的技术现状，本发明的目的旨在于提供一种小麦白粉病菌的分离方法，确切的是提供一种小麦白粉病菌的单孢分离方法，该方法操作简便，而且能分离培养出纯化的小麦白粉病菌。
为实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究和不懈探索，最终获得了如下技术方案：一种小麦白粉病菌的单孢分离方法，包括下述步骤：
(1)将在田间采集的小麦白粉病病叶，放在冰盒中，吹去表面老孢子，放在含苯骈咪唑(50mg/L)的琼脂保鲜培养基上，17℃，18h光照，6小时黑暗光照培养箱中培养，繁殖新鲜的分生孢子；
(2)在超净工作台上收集步骤(1)的新鲜分生孢子，并用电子氟化液C5-18-全氟烷(FC-40)调制成浓度102个孢子/毫升孢子悬浮液，振荡器上振荡30秒混匀，备用；
(3)吸取100μl步骤(2)的孢子悬浮液，用涂布器均匀涂布到琼脂糖平板上，再用菌落打孔器(直径3mm)将琼脂糖平板打成均匀的菌碟；
(4)用解剖镜在步骤(3)涂布的琼脂糖平板上找到椭圆形的单个孢子，即单个白粉病菌分生孢子；
(5)将感病的对照品种Chanceller叶段平铺在装入保鲜培养基的培养皿上，用毫针挑出单孢子菌碟并倒贴接种在上述叶段上，然后将培养皿放入光照培养箱，培养10天以后，即长出纯化的小麦白粉病菌菌落。
优选地，如上所述的一种小麦白粉病菌的单孢分离方法，步骤(2)的新鲜分生孢子的收集方法为：将培养皿倒扣在硫酸纸上，轻轻用镊子敲打2-3次，将分生孢子收集到无菌离心管中，备用；
优选地，如上所述的一种小麦白粉病菌的单孢分离方法，步骤(3)的琼脂糖平板的琼脂培养基为：1000ml TAE+15g琼脂糖比例配制而成，其中TAE配制方法：24.2克Tris碱，5.71ml冰乙酸，10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容至1000ml。
优选地，如上所述的一种小麦白粉病菌的单孢分离方法，步骤(5)单孢子菌碟接种在感病叶段上时，与叶片接触共培养6小时以上。
本发明与传统方法比较，具有如下优点：
1、本发明首先筛选出能够快速挑取单孢子的孢子悬浮液浓度(102个孢子/毫升孢子悬浮液)，通过琼脂糖载体获得单个分生孢子的菌碟，菌碟倒贴接种在感病小麦Chanceller叶段上，单孢子菌碟与叶段接触共培养6小时以上，移去菌饼并将其放入光照培养箱，培养10天以后，叶段上长出纯化的小麦白粉病菌菌落，获得小麦白粉病菌纯性培养，此项分离技术的建立，为小麦白粉病菌致病机理和单孢子测序提供支撑。
2、该方法简便易行，并且能够以较高的成功率分离得到小麦白粉病菌单孢的纯培养，解决了传统真菌分离方法不适用于小麦白粉病菌单孢分离的问题。
附图说明
图1为1.5％的琼脂糖平板打成直径3mm菌碟图。
图2为正接和反接两种方式接种小麦离体叶段图，左边为倒贴即有单孢子的一面朝下，右边为正贴即有单孢子的一面朝上。
图3为不同方式接种结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步描述，但本发明的内容不仅仅局限于实施例所述的范围，凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
本发明中选用的所有原辅材料和用具、设备都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例1小麦白粉病菌的单孢子分离方法
(1)将在田间采集的小麦白粉病病叶，放在冰盒中，吹去表面老孢子，放在含苯骈咪唑(50mg/L)的琼脂保鲜培养基上，17℃，18h光照，6小时黑暗光照培养箱中培养，繁殖新鲜的分生孢子。
(2)在超净工作台上收集步骤(1)的新鲜分生孢子收集到离心管中，并用电子氟化液C5-18-全氟烷(FC-40)调制浓度为102个孢子/毫升。
(3)吸取100μl步骤(2)的孢子悬浮液，并用涂布器均匀涂布到1.5％琼脂糖平板上，再用菌落打孔器(直径3mm)将琼脂糖平板打成均匀的菌碟，见图1。
(4)用解剖镜在步骤(3)的琼脂糖平板上找到椭圆形的单个孢子，即单个小麦白粉病菌分生孢子。
(5)将感病的对照品种Chanceller叶段平铺在装有保鲜培养基的培养皿上，用毫针挑出单孢子菌碟并倒贴接种在上述叶段上，然后将培养皿放入光照培养箱，培养10天以后，即长出纯化的小麦白粉病菌菌落；其中单孢子菌碟与叶段共培养6h。
步骤(2)中102个孢子/毫升如下制备：将步骤(1)的培养皿倒扣在硫酸纸上，轻轻用镊子敲打2-3次，将分生孢子收集到无菌离心管中并称取1mg到1.5ml的离心管中，在离心管中加入1ml电子氟化液FC-40，在振荡器上振荡30秒备用。
步骤(3)中的琼脂糖培养基配置方法：1000ml TAE+15g琼脂糖比例配制而成；TAE配制方法：24.2克Tris碱，5.71ml冰乙酸，10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容至1000ml。
实施例2：不同孢子浓度挑取单孢子的效率
剪取预先准备好的感病品种“晋麦47”第一叶中断3cm长，挑选10片叶片正面朝上放在含苯骈咪唑(50mg/L)的琼脂保鲜培养基上，在超净台上收集预先初繁繁殖好的新鲜分生孢子到无菌5mL的离心管中，吸取4mL C5-18-全氟烷(FC-40)溶液到装有孢子粉的离心管中，制成接种体悬浮液。使用Vortex震荡器振荡30s使孢子在溶液中悬浮均匀，吸取10μL悬浮液在显微镜下用血球计数板调整孢子浓度分别为105、104、103、102和101个/mL，取100ul的孢子悬浮液，并用涂布器均匀涂布到1.5％琼脂糖平板上，等氟化液溶液挥发后，随机在平板上打孔。在100×显微镜下找出单孢子菌碟，并用黑色记号笔标记(方便挑取)。
挑取单孢试验过程中显示：105～103个/mL孢子浓度由于视野中孢子太多，挑取不到单孢子；101孢子太少，需要不断调动视野去寻找单孢，花费较多时间挑取效率不高；102个/mL孢子浓度刚刚合适，能够快速挑取单孢子菌碟。因此，在后续的试验中选择102个/mL孢子浓度建立单孢子分离技术体系。
实施例3：接种方式的筛选
按照实施例1接种小麦离体叶段，分别采用倒贴、正贴菌碟两种方式接种(图2)，结果见图3。由图3可知，倒贴(含有孢子的一面)菌碟可以成功发病，正贴(不含孢子一面)菌碟不能形成菌落，接种不成功，因此，在本单孢分离技术体系中均采用倒贴方式。
实施例4：单孢子菌碟和叶段处理时间
按照实施例1接种小麦离体叶段，分别在4、6小时移走菌碟，结果表明，菌碟和叶段共同培养6小时，在接种点形成菌落；共同培养4小时，在接种点没有形成菌落。同时，在Chanceller品种25片离体叶段上的50个接种点，有40个接种点形成菌落，即用此方法获得小麦白粉病菌单孢纯培养的成功率可达80％。
实施例5：不同培养基接种效果
按照实施例1接种小麦离体叶段，分别采用琼脂糖(1.5％)和水琼脂(1.5％)培养基，作为单孢子载体培养基。结果显示，琼脂糖和水琼脂两种孢子载体培养基均能成功引起发病，但是由于水琼脂培养基相对于琼脂糖培养基较软，不利于挑取。因此，在后续的单孢子分离技术体系均采用琼脂糖(1.5％)培养基。

Claims (2)

1.一种小麦白粉病菌的单孢分离方法，其特征在于：该分离方法包括下述步骤：
(1)将采集的小麦白粉病病叶吹去表面老孢子，放入含保鲜培养基的培养皿中，17℃，18h光照，6h黑暗交替培养，繁殖新鲜的分生孢子；
(2)在超净工作台上收集步骤(1)的新鲜分生孢子，并用电子氟化液调制浓度为102个孢子/毫升的悬浮液，振荡器上振荡30秒混匀，备用；
所述电子氟化液为C5-18-全氟烷；
(3)吸取步骤(2)的孢子悬浮液，用涂布器均匀涂布到琼脂糖平板上，再用菌落打孔器将平板打成均匀的菌碟；
所述琼脂糖平板的培养基为1000ml TAE+15g琼脂糖；
所述TAE配制方法：24.2克Tris碱，5.71ml冰乙酸，10ml 0.5mol/L EDTA，所述EDTA的pH为8.0，定容至1000ml；
(4)用解剖镜在步骤(3)的菌饼上找到椭圆形的单个孢子，即单个白粉病菌单孢子菌碟；
(5)将感病的对照品种Chanceller叶段平铺在装有保鲜培养基的培养皿上，用毫针挑出步骤(4)的单孢子菌碟并倒贴接种在上述叶段上，然后将培养皿放入光照培养箱，培养10天以后，长出纯化的小麦白粉病菌菌落。
2.如权利要求1所述的一种小麦白粉病菌的单孢分离方法，其特征在于：步骤(5)的单孢子菌碟接种在感病叶段上时，与叶片接触时间6小时以上。
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