CN102986737B

CN102986737B - 线虫卵寄生真菌和孢子萌发促进剂的复配制剂和应用

Info

Publication number: CN102986737B
Application number: CN201210424889.7A
Authority: CN
Inventors: 王曦茁; 汪来发; 郭志斌; 马建伟; 朴春根; 李永
Original assignee: Research Institute of Forest Ecology Environment and Protection of Chinese Academy of Forestry
Current assignee: Research Institute of Forest Ecology Environment and Protection of Chinese Academy of Forestry
Priority date: 2012-05-30
Filing date: 2012-10-30
Publication date: 2014-08-27
Anticipated expiration: 2032-10-30
Also published as: CN102986737A

Abstract

本发明公开了一种线虫卵寄生真菌和孢子萌发促进剂复配菌剂及其制备方法和应用。所述真菌和孢子萌发促进剂复配菌剂包括：淡紫拟青霉孢子粉或发酵液、孢子萌发促进剂。本发明采用正交试验获得能够促进淡紫拟青霉孢子萌发的各种营养物质的最佳组合，并通过室内生测实验验证了其促进淡紫拟青霉孢子萌发及防治根结线虫的生防效果。本发明复配菌剂作用于根结线虫5天，对于根结线虫卵寄生率就可达80%以上，根结线虫卵孵化率几乎为零，明显优于对照组。实验结果证明本发明复配菌剂中所添加的孢子萌发促进剂能够有效促进孢子萌发从而提高了淡紫拟青霉对根结线虫卵的寄生率并缩短了作用时间，最终显著提高了对植物根结线虫的防治效果。

Description

线虫卵寄生真菌和孢子萌发促进剂的复配制剂和应用

技术领域

本发明涉及一种生物农药制剂，尤其涉及一种线虫卵寄生真菌和孢子萌发促进剂的的生物农药复配制剂，本发明还涉及该生物农药复配制剂的制备方法及其在防治根结线虫中的应用，属于植物寄生线虫的生物防治领域。

背景技术

淡紫拟青霉(P.lilacinus)是一种土壤及多种植物根围的习居菌，对南方根结线虫的寄生率很高，可达80%以上。现已认为淡紫拟青霉是一种非常重要的植物寄生线虫卵寄生真菌，目前已广泛应用于防治根结线虫、胞囊线虫等有害植物寄生线虫。作为防治植物病原线虫的重要生防菌之一，淡紫拟青霉孢子快速萌发可直接影响菌株对寄主的致病力，并且可以大量地减少根结线虫卵的孵化。

迄今为止，世界上已经有了多种以淡紫拟青霉分生孢子为主要有效成分的杀线制剂，其中包括可湿性粉剂、颗粒剂及其微胶囊菌剂等。虽然淡紫拟青霉对根结线虫卵寄生效果很高，实际应用也较多，但是对根结线虫卵后期和二龄幼虫的寄生效果很差，而且研究发现其代谢产物还有助于根结线虫卵的孵化。由于孢子萌发和菌丝生长均需一定的营养物质，而撒施在土壤中的孢子较难迅速从土壤或寄主获得其萌发所需的营养，从而有可能增加孢子萌发和侵入卵所需的时间，而添加孢子萌发促进剂可起到补充营养的作用，促进淡紫拟青霉分生孢子快速侵入根结线虫卵，提高杀线效果。因此，筛选能够促进淡紫拟青霉分生孢子萌发的刺激物（简称孢子萌发促进剂），将其加入到孢子制剂当中，以便在淡紫拟青霉分生孢子接触卵后能够迅速萌发和侵入，减少卵的孵化，可增强孢子制剂防治植物根结线虫的效果。

发明内容

本发明目的之一是提供一种孢子萌发率高、作用时间短、卵寄生率高、能够有效抑制根结线虫卵孵化的真菌和孢子萌发促进剂的复配制剂；

本发明目的之二是提供一种制备所述真菌和孢子萌发促进剂的复配制剂的方法；

本发明目的之三是提供将所制备的真菌和孢子萌发促进剂的复配制剂应用于防治植物根结线虫；

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种孢子萌发率高、能够有效抑制根结线虫卵孵化的真菌和孢子萌发促进剂复配制剂，包括：淡紫拟青霉孢子粉或孢子发酵液、孢子萌发促进剂；其中，所述的孢子萌发促进剂选自维生素B1、糖类物质、氨基酸大分子或有机氮源中的一种或一种以上；

优选的，所述的糖类物质是蔗糖、D-山梨醇、麦芽糖或肌醇；所述氨基酸为L-丙氨酸、L-谷氨酸或L-天冬酰胺；所述的大分子有机氮源为蛋白胨或牛肉膏。

本发明通过实验发现，维生素能够显著地影响淡紫拟青霉孢子萌发和二级孢子产生，其中，核黄素、抗坏血酸、维生素B6对淡紫拟青霉孢子萌发有抑制作用，只有维生素B1对淡紫拟青霉孢子萌发有显著的促进作用，其对孢子萌发的促进效果要优于糖类物质、氨基酸和大分子有机氮源，所以在淡紫拟青霉孢子粉或孢子发酵液中仅添加维生素B1就能有效的达到促进孢子萌发的显著效果。

为此，本发明提供了一种抑制根结线虫卵孵化的真菌和孢子萌发促进剂复配制剂，包括：淡紫拟青霉孢子粉或孢子发酵液和维生素B1；

为了达到更好的效果，其中，按质量百分比计，各组分的用量优选为：

淡紫拟青霉孢子粉或孢子发酵液99.8-99.95%，维生素B1 0.05-0.2%；

更优选的，各组分的用量为：

淡紫拟青霉孢子粉或孢子发酵液99.9%，维生素B1 0.1%。

本发明通过实验发现，在上述由淡紫拟青霉孢子粉或孢子发酵液和维生素B1组成的复配制剂中加入糖类物质能够更有效的抑制根结线虫卵孵化；其中，所加入的糖类物质优选为蔗糖、D-山梨醇、麦芽糖或肌醇，更优选为蔗糖；其中，加入蔗糖后，按质量百分比计，复配制剂中各组分的用量优选为：淡紫拟青霉孢子粉或孢子发酵液99.6-99.9%，维生素B10.05-0.2%、蔗糖0.05-0.2%；更优选的，各组分的用量为：淡紫拟青霉孢子粉或孢子发酵液99.75%，维生素B1 0.1%、蔗糖0.15%。

进一步的实验发现，在上述复配制剂中加入特定的氨基酸能够显著提高制剂的防治根结线虫的效果；其中，所加入的氨基酸优选为L-丙氨酸、L-谷氨酸或L-天冬酰胺或，更优选为L-丙氨酸或L-谷氨酸；其中，在生物农药复配剂中加入氨基酸后，按质量百分比计，生物农药复配剂中各组分的用量优选为：淡紫拟青霉孢子粉或孢子发酵液99.4-99.85%，维生素B1 0.05-0.2%、蔗糖0.05-0.2%、氨基酸0.05-0.2%；更优选的，各组分的用量为：淡紫拟青霉孢子粉或孢子发酵液99.65%，维生素B1 0.1%、蔗糖0.15%、氨基酸0.1%。

本发明通过更进一步的实验发现，在上述生物农药复配制剂中加入大分子有机氮源能够显著促进淡紫拟青霉孢子萌发，其中，所述的大分子有机氮源优选为蛋白胨或牛肉膏，更优选为蛋白胨；在生物农药复配剂中加入蛋白胨后，按质量百分比计，生物农药复配剂中各组分的用量优选为：淡紫拟青霉孢子粉或孢子发酵液99.2-99.8%，维生素B1 0.05-0.2%、蔗糖0.05-0.2%、氨基酸0.05-0.2%、蛋白胨0.05-0.2%；更优选的，各组分的用量为：淡紫拟青霉孢子粉或孢子发酵液99.55%，维生素B10.1%、蔗糖0.15%、氨基酸0.1%、蛋白胨0.1%。

本发明中所述的淡紫拟青霉孢子粉或孢子发酵液的浓度可以是任何一种防治根结线虫有效量的浓度，例如，淡紫拟青霉孢子粉的活孢子数可以是10⁶个/g以上，孢子发酵液的浓度可以是10⁶个/ml以上，优选为孢子浓度为5×10⁶个/ml的孢子发酵液；

淡紫拟青霉孢子粉、孢子或孢子发酵液可通过各种商业途径购买得到，本领域所属技术人员也可按照文献中所公开的方法制备得到淡紫拟青霉孢子粉、孢子或孢子发酵液。

作为参考，本领域技术人员可参考下述方法制备得到淡紫拟青霉孢子粉：（1）制备淡紫拟青霉液体发酵液；（2）从淡紫拟青霉液体发酵液中回收孢子产物；（3）干燥所回收的淡紫拟青霉孢子产物，即得淡紫拟青霉粉。

淡紫拟青霉液体发酵液的制备方法已在各种文献中公开（例如：周靖等.淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)培养条件的优化.微生物学杂志.2007年3月第27卷第2期.45-48；毛成利等，淡紫拟青霉的研究开发.化学工程师.2004年7月.63-64.），本领域所属技术人员可按照文献中所公开的各种方法制备得到淡紫拟青霉液体发酵液；例如，采用三级培养方法，即：种子培养、二级液体扩大培养和液体发酵培养，制备得到淡紫拟青霉菌发酵液；其中，在液体发酵培养时,可以采用发酵罐发酵或采用摇瓶培养的方式进行发酵培养。三级培养所用到的培养基及其培养条件均已在文献中公开，作为参考，其中，所述的液体发酵培养基的组成成分包括碳源和氮源；所述的碳源包括但不限于葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉或玉米粉中的任一种或多种。所述的氮源包括但不限于硝酸钠、硫酸铵、蛋白胨或黄豆粉中的任一种或多种。

淡紫拟青霉在24℃-30℃范围内均能生长产孢，所以在制备淡紫拟青霉液体发酵液的各个培养过程中，各培养温度可以是24℃-30℃。在发酵培养过程摇床转速可以为80-250r/min，当摇床转速为220r/min时，产孢量会达到最高。液体发酵培养基的初始pH值为3-9时均能产孢；当初始pH值为5.0-5.5时，淡紫拟青霉的孢子产量相对较高；当液体发酵培养基的初始pH值是5.0时，淡紫拟青霉的产孢量达到最高。发酵罐的罐压可以为0.6-0.8Mpa；在用发酵罐或摇瓶进行发酵培养时，其通氧量可以是50-300L/h。

至于如何从液体发酵产物中回收孢子，可以采用诸如离心或过滤等方法从淡紫拟青霉液体发酵产物中回收孢子。本发明中所述的“干燥”方式可以是真空冷冻干燥、阴干或加热烘干等方式；其中，采用阴干或加热烘干的方式干燥孢子时，优选的，将待干燥的孢子液（所述的孢子液可以是将发酵液离心后所得到的沉淀物（孢子菌浆），也可以是将发酵液浓缩后所得到的浓缩液等）用载体进行吸附，再将吸附有孢子液的载体进行自然干燥（即：阴干）或加热烘干。

本发明的目的之四的是提供了一种制备上述真菌和孢子萌发促进剂复配制剂的方法，该方法包括以下步骤：（1）按所述用量称取各组分；（2）将各组分混合在一起，搅拌均匀，即得。

本发明真菌和孢子萌发促进剂复配制剂按生防菌剂的常规制备方法制备成液体生防制剂(原菌剂)或固体生防菌剂；例如，可向生物农药组合物中加入辅料（蟹壳粉、几丁质）、吸附载体（硅藻土、高岭土、木屑、活性碳或草炭、农作物秸秆、干燥的农家肥等）、助剂等，制备得到相应的微生物固体制剂或液体制剂，例如，可以是油剂、直接发酵液、水剂、颗粒制剂、可湿性粉剂、微胶囊菌剂等。

本发明通过对五大类生化营养基质对淡紫拟青霉孢子萌发影响的比较，筛选出能显著刺激孢子萌发的物质，加入其孢子制剂当中，以便在淡紫拟青霉分生孢子接触卵后能够迅速萌发和侵入，减少卵的孵化，增强孢子制剂控制根结线虫的效果。在此基础上，本发明采用正交试验获得促进孢子萌发的营养物质的最佳组合，并用生物实验验证了其防治根结线虫的生防效果，本发明生物农药复配剂与根结线虫作用5天，其寄生率就可达到80%以上，根结线虫卵孵化率接近为零。实验结果证明本发明生物农药复配菌剂能显著地提高淡紫拟青霉对根结线虫卵寄生率并有效缩短作用时间，对于植物根结线虫的防治效果有显著地提高。

附图说明

图1不同糖类物质对淡紫拟青霉分生孢子萌发及其二级孢子产生率的影响实验结果。

图2不同氨基酸对淡紫拟青霉分生孢子萌发及其二级孢子产生率的影响实验结果。

图3不同无机盐离子对淡紫拟青霉分生孢子萌发及其二级孢子产生率的影响实验结果。

图4不同维生素对淡紫拟青霉分生孢子萌发及其二级孢子产生率的影响实验结果。

图5不同有机氮源对淡紫拟青霉分生孢子萌发及其二级孢子产生率的影响实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

生物材料

淡紫拟青霉(P.lilacinus)菌株购自中国林业微生物菌种保藏管理中心，菌种商业购买编号为：cfcc 86080。

预备实施例淡紫拟青霉孢子粉的制备

一、淡紫拟青霉(P.lilacinus)发酵液的制备

1、将淡紫拟青霉菌种活化后，进行摇瓶种子培养；

摇瓶种子培养培养基的组成(按质量百分比计)：

葡萄糖1.5-2%

硝酸钠0.4-0.6%

硫酸铵0.2-0.3%

黄豆粉0.2-0.3%

磷酸氢二钾0.1-0.2%

硫酸镁0.1-0.2%

水余量

液体发酵条件：500ml三角瓶中装入种子培养基200ml,高压灭菌后接种淡紫拟青霉孢子悬浮液，接种量为1.5-3%，置于24-28℃，摇床150-200r/min，培养18-36h。

2、二级液体扩大培养(按质量百分比计):

葡萄糖3-5%

硝酸钠0.4-0.6%

硫酸铵0.2-0.3%

黄豆粉0.2-0.3%

磷酸氢二钾0.1-0.2%

硫酸镁0.1-0.2%

水余量

将上述液体培养基发酵罐中在位灭菌；

液体发酵条件：发酵温度25-28℃，罐压0.6-0.8bar，其通氧量可以是100-300L/h，转速150-250rpm，起始pH值5.5-6.0。

3、液体发酵培养：

葡萄糖10-18%

硝酸钠0.2-0.3%

硫酸铵0.1-0.15%

黄豆粉0.1-0.15%

磷酸氢二钾0.1-0.2%

硫酸镁0.1-0.2%

土豆浸出液（20%）10-30%

水余量

将上述液体培养基发酵罐中在位灭菌；

液体发酵条件：发酵温度为28-30℃，其通氧量可以是100-300L/h，前24h，通气量控制在100-150L/h，后期控制在250-300L/h；起始pH：5.0-6.0；转速：150-200r/min；罐压：0.6-0.8Mpa，发酵周期控制在6d，一般镜检孢子浓度达到10⁹个/ml以上即可。

二、从发酵液中回收并干燥孢子产物

将发酵液离心，离心条件为：相对离心力为4000g，离心时间为40min，每100毫升发酵液中加入絮凝剂2.0g；弃上清，将沉淀菌浆用硅藻土载体吸附后阴干至产品中的含水量低于10%，即得孢子粉。

实验例1防治根结线虫的生物农药复配剂的组分种类及用量的筛选实验

1.材料与方法

1.1供试菌株和根结线虫卵粒

供试菌株：淡紫拟青霉菌株购自中国林业微生物菌种保藏管理中心，菌种商业购买编号为：cfcc 86080；

供试根结线虫卵：采自北京市郊区珠宝屯村日光温室内栽培的番茄根系，室内鉴定为南方根结线虫。

1.2淡紫拟青霉孢子悬浮液制备

淡紫拟青霉菌株接种于PDA平板上，置于25℃恒温培养箱中培养5-7d，用0.05%（V/V）的无菌Tween-80溶液将PDA平板上的孢子洗下来，在振荡器或摇床上混合均匀，然后采用血球计数板进行计数，并用Tween-20溶液调整其孢子浓度为2×10⁸个/ml。

1.3孢子萌发促进剂的筛选

本试验选用糖类7种、氨基酸4种、维生素5种、无机盐6种、高分子有机氮源2种分别单独作为添加剂使用，浓度均为0.1wt%，以不加添加剂作为对照组，筛选出对淡紫拟青霉孢子萌发具有促进作用的营养物质。将筛出有利于孢子萌发的维生素B1、L-丙氨酸、蔗糖和蛋白胨作为孢子萌发促进因子，设计四因素三水平正交试验，水平为0.05wt%，0.1wt%和0.2wt%，按正交试验获得9个实验组合，每个处理重复3次，进行孢子萌发率测定。

1.4孢子萌发率测定

取5ml淡紫拟青霉孢子悬浮液，分别与5ml营养液（各种营养物质添加剂溶液）混匀，恒温26℃振荡（120r/min）培养8h（正交试验），12h（添加营养物质），重复三次取样测定各处理中的孢子萌发率，以芽管的长度超过孢子宽度的一半视为萌发。

1.5根结线虫卵的获得和生物测定

根结线虫卵粒的获得：将病根洗净，剪成0.5cm的小段，放入500ml三角瓶内，倒入200ml 1%次氯酸钠溶液，用力猛摇3min，将卵悬浮液先过300目筛，再过500目筛，然后使用蒸馏水连续清洗几次，尽量洗尽次氯酸钠，留在第二个筛上的便为根结线虫卵粒，用蒸馏水冲出，用灭菌水调节，使悬浮液中卵粒浓度为1000个/ml。

含有孢子萌发促进剂的孢子悬浮液的制备：按筛选出的孢子萌发促进剂组合配制含有Tween-20的营养物质溶液（不同浓度的维生素B1和蔗糖），然后加入孢子悬浮液，调整孢子浓度为10⁷个/ml，然后再稀释成10⁶、10⁵个/ml的系列浓度，以不含孢子萌发促进剂的Tween-20溶液为对照。

寄生率测定：在经过高压灭菌的培养皿（直径为6cm）中每皿加入1ml卵悬浮液，处理每皿加入4ml上述孢子悬浮液，对照每皿加4ml无菌水，封口膜封住置于25℃培养箱中，3d后连续3d定时于解剖镜下镜检，统计孵化线虫数、未寄生卵粒和寄生卵粒。每个处理和每次计数均重复3次。

1.6数据处理与分析

试验所得数据采用软件SPSS13.0分别进行方差分析和最小极差法（LSD）显著性差异比较（P≦0.05），正交试验结果用相应的统计方法进行分析。

2实验结果

2.1孢子萌发促进剂的筛选

真菌孢子的萌发一般需要一定的碳氮营养及其它生化因子的诱导。糖类、维生素、氨基酸、无机盐离子和高分子氮源等五大类共24种生化营养基质对淡紫拟青霉分生孢子萌发率和二级孢子的产生的影响如下。

糖类提供了生命活动所必需的能量物质和细胞骨架物质。方差分析表明，所试7种糖类物质能显著影响淡紫拟青霉孢子萌发或刺激芽管形成（df=7，F=9642.59，P<0.01），对二级孢子产生率的影响是不显著的（df=7，F=12.973，P<0.01）。从图1以及LSD多重比较分析得出，D-木糖、葡萄糖和海藻糖对淡紫拟青霉孢子的萌发表现为抑制作用，显著低于对照组，且三种糖类对淡紫拟青霉分生孢子萌发差异性显著；其它四种糖类物质对淡紫拟青霉孢子萌发的影响为促进作用，其促进效果为肌醇<麦芽糖<D-山梨醇<蔗糖，其中蔗糖对淡紫拟青霉孢子萌发的促进作用最强，接近70%，且与另外三种糖类存在显著差异性。

氨基酸是合成蛋白质的构件分子。表中列出了不同氨基酸处理的孢子萌发率及二级分生孢子形成率与对照间的比较。经方差分析表明，各种氨基酸对淡紫拟青霉孢子萌发的影响具有显著差异（df=4，F=6173.54，P<0.01），但对二级孢子产生率的影响不具显著性差异（df=4，F=415.27，P<0.01）。所试四种氨基酸对孢子萌发的影响均达显著水平，其中，L-丙氨酸、L-谷氨酸和L-天冬酰胺对孢子均表现出显著的促进作用，尤以L-丙氨酸最为明显，但是通过LSD多重比较（P<0.05）表明，L-丙氨酸和L-天冬酰胺对孢子萌发的促进作用差异性不显著，所以两种氨基酸均可作为促进淡紫拟青霉孢子萌发的氨基酸。

无机盐离子是真菌正常生长的重要营养物质，其中许多金属离子还是重要的辅酶因子。方差分析表明，各种无机盐离子对淡紫拟青霉孢子萌发（df=6，F=670.834，P<0.05）和产生二级孢子（df=6，F=36.968，P<0.05）的影响差异性显著。其中Fe₂（SO₄）₃和CaCl₂对淡紫拟青霉孢子的萌发率具有促进作用，但均与CK组差不多，其他无机盐离子对淡紫拟青霉孢子萌发均有明显的抑制作用。

维生素是组成辅酶的重要成分，参加多种生化反应，但真菌并不能通过自身来合成所有的维生素，有些维生素必须从外界摄取。方差分析表明，维生素能够显著地影响淡紫拟青霉孢子萌发（df=4，F=20009.284，P<0.05）和二级孢子产生（df=4，F=531.775，P<0.05）。核黄素、抗坏血酸、维生素B6对淡紫拟青霉孢子萌发有抑制作用，只有维生素B1对淡紫拟青霉孢子萌发有促进作用，而且显著高于对照组。

方差分析表明，两种有机氮源对淡紫拟青霉孢子萌发的影响具有显著性差异（df=2，F=10715.221，P<0.05），对二级孢子产生率的影响同样具有显著性差异（df=2，F=37.926，P<0.05）。两种大分子有机氮源牛肉膏和蛋白胨对淡紫拟青霉孢子萌发有显著的促进作用，萌发率远远大于对照组。

由以上正交实验直观分析得出，四个因素对淡紫拟青霉孢子萌发的影响如下：维生素B1>蔗糖>丙氨酸>蛋白胨。筛选得出最佳组合为：A₁B₁C₁D₂，即从直观分析来看，最佳回收率的组合为：维生素B1:0.1%，丙氨酸：0.1%，蔗糖：0.1%，蛋白胨0.1%。而且低浓度对孢子萌发的促进作用大于高浓度。通过方差分析表明，维生素B1，丙氨酸和蔗糖含量对淡紫拟青霉孢子萌发的影响是极显著，而蛋白胨含量对孢子萌发影响是不显著。各种营养物质的不同水平通过LSD多重比较表明，浓度为0.05%和0.1%的蛋白胨对淡紫拟青霉孢子萌发的影响是不显著的，所以应选用低浓度的蛋白胨作为促进孢子萌发的营养物质。所以通过正交试验筛选出的最佳组合为：维生素B1:0.1%，丙氨酸：0.1%，蔗糖：0.1%，蛋白胨0.05%。

表1

表2正交实验方差分析结果

表3

注：表中所有数据均为三次重复的平均值；其中C K1：不含孢子和营养物质（维生素B1:0.1%，丙氨酸：0.1%，蔗糖：0.1%，蛋白胨0.05%）；CK2：只含有孢子，浓度为10⁷个/ml；实验组1：含有营养物质和孢子，浓度为10⁷个/ml；实验组2：含有营养物质和孢子，浓度为5×10⁶个/ml；实验组3：含有营养物质和孢子，浓度为10⁶个/ml。

由表1-3中数据可以明显地看出，淡紫拟青霉分生孢子和根结线虫卵互作2d时，淡紫拟青霉分生孢子对卵的孵化影响很小，两者孵化率基本相当。但是随着互作时间的增加(5d)，淡紫拟青霉对卵的孵化有明显的促进作用，同时随着互作时间的增加，淡紫拟青霉分生孢子开始寄生卵，卵孵化减少，互作7d时，可以看出含有淡紫拟青霉分生孢子的对照组卵孵化率低于对照组1。含有营养物质的实验组，由于孢子的快速萌发，无论孢子浓度高低，对卵的孵化都有一定的抑制作用，孢子浓度较大时，孵化率为0，即使孢子浓度较低时，孵化率也明显地低于两个对照组；含有营养物质的实验组，极大的缩短了孢子萌发所需要的时间，显著的提高了寄生率和缩短了作用时间；当孢子浓度为5×10⁶个/ml时，寄生率最高，高于10⁷个/ml和10⁶个/ml，这可能是由于孢子浓度过高，营养物质竞争激烈，孢子萌发后菌丝生长缓慢造成的；而孢子浓度低则可能造成作用时间的延长。总之，在孢子悬浮液中添加适当的营养物质可以显著地提高淡紫拟青霉对根结线虫卵寄生率和缩短作用时间。

表4

注：表中所有数据均为三次重复的平均值，表中数据均为淡紫拟青霉和根结线虫卵互作5d后的结果；其中CK1：不含孢子和不含营养物质；CK2：只含有孢子10⁷个/ml；实验组1：含有营养物质（0.1%蛋白胨，0.1%维生素B1，0.1%L-丙氨酸，0.1%蔗糖）和孢子10⁷个/ml；实验组2：含有营养物质（0.05%蛋白胨，0.1%维生素B1，0.1%L-丙氨酸，0.1%蔗糖）和孢子10⁷个/ml；实验组3：含有营养物质（0.15%蛋白胨，0.1%维生素B1，0.1%L-丙氨酸，0.1%蔗糖）和孢子10⁷个/ml；实验组4：含有营养物质（0.1%蛋白胨，0.1%维生素B1，0.1%L-丙氨酸，0.05%蔗糖）和孢子10⁷个/ml；实验组5：含有营养物质（0.1%蛋白胨，0.1%维生素B1，0.1%L-丙氨酸，0.15%蔗糖）和孢子10⁷个/ml。

通过测定淡紫拟青霉分生孢子（含有不同浓度的碳源和氮源物质）对根结线虫卵的寄生率及其孵化率可得，碳源和氮源物质对卵寄生效果影响很大，而且碳源对其影响效果大于氮源，通过五组实验试验得出，最佳营养物质组合为0.1%蛋白胨，0.1%维生素B1，0.1%L-丙氨酸，0.15%蔗糖，与根结线虫作用5d，其寄生率可达到80%以上，卵孵化率几乎为0。

实施例1真菌和孢子萌发促进剂复配制剂的制备

按下述重量称取各组分（单位：kg）：淡紫拟青霉孢子粉99.9，维生素B10.1；将上述各组分混合在一起，搅拌均匀，即得。

实施例2真菌和孢子萌发促进剂复配制剂的制备

按下述重量称取各组分（单位：kg）：淡紫拟青霉孢子粉99.8，维生素B1 0.2；将上述各组分混合在一起，搅拌均匀，即得。

实施例3真菌和孢子萌发促进剂复配制剂的制备

按下述重量称取各组分（单位：kg）：淡紫拟青霉孢子粉99.95，维生素B10.05；将上述各组分混合在一起，搅拌均匀，即得。

实施例4真菌和孢子萌发促进剂复配制剂的制备

按下述重量称取各组分（单位：kg）：淡紫拟青霉孢子粉99.75，维生素B1 0.1、蔗糖0.15；将上述各组分混合在一起，搅拌均匀，即得。

实施例5真菌和孢子萌发促进剂复配制剂的制备

按下述重量称取各组分（单位：kg）：淡紫拟青霉孢子粉99.6，维生素B1 0.2、D-山梨醇0.2；将上述各组分混合在一起，搅拌均匀，即得。

实施例6真菌和孢子萌发促进剂复配制剂的制备

按下述重量称取各组分（单位：kg）：淡紫拟青霉孢子粉99.9，维生素B1 0.05、麦芽糖0.05；将上述各组分混合在一起，搅拌均匀，即得。

实施例7真菌和孢子萌发促进剂复配制剂的制备

按下述重量称取各组分（单位：kg）：淡紫拟青霉孢子粉99.65，维生素B1 0.1、蔗糖0.15、L-丙氨酸0.1；将上述各组分混合在一起，搅拌均匀，即得。

实施例8真菌和孢子萌发促进剂复配制剂的制备

按下述重量称取各组分（单位：kg）：淡紫拟青霉孢子粉99.4，维生素B1 0.2、D-山梨醇0.2、L-谷氨酸0.2；将上述各组分混合在一起，搅拌均匀，即得。

实施例9真菌和孢子萌发促进剂复配制剂的制备

按下述重量称取各组分（单位：kg）：淡紫拟青霉孢子粉99.85，维生素B1 0.05、麦芽糖0.05、L-天冬酰胺0.05；将上述各组分混合在一起，搅拌均匀，即得。

实施例10真菌和孢子萌发促进剂复配制剂的制备

按下述重量称取各组分（单位：kg）：淡紫拟青霉孢子粉99.55，维生素B1 0.1、蔗糖0.15、L-丙氨酸0.1、蛋白胨0.1；将上述各组分混合在一起，搅拌均匀，即得。

实施例11真菌和孢子萌发促进剂复配制剂的制备

按下述重量称取各组分（单位：kg）：淡紫拟青霉孢子粉99.2，维生素B1 0.2、D-山梨醇0.2、L-谷氨酸0.2、蛋白胨0.2；将上述各组分混合在一起，搅拌均匀，即得。

实施例12真菌和孢子萌发促进剂复配制剂的制备

按下述重量称取各组分（单位：kg）：淡紫拟青霉孢子粉99.8，维生素B1 0.05、麦芽糖0.05、L-天冬酰胺0.05、牛肉膏0.05；将上述各组分混合在一起，搅拌均匀，即得。

实施例13可湿性粉剂的制备

将实施例1所制备的真菌和孢子萌发促进剂复配制剂与吸附载体硅藻土、润湿剂和分散剂混合均匀后，干燥，粉碎过325目筛；将粉碎过筛后的产物混合均匀后磨细，再混合均匀，即得可湿性粉剂。

按照同样的方法，可将实施例2-12所制备的真菌和孢子萌发促进剂复配制剂制备得到可湿性粉剂。

实施例14水剂的制备

将实施例1所制备的真菌和孢子萌发促进剂复配制剂与表面活性剂、防止分解剂、防冻剂混合均匀，加入水，充分溶解，即得。

按照同样的方法将实施例2-12所制备的真菌和孢子萌发促进剂复配制剂制备得到水剂。

Claims

1.一种线虫卵寄生真菌和孢子萌发促进剂复配制剂，其特征在于，包括：淡紫拟青霉孢子粉或孢子发酵液、维生素B1、糖类物质和氨基酸；所述糖类物质是蔗糖、D-山梨醇、麦芽糖或肌醇；所述氨基酸为L-丙氨酸、L-谷氨酸或L-天冬酰胺；各组分的用量为：按质量百分比计，淡紫拟青霉孢子粉或孢子发酵液99.4-99.85％，维生素B10.05-0.2％、糖类物质0.05-0.2％、氨基酸0.05-0.2％。

2.按照权利要求1所述的复配制剂，其特征在于，各组分的用量为：淡紫拟青霉孢子粉或孢子发酵液99.65％，维生素B10.1％、糖类物质0.15％、氨基酸0.1％。

3.一种线虫卵寄生真菌和孢子萌发促进剂复配制剂，其特征在于，由以下组分组成：淡紫拟青霉孢子粉或孢子发酵液、维生素B1、糖类物质、氨基酸和大分子有机氮源；所述的糖类物质是蔗糖、D-山梨醇、麦芽糖或肌醇；所述氨基酸为L-丙氨酸、L-谷氨酸或L-天冬酰胺；所述的大分子有机氮源为蛋白胨或牛肉膏；各组分的用量为：按质量百分比计，淡紫拟青霉孢子粉或孢子发酵液99.2-99.8％，维生素B10.05-0.2％、糖类物质0.05-0.2％、氨基酸0.05-0.2％、大分子有机氮源0.05-0.2％。

4.按照权利要求3所述的复配制剂，其特征在于，各组分的用量为：淡紫拟青霉孢子粉或孢子发酵液99.55％，维生素B10.1％、糖类物质0.15％、氨基酸0.1％、大分子有机氮源0.1％；

所述糖类物质是蔗糖；所述氨基酸是L-丙氨酸；所述大分子有机氮源是蛋白胨。

5.权利要求1-4任何一项所述的复配制剂在防治根结线虫中的应用。