CN102925405B - 一种淡紫拟青霉孢子粉的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种淡紫拟青霉孢子粉的制备方法，包括以下步骤：(1)制备淡紫拟青霉(Paecilomyces.lilacinus)液体发酵液；(2)从淡紫拟青霉液体发酵液中回收分生孢子；(3)干燥所回收的淡紫拟青霉分生孢子，即得。本发明对制备淡紫拟青霉孢子粉的各工艺参数进行了筛选和优化，获得最适宜的制备工艺参数，有效提高了淡紫拟青霉孢子的收率和产品质量。本发明淡紫拟青霉孢子粉的制备方法具有回收率高、含孢量高、活孢率高和含水量低等优点，符合规模化工业生产的要求。

Description

一种淡紫拟青霉孢子粉的制备方法

技术领域

本发明涉及一种真菌孢子粉的制备方法，尤其涉及淡紫拟青霉(Paecilomyces.lilacinus)孢子粉的制备方法，属于淡紫拟青霉孢子粉的生产领域。

背景技术

淡紫拟青霉(P.lilacinus)属于内寄生性真菌，是一些植物寄生线虫的重要天敌，能够寄生于卵，也能侵染幼虫和雌虫，可明显减轻多种作物根结线虫、胞囊线虫、茎线虫等植物线虫病的危害。

植物寄生线虫为除真菌之外的第二大类作物病原物，其分布广泛，可寄生并危害多种农作物。根结线虫是一类植物专性寄生病原物，目前生产上使用的杀线剂大都为高毒化学农药，毒性高，既影响人类身体健康，又对环境造成潜在威胁。与传统的用化学药剂杀灭病虫害相比，生物防治无环境污染，无药物残留，对人畜安全，有利于保护物种的多样性和生态环境的可持续发展(T homason I.J.Challenges facing nematology:Environmental risks with nematicides and the need for new approaches.Veech,J.A.and Dickson,D.W.Vistas on Nematology.Hyattsville:Societyof Nematologists.1987.469-476.)。

淡紫拟青霉生物农药菌剂是新型纯微生物活孢子制剂，其主要由淡紫拟青霉活孢子与一定的农药辅料或载体制备而成，具有高效、广谱、长效、安全、无污染、无残留等特点，可明显刺激植物生长。试验证明，在植物根系周围施用淡紫拟青霉生物农药菌剂不仅能明显抑制线虫侵染，而且能促进植物根系及植株营养器官的生长。

淡紫拟青霉生物农药菌剂的质量主要以产生孢子数量为主要的考核指标，现有的淡紫拟青霉孢子粉的制备方法均不同程度的存在着回收率低、活孢子数量较低等缺陷，有待改进。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种新的淡紫拟青霉孢子粉的制备方法，该方法具有淡紫拟青霉孢子粉回收率高、孢子质量好等优点，适宜于进行规模化工业生产。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种淡紫拟青霉(P.lilacinus)孢子粉的制备方法，包括：(1)制备淡紫拟青霉液体发酵液；(2)从淡紫拟青霉液体发酵液中回收分生孢子产物；(3)干燥所回收的淡紫拟青霉分生孢子产物，即得。

淡紫拟青霉液体发酵液的制备方法已在各种文献中公开(例如：周靖等.淡紫拟青霉(P.lilacinus)培养条件的优化.微生物学杂志.2007年3月第27卷第2期.45-48；毛成利等，淡紫拟青霉的研究开发.化学工程师.2004年7月.63-64.)，本领域所属技术人员可按照文献中所公开的各种方法制备得到淡紫拟青霉液体发酵液；例如，采用三级培养方法，即：种子培养、二级液体扩大培养和液体发酵培养，制备得到淡紫拟青霉菌发酵液；其中，在液体发酵培养时，可以采用发酵罐发酵或采用摇瓶培养的方式进行发酵培养。三级培养所用到的培养基及其培养条件均已在文献中公开，作为参考，其中，所述的液体发酵培养基的组成成分包括碳源和氮源；所述的碳源包括但不限于葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉或玉米粉中的任一种或多种。所述的氮源包括但不限于硝酸钠、硫酸铵、蛋白胨或黄豆粉中的任一种或多种。

淡紫拟青霉在24℃-30℃范围内均能生长产孢，所以在制备淡紫拟青霉液体发酵液的各个培养过程中，各个阶段的培养温度可以是24℃-30℃。

在发酵培养过程摇床转速可以为80-250r/min，当摇床转速为220r/min时，产孢量会达到最高。液体发酵培养基的初始pH值为3-9时均能产孢；当初始pH值为5.0-5.5时，淡紫拟青霉的孢子产量相对较高；当液体发酵培养基的初始p H值是5.0时，淡紫拟青霉的产孢量达到最高。发酵罐的罐压可以为0.6-0.8Mpa；在用发酵罐或摇瓶进行发酵培养时，其通氧量可以是50-300L/h。

本发明所用到的淡紫拟青霉菌种可通过商业途径购买得到。

淡紫拟青霉液体深层发酵产生的分生孢子最终加工成产品必须得到高孢粉，所以必须从液体发酵产物中回收孢子并将其进行干燥，最终得到活孢子粉。至于如何从液体发酵产物中回收孢子，可以采用诸如离心或过滤等方法从淡紫拟青霉液体发酵产物中回收孢子。在采用离心的方法从液体发酵产物中回收孢子时，离心力、离心时间以及所加入的絮凝剂的种类及用量等对于孢子的回收率及其质量高低(例如纯度、存活率)等有非常显著的影响。为了最大限度的提高孢子的回收率及其质量，本发明对离心力、离心时间以及絮凝剂的种类和用量等工艺参数进行了大量的试验以摸索出最适宜的参数；通过大量的筛选试验最终发现，采用下述离心条件能够最大限度的提高孢子的回收率及其质量：

相对离心力优选为2000-6000g，最优选为4000g；离心时间优选为30-50min，最优选为30min。

此外，本发明通过实验发现，发酵液中加入絮凝剂后可显著提高发酵液中孢子的回收率，最高者可以达到98.8％。本发明通过进一步的实验发现，选用KAI(SO₄)₂作为孢子回收中的絮凝剂，既能保证回收效果，又能有效降低成本生产。

本发明通过正交实验和方差分析发现，离心力、离心时间以及絮凝剂三个因素对孢子回收的影响如下：离心时间>离心力>絮凝剂。通过筛选试验，本发明最终发现将离心力、离心时间以及絮凝剂三个因素按照以下参数组合在一起能够非常显著的提高孢子的回收率及其质量：每100mL发酵液加入2.5g絮凝剂，相对离心力为4000g，离心时间为30min。

本发明中所述的″干燥”方式可以是真空冷冻干燥、阴干或加热烘干等方式；其中，采用阴干或加热烘干的方式干燥孢子时，将待干燥的孢子液(所述的孢子液可以是直接发酵液，也可以是将发酵液浓缩后所得到的浓缩菌浆等)优选用吸附载体进行吸附，再将吸附有孢子液的吸附载体进行自然干燥(即阴干)或进行加热烘干。

本发明考察了不同的吸附载体对于分生孢子吸附效果的影响。考察实验结果表明，木屑的吸附量(4g/ml)最大，硅藻土的吸附量(2ml/g)大于高岭土(<1mg/ml)。考虑到后期需要将制备的孢子粉加工成可湿性粉剂或颗粒剂，本发明优选采用硅藻土作为载体来对孢子进行干燥。

采用“加热烘干”这一干燥方式干燥吸附有孢子粉的吸附载体，虽然所得到的载体(含孢子)含水量较低(明显低于阴干干燥方式)，但是采用烘箱烘干方式对活孢子的损坏量较大，且能耗大、成本高，而采用阴干的干燥方式虽然活孢量有所增加，但需要较长的时间进行干燥，导致生产周期过长。本发明通过实验发现，控制干燥时间使得干燥后的载体和孢子含水量处于10％的左右时，活孢量较高，可以达到10⁹个/g。本发明通过筛选实验最终确定，采用阴干干燥孢子发酵液这一种方式，尤其是将所回收的淡紫拟青霉分生孢子回收离心后得到的浓缩菌浆用吸附载体吸附后再进行阴干干燥可以得到含孢量更高的孢子混合体。通过浓缩菌浆与载体的配合比例(体积：质量)以及干燥时间等因素进行综合考察，最终发现采用下述参数对孢子液进行阴干，孢子的存活率为最高：浓缩菌浆和载体硅藻土的比例为1∶1(体积∶质量)，干燥时间为48h。

在对孢子进行加热烘干时，加热温度及加热时间对于孢子的存活率有非常显著的影响。本发明发现，如果采用较低的温度进行干燥，虽然活孢含量较高，但是干燥时间会明显过长且含水量不符合标准(一般规定要含水量要低于10％)；若采用较高的温度进行干燥，孢子的存活率将显著降低，此外，采用较高的干燥温度并不会使孢子粉含水量有效下降。如果干燥时间过短，最终孢子产品的含水量将会过高，而含水量过高的后果是直接造成孢子质量的显著降低；如果干燥时间过长，孢子的存活率将严重下降并严重降低生产效率。为了提高孢子的存活率并兼顾生产效能，本发明对加热温度及加热时间进行了综合考察，最终发现，当烘干温度为35℃、烘干时间为15小时，所制备的孢子产物的活孢量较高且含水量较低，在有效提高孢子粉质量的同时兼顾了生产效能。

本发明对淡紫拟青霉孢子粉的制备方法中的各工艺参数进行了优化和筛选，最终筛选到最适宜的工艺参数，有效提高了淡紫拟青霉孢子的收率和产品质量。本发明制备淡紫拟青霉孢子粉的方法具有孢子回收率高、含孢量高、活孢率高、孢子粉含水量低等优点，符合规模化工业生产的要求。

附图说明

图1  不同絮凝剂对发酵产物-孢子回收的影响(P<0.05)。

图2  30℃干燥时载体加孢子含水量变化曲线。

图3  35℃干燥时载体加孢子含水量变化曲线。

图4  40℃干燥时载体加孢子含水量变化曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

生物材料

淡紫拟青霉(P.lilacinus)菌株购自中国林业微生物菌种保藏管理中心，菌种商业购买编号为：cfcc 86080。

实施例1淡紫拟青霉(P.lilacinus)发酵液的制备

1、将淡紫拟青霉菌种活化后，进行摇瓶种子培养；

摇瓶种子培养培养基的组成(按质量百分比计)：

液体发酵条件：500ml三角瓶中装入种子培养基200ml，高压灭菌后接种淡紫拟青霉孢子悬浮液，接种量为1.5-3％，置于24-28℃，摇床150-200r/min，培养18-36h。

2、二级液体扩大培养：

二级液体扩大培养的培养基组成(按质量百分比计)：

将上述二级液体扩大培养基发酵罐中在位灭菌；

液体发酵条件：发酵温度25-28℃，罐压0.6-0.8bar，其通氧量可以是100-300L/h，转速150-250rpm，起始pH值5.5-6.0。

3、液体发酵培养：

液体发酵培养的培养基组成(按质量百分比计)：

将上述液体培养基发酵罐中在位灭菌；

液体发酵条件：发酵温度为28-30℃，其通氧量是100-300L/h，前24h，通气量控制在100-150L/h，后期控制在250-300L/h；起始pH：5.0-6.0；转速：150-200r/min；罐压：0.6-0.8Mpa，发酵周期控制在6d，一般镜检孢子浓度达到10⁹个/ml以上即可。

试验例2从淡紫拟青霉液体发酵液中回收孢子的工艺参数优化试验

淡紫拟青霉液体深层发酵产生的分生孢子最终加工成产品必须得到高孢粉，所以发酵产物必须沉淀干燥。本试验采用离心方法回收淡紫拟青霉液体发酵液代谢产物，本实验考查了影响离心沉淀的主要因素，即：絮凝剂、离心力和离心时间以摸索出最适宜的参数。

1不同的絮凝剂对孢子回收的影响

在离心之前分别在淡紫拟青霉液体深层发酵得到发酵液中加入Al₂(SO₄)₃，KAI(SO₄)₂或FeCl₃等絮凝剂，加入量为0.5g/100mL发酵液，设定相对离心力为3000g，离心时间为30min。通过测定发酵液，离心沉淀和离心后上清液中的孢子含量来计算孢子回收率。

由图1可以看出，发酵液中加入絮凝剂后，可以提高发酵液中孢子的回收率，高者可以达到98.8％。通过方差分析表明(表1)，絮凝剂对淡紫拟青霉孢子回收的影响是极显著(P<0.01)。本发明通过综合考虑回收效果及生产成本等多种因素，最终确定KAI(SO₄)₂作为离心时的絮凝剂最适宜，既能保证回收效果，又能有效降低成本生产。

表1  絮凝剂ANOVA分析表

	平方和	Df	均方	F	Sig.
						组间	51.227	3	17.076	11.272	.003
组内	12.119	8	1.515
						总计	63.345	11

2正交试验筛选出絮凝剂、相对离心力和离心时间最佳组合

设计絮凝剂、相对离心力和离心时间三因素三水平正交试验，因素水平表如下表2，试验表如下表3。

表2  正交试验因素与水平安排表

表3  正交试验表

表4  正交实验结果表

由以上正交实验直观分析得出，三个因素对孢子回收影响如下：离心时间>离心力>絮凝剂。筛选得出最佳组合为：A₂B₂C₃，即从直观分析来看，最佳回收率的组合为：絮凝剂2.5g，相对离心力为4000g，离心时间为40min。

正交试验经方差分析表明，离心时间和离心力对孢子回收率影响极显著(P<0.05)，而絮凝剂的浓度对孢子回收率影响不显著(P<0.05)。其中随着离心时间的增加，回收率显著提高。对离心时间的三个梯度进行LSD多重比较，结果表明，离心时间20min与30min和40min相差均为极显著(P<0.05)，离心时间30mi n与40mi n相差不显著(P<0.05)。因此在不影响回收率的前提下，为了尽量节约时间、降低生产成本，本发明确定离心时间为30min最为适宜。

表5  正交实验方差分析结果

随着相对离心力的增加，淡紫拟青霉孢子的回收率显著提高，当相对离心力达到4000g时，孢子回收率达到最高，相对离心力提高到6000g时，孢子回收率反而有所下降。通过LSD多重比较分析表明，离心力2000g和离心力4000g相差为显著(P<0.05)，离心力4000g与6000g相差不显著(P<0.05)，在不影响回收率的前提下，本发明确定离心力为4000g最为适宜。

有上述方差分析和多重比较分析得出在离心时采用下述的条件或参数为最佳的孢子回收组合为，即：相对离心力为4000g，离心时间为30min，絮凝剂2.0g/100ml发酵液。

试验例2孢子干燥的工艺参数优化试验

试验过程中采用两种干燥方式，将淡紫拟青霉发酵液(未经过离心或过滤处理的淡紫拟青霉液体发酵产物)或发酵浓缩菌浆(将淡紫拟青霉发酵液经过浓缩(例如：离心或过滤处理后)得到的浓缩菌浆)加入到载体中阴干或在烘箱中加热烘干。

试验方法：将淡紫拟青霉发酵液和发酵浓缩菌浆分别加入到不同载体中，测定三种载体的吸附量。然后采用不同的干燥方法，进行干燥含有孢子的载体，以筛选出最适宜的孢子干燥载体。

前期试验结果表明，木屑的吸附量(4g/ml)最大，硅藻土的吸附量(2ml/g)大于高岭土(<1mg/ml)。由于后期需要将孢子粉加工成可湿性粉剂或颗粒剂，所以本发明采用硅藻土作为载体来吸附孢子进行干燥。

试验结果发现，采用烘箱干燥方法进行干燥，得到的载体(含孢子)含水量较低(明显低于阴干干燥方式)，但是采用烘箱烘干方式，对孢子的损坏量较大，而且能耗大，成本高。采用阴干方式来烘干时，虽然活孢量有所增加，但是需要较长的时间，试验周期过长。

通过实验结果可以看出，控制干燥时间使得干燥后的载体和孢子含水量处于10％的左右时，活孢量较高，一般均为10⁹个/g。进一步的试验发现，采用发酵浓缩菌浆加吸附载体可以得到含孢量更高的载体孢子混合体。

通过表6的实验数据可见，采用下述方式干燥孢子，不仅活孢量最高、含水量较为适宜且成本较低：发酵浓缩菌浆：硅藻土(体积∶质量)=1∶1，阴干干燥，干燥时间为48h。

表6  孢子加入载体中干燥实验结果

注：1、烘箱烘干时的烘干温度为35℃；2、阴干干燥的时间为48小时左右，烘干的时间为20小时左右。

1.2加热烘干发酵产物的最适温度的筛选试验

从试验结果来看(图2-图4，表7-11)，如果采用30℃进行干燥，虽然含活孢量较高，但是干燥时间明显过长且含水量不符合标准(一般规定孢子含水量要小于10％)(图2)。若采用40℃来进行干燥，明显地影响孢子的存活，且含水量并不比采用35℃干燥得到的含水量低(图4)。本发明优选采用35℃对淡紫拟青霉进行干燥比较合适，含水量较低且活孢量可达到107，干燥时间比30℃减少了一半多(图3)。进一步的试验发现，采用35℃干燥15小时为加热烘干的最适宜的干燥条件，不仅孢子含水量较低，孢子的存活率也较高，兼顾了干燥效果和干燥效率。

表7  30℃干燥过程中含水量变化的方差分析结果

表8  35℃干燥过程中含水量变化的方差分析结果

35℃	平方和	df	均方	F	Sig.
						组间	7674.870	3	2558.290	2545.360	.000
组内	8.041	8	1.005
						总计	7682.911	11

表9  40℃干燥过程中含水量变化的方差分析结果

40℃	平方和	Df	均方	F	Sig.
						组间	9603.155	5	1920.631	2786.817	.000
组内	8.270	12	0.689
						总计	9611.425	17

表10  各种温度干燥过程中含孢量的变化

表11  不同干燥方法对淡紫拟青霉干燥含水量和含孢量的影响

干燥温度（℃）	干燥时间（h）	含水量（%）	含孢量（109/g）
				30	15	13.84±1.472	3.249±0.684
35	15	1.258±0.543	1.83±0.965
				40	15	1.142±0.049	0.142±0.193

Claims (3)

1.一种淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)孢子粉的制备方法，包括：(1)制备淡紫拟青霉液体发酵液；(2)采用离心的方法从淡紫拟青霉液体发酵液中回收分生孢子产物；所述离心在相对离心力为2000-6000g、离心时间为30-50min的条件下进行离心；在离心时向发酵液中加入絮凝剂KAl(SO₄)₂，絮凝剂的加入量是每100毫升发酵液中加入2.0g絮凝剂；(3)干燥所回收的淡紫拟青霉分生孢子产物，即得；所述的干燥方式是阴干或烘干；所述的阴干干燥是将所回收的分生孢子产物浓缩后得到发酵浓缩菌浆，将发酵浓缩菌浆用吸附载体吸附后进行自然干燥；按体积：质量比计，发酵浓缩菌浆与吸附载体的比例是1:1；所述阴干干燥的时间为48h；所述的吸附载体是硅藻土；

所述的烘干干燥是将回收孢子产物用载体吸附后进行加热干燥；所述的加热干燥的温度为35℃、干燥时间为15小时，所述的载体是硅藻土。

2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述离心在相对离心力为4000g的条件下进行离心。

3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述离心时间为30min。