CN108641962B - 一种提高小麦白粉菌离体保存时间的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高小麦白粉菌离体保存时间的方法，属于植物病原专性寄生菌保存方法的应用技术领域。小麦白粉菌是植物病原专性寄生菌，需要小麦叶片寄主的存在才能存活，发明人虽发现了一种不需要寄主可以离体保存小麦白粉菌的方法，但该方法存在保存时间短，需要收集大量分生孢子等缺点；本发明在此基础上改变了菌株复活接种方式，使用全氟烷溶液悬浮离体保存的小麦白粉菌孢子，使小麦白粉菌孢子的离体保存时间比原方法提高6倍，由1年延长至6年，且所需孢子质量减少4倍。本方法克服了现有方法中存在的不足，可充分保证小麦白粉病原菌相关研究工作的顺利开展。
Description
技术领域
本发明属于植物病原专性寄生菌保存方法的应用技术领域，具体涉及一种提高小麦白粉菌离体保存时间的方法。
背景技术
小麦白粉病是由白粉菌(Blumeriagraminisf.sp.tritici,Bgt)引起的真菌病害，其病原菌是专化型的活体寄生菌，不能在人工培养基上生长，病菌的繁殖转接均需在小麦活体幼苗上每隔10天左右进行一次；此外，小麦白粉病菌分生孢子的繁殖收集耗时长，工作量大，另一方面往往会产生交互污染，致使特定致病性菌株的丢失。因此，建立长期保存方法可用于病菌种群遗传多样性、分子抗药性监测等研究。
近年，对于白粉病菌的离体长期保存也开展了一些相关研究，如喻大昭等在“一种小麦白粉病菌菌株的长期保存方法(CN201310180918.4)”的专利中公开，采用硅胶干燥、低温冷冻保存方法，可以长期保存1年，但是该方法存在两个明显的不足：1)保存的时间较短，仅可保存1年；2)需要的分子孢子的质量较多(20mg)，收集分生孢子耗费较多的工作量。龚双军等在“一种小麦白粉菌喷雾接种方法(申请号：201710716834.6)中公开，采用C5-18-全氟烷(FC-40)溶液能够使小麦白粉病菌分子孢子喷雾接种更均匀，进行精确定量的接种；同时，该发明中也指出，由于使用无菌水配制白粉菌孢子悬浮液，小麦白粉菌的分生孢子在6-8h内可保持外形不变，10h后会因吸水而胀裂而死亡，而该方法采用电子氟化液作为悬浮孢子的载体，在悬浮液中分子孢子的形态和发芽率可以保持在12h，最长可以达到24h。但该发明中并未发现电子氟化液可以延长小麦白粉病菌分生孢子的离体保存时间。
本发明与“一种小麦白粉菌喷雾接种方法(申请号：201710716834.6)是两种截然不同的试验技术方法，一种是菌种保存方法，另一种是菌种接种方法。本发明人也是两种发明方法的实际操作人，本发明人创造性的将两种方法结合起来，达到了1+1＞2的效果，结合这两种方法，可显著提高小麦白粉菌离体保存方法的时间，由1年延长至6年以上，同时，使用孢子量减少了4倍。
发明内容
针对常规保存方法时间短，需要大量的分子孢子等缺点，本发明主要寻找一种能够延长保存时间，减少孢子量的保存方法。本发明使用C5-18-全氟烷(FC-40)悬浮离体长期保存的小麦白粉菌孢子(即改变了菌株复活接种方式)，使小麦白粉菌孢子的离体保存时间比常规方法提高6倍以上，由1年延长至6年以上，且所需孢子质量减少4倍。
为实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究和不懈探索，最终获得了如下技术方案：一种提高小麦白粉菌离体保存时间的方法，该方法包括如下步骤：
(1)分生孢子的收集及硅胶干燥：将预先培养好的小麦白粉菌培养皿倒扣在硫酸纸上，轻轻用镊子敲打2-3次，将分生孢子收集到无菌离心管中，将3-4块的硅胶颗粒置于离心管中，置于23℃下干燥5h，密封后再置于-70℃超低温冰箱保存；
(2)菌株的复活接种：从-70℃超低温冰箱取出步骤(1)中保存的离心管，移去离心管中的硅胶颗粒，用C5-18-全氟烷(FC-40)悬浮孢子粉，制成接种体悬浮液，使用震荡器振荡15s，使孢子在溶液中悬浮均匀，最后用毛笔将孢子悬浮液均匀的涂抹到叶片上；
优选地，如上所述的一种提高小麦白粉菌离体保存时间的方法，其特征在于：步骤(1)中收集的小麦白粉菌分生孢子质量最少为5mg。
优选地，如上所述的一种提高小麦白粉菌离体保存时间的方法，其特征在于：步骤(2)中C5-18-全氟烷(FC-40)的用量为：可充分悬浮步骤(1)中冻存的分生孢子粉。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：1、本发明使用C5-18-全氟烷(FC-40)悬浮离体长期保存的小麦白粉菌孢子，改变了菌株复活接种方式(常规方法使用水悬浮冻存的分生孢子粉)，保存时间可以长达6年以上，所需的分生孢子质量降低到5mg，极大的节约了劳动力，提高了工作效率。
2、本方法适宜小麦白粉菌的菌种保藏，抗性鉴定，特殊的生物学菌种保存，可以在小麦白粉病抗性鉴定与育种单位中推广应用。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步描述，但本发明的内容不仅仅局限于实施例所述的范围，凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
实施例1改进方法中分生孢子质量对保存效果的影响
按照本发明方法进行不同分生孢子质量下菌株复活率的比较，共计保存20个菌株，保存时间分别为1年，以常规方法保存作为对照。通过致病力检测表明，改进方法中孢子量为5mg时菌株的复活率为100％；分生孢子量为2.5mg时，菌株的复活率为60％，而常规方法中孢子质量为20mg时菌株的复活率为100％；分生孢子量为5.0mg时，菌株的复活率为0％，具体结果表1。
表1不同分生孢子质量下菌株复活率的比较
实施例2改进方法保存时间效果
比较常规和本发明方法对小麦白粉病菌离体冻存分生孢子的复活率：共计保存20个菌株，保存时间分别为1，3和6年，以常规方法保存作为对照，将不同保存时间的小麦白粉病菌分生孢子分别使用水进行悬浮(常规方法保存)、使用C5-18-全氟烷(FC-40)悬浮，最后将小麦白粉病菌孢子悬浮液分别喷雾接种到小麦叶片上，调查发病情况。其中使用水进行悬浮(常规方法保存)的分生孢子粉质量为20mg、使用C5-18-全氟烷(FC-40)悬浮的分生孢子粉质量为5mg。
通过致病力检测表明，常规方法(使用水悬浮离体保存的孢子，抖粉或吹接法)保存为1年，保存3年时菌株的存活率仅为20％，而本发明方法菌株能够存活至少6年以上，菌株的复活率为100％，具体结果表2。
表2不同保存时间下小麦白粉菌株存活率的比较
Claims (2)
1.一种提高小麦白粉菌离体保存时间的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
(1)分生孢子的收集及硅胶干燥：将预先培养好的小麦白粉菌培养皿倒扣在硫酸纸上，用镊子敲打2-3次，将分生孢子收集到无菌离心管中，将3-4块的硅胶颗粒置于离心管中，置于23℃下干燥5h，密封后置于-70℃超低温冰箱保存；
(2)菌株的复活接种：从-70℃超低温冰箱中取出步骤(1)保存的离心管，移去离心管中的硅胶颗粒，用C5-18-全氟烷悬浮分生孢子粉，制成接种体悬浮液，使用震荡器振荡15s，使孢子在溶液中悬浮均匀，最后用毛笔将孢子悬浮液均匀的涂抹到叶片上。
2.如权利要求1所述的一种提高小麦白粉菌离体保存时间的方法，其特征在于：步骤(1)中收集的小麦白粉菌分生孢子质量最少为5mg。
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