CN1128122C - 一种固氮菌微生物肥料的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种固氮菌微生物肥料是含茎瘤固氮根瘤菌，即Ac菌的微生物肥料，且所含的Ac菌是以固体发酵后的产物形式存在或者固体发酵产物与增补培养基和一定量灭菌水充分混合而制成的一种Ac菌固体发酵产物与增补培养基混合微生物肥料，其中含水重量为10～35%。其制备过程包括采集Ac菌、斜面菌种培养、摇瓶扩大培养、种子罐扩大培养、发酵罐液体发酵和固体发酵。这种Ac菌可作联合固氮菌应用于范围广泛的非豆科作物。由于该方法工艺简便，适于工业化生产。

Description

一种固氮菌微生物肥料的制备方法

本发明涉及一种固氮微生物肥料，具体地说是提供一种含茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans，以下简称Ac菌)的微生物肥料及其制备方法。

目前我国生产的固氮菌肥料，多采用园褐固氮菌(CN 1106366A)、棕色固氮菌(CN 1092397A)、阴沟肠杆菌和肺炎克氏杆菌等菌种[吴薇，葛诚：微生物学通报，1995，22(2)：104-107]，其固氮量较低，应用效果不稳定。根瘤菌肥料在低产田或新种植区应用，效果比较显著；但应用范围狭窄，一种根瘤菌肥料往往只适用于一种特定的作物，且不适于在禾本科粮食作物和非豆科蔬菜作物上应用。

在微生物肥料的生产工艺和成分构成方面，多直接应用发酵液或用载体简单吸附后贮存使用。此类液体菌剂有效期短，固体菌剂含有效菌数低，且因纯培养的微生物在施入土壤时会因环境条件骤变而大量死亡，应用效果受到严重影响。为解决后一个问题，发明专利CN 86103258A运用了有机增补培养基，收到良好效果；但细菌培养物浓缩脱水较难，工艺、设备较复杂，废液尚需处理。

本发明的目的是提供一种含Ac菌为特征菌种的固氮菌微生物肥料。这种Ac菌可作联合固氮菌应用于范围广泛的非豆科作物。同时本发明又提供了该微生物肥料的制备方法。由于该方法工艺简便，适于工业化生产。

本发明的固氮菌微生物肥料是一种含茎瘤固氮根瘤菌，即Ac菌的微生物肥料，其菌种Ac菌是从热带豆科植物毛萼田菁(Sesbania rostrata)的茎瘤中分离得到的共生固氮菌，它的固氮活力比一般豆科植物根瘤菌高2～3倍，比大豆根瘤菌高5倍。在离体培养条件下，Ac菌能自生固氮，因此可作联合固氮菌应用于非豆科作物。而一般豆科植物根瘤菌则不能，所以不适用于禾本科粮食作和非豆科作物。

上述本发明的固氮菌微生物肥料中所含的Ac菌是以固体发酵后的产物形式存在。为稳定或提高Ac菌的数量和生理活性，将固体发酵产物与增补培养基和一定量灭菌水充分混合而制成的一种Ac菌固体发酵产物与增补培养基混合微生物肥料，其中含水重量为10～35％。在本发明中增补培养基的运用，不同于一般的微生物肥料与有机或无机肥料的复合，其着眼点不在于肥料成分与作物间的关系，而在于肥料成分与肥料中的微生物之间的关系。在前述固体发酵产物中加入增补培养基，其直接作用是稳定或提高所培养的微生物的数量和生理活性；继则在施入土壤后，在所培养的微生物与土壤环境之间形成缓冲。因此，当增补培养基的加入量过少时，上述增补培养基的缓冲作物不明显。而当加入量过多时，Ac菌的含量降低，微生物肥料的施用量将增加，不利于应用。在本发明中较适宜的增补培养基的加入重量份比为固体发酵产物的5～50倍，使最终微生物肥料中含有适量的Ac菌量。

此外，在固体发酵产物与增补培养基混合时，也可同时添加一定量的辅助菌种，如钾细菌、磷细菌等发酵液，配制成含有一种或多种辅助菌种的固氮菌肥料。

本发明的固氮菌微生物肥料中也可添加铁或钼等微量元素，制成含有一定量微量元素的固氮菌肥料。微量元素可以与辅助菌种一起加入，也可以在配制Ac菌培养基中加入含有微量元素的盐，如FeCl₃和/或钼酸铵，微量元素的含量可依肥料中所需添加的量而定，一般其含量为肥料重量的1％以下。

上述本发明的固氮菌微生物肥料的制备方法与常规微生物肥料的制法相似包括采集Ac菌种，斜面菌种培养，摇瓶扩大培养，种子罐扩大培养，发酵罐液体发酵，其特征在于于液体发酵工序后进行固体发酵，所谓Ac菌固体发酵是用草炭、菇渣或风化煤等作吸附剂，先经干燥、粉碎、过80目筛，灭菌后制成吸附剂，取10～15％蔗糖无菌水溶液50～150ml/kg(吸附剂)与吸附剂混合，调pH至6.5～7.0；按100～150ml/kg(吸附剂)加入Ac菌发酵液，充分混匀，置25～30℃下发酵2～7天，制得微生物肥料。

对于含增补培养基的混合微生物肥料的制备方法可参照常规技术按下步骤：

1.制备增补培养基，即将有机肥，经发酵、干燥、粉碎、灭菌后制得；

2.将上述固体发酵产物，灭菌水与增补培养基按比例混合均匀制得产品。

如果需添加辅助菌种，制备成含有一种或多种辅助菌种的微生物肥料时，只要接常规技术将制得的辅助菌种制剂，如钾细菌和/或磷细菌的发酵液一起与增补培养基，固体发酵和灭菌水共同混合，即可配成产品。如同对将含微量元素的盐，如FeCl₃和/或钼酸铵加入共混，即可配制成含有一定量微量元素的微生物肥料。含微量元素的微生物肥料也可将微量元素添加到Ac菌培养基中制得，这时可按下述重量配比配制培养基：

乳酸钠，蔗糖或甘露醇     1～2％；

K₂HPO₄                 0.05～0.2％；

MgSO₄·7H₂O              0.01～0.02％；

NaCl                        0.005～0.01％；

CaCl₂                     0.004～0.02％；

FeCl₃                     ＜0.05％；

钼酸铵                     ＜0.05％；

酵母膏                      约0.1％；

pH                          6.5～7.0；其它无菌水。

Ac菌的发酵条件：25～30℃通气培养24～36小时。其中pH值用稀HCl或NaOH进行调整。

下面通过实例对本发明的技术给予进一步地说明。

实施例1  本发明固氮菌微生物肥料的制备1

本实施侧均按下列组成配制Ac菌液体发酵培养基，并用2N HCl或NaOH溶液调整pH值，除所述操作条件外，均按常规技术操作。

培养基：乳酸钠       1％，        CaCl₂          0.004％，

        K₂HPO₄    0.167％，    KH₂PO₄        0.087％，

        酵母膏       0.1％，      MgSO₄·7H₂O   0.01％，

        pH           6.7，        NaCl             0.005％，

        其它无菌水。培养基分装灭菌后，接Ac菌斜面菌种，在28℃、200rpm/分下摇瓶发酵24小时，发酵液有效菌数达61亿/ml。

50L种子罐加培养基30L，灭菌后加摇瓶发酵液1L，28℃通气(1∶1)培养24小时后，将发醇液转入发酵罐。500L发酵罐加培养基320L，发酵24小时后放罐，发酵液有效菌数达101亿/ml。

固体发酵以草炭为基质，经干燥、粉碎、过80目筛，126℃灭菌24小时。按下列组成配制培养基(重量份比)：

草炭      80，        蔗糖          1，      无菌水       10。

先将蔗糖溶于无菌水中，再与草炭混匀，调pH至6.7；按10%接种量加Ac菌发酵液(有效菌数为61亿/ml)，充分混匀，26℃发酵6天，有效菌数达142亿/g。

参照处理草炭的方法处理鸡粪有机干燥肥，然后按1∶4的重量比将无菌水加入有机干燥肥，混匀，制成增补培养基。取上述固体发酵产物(有效菌数为142亿/g)，按1∶9的重量比与增补培养基混匀，即得初始有效菌数为14亿/g的本发明产品I。

实施例2  含微量元素的本发明固氮菌微生物肥料的制备2

按照实施例1所述的方法，但在配制Ac菌液体培养基时加入0.0004％的FeCl₃，用风化煤代替草炭，在固体发酵配制的培养基中加入0.05份钼酸铵和0.2份K₂HPO₄，并先将蔗糖、K₂HPO₄、钼酸铵溶于无菌水中，再与风化煤混匀，按同样方法即可制得含微量元素的产品II。

实施例3  本发明微生物肥料的应用1

为比较Ac菌和联合固氮菌在非豆科作物上的应用效果，本试验以应用效果较好的肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)作为对比，用与实施例2同样的方法制备这两种菌剂，并在相同条件下对不同作物进行施肥试验，结果如下表：

                   Ac菌剂与Kp菌剂应用效果比较受试作物       试验点数     处理    平均亩产量     增产量     增产率

                                 (公斤/亩)    (公斤/亩)    (％)旱地小麦           4        对照       172.4

                        Kp菌       194.3        21.9       12.7

                        产品II     209.3        36.9       21.4水浇地小麦         5        对照       342.2

                        Kp菌       382.6        40.4       11.8

                        产品II     403.0        60.8       17.8水  稻             3        对照       592.7

                        Kp菌       663.6        70.9       12.0

                        产品II     707.1        114.4      19.3玉  米             4        对照       614.5

                        Kp菌       676.9        62.4       10.2

                        产品II     708.2        93.7       15.3马铃薯             3        对照       843.3

                        Kp菌       909.7        66.4       7.9

                        产品II     971.5        128.2      15.2

实施例4  本发明微生物肥料的应用2

以大棚西红柿为例。西红柿品种为L-402。试验棚总面积为0.93亩，底肥施鸡粪10M³。每试验小区面积为6.98M²，植株密度为42株/小区。秧苗定植时用本发明产品I蘸根，对照不用。试验结果如下：

1.对性状、品质及抗性的影响

与对照区比较：试验区秧苗墩实，茎粗状，叶片大而厚，根系发达(表1)。果实大，着色好，无畸形果，无空心果，口味甜。较抗旱，抗早衰，抗晚疫病能力较强，晚发病3天，病情较轻。

         表1      Ac菌剂处理与对照间生育性状比较

         株高(cm)     茎粗(cm)    单株鲜重(g)    单根鲜重(g)对照           125          13.7          630            40产品I          120          14.5          800            50

2.对产量的影响

在采收期，按小区分别累计西红柿产量，结果如表2。

        表2      Ac菌剂处理与对照间果实产量比较

      小区平均产量(kg)      折亩产(kg)    亩增产量(kg)  增产量(％)对照           40.5                3898产品I          56.2                5409          1511         38.8

3.对土壤的影响

果实全部采收后，分别从处理区和对照区的植株根际采土，测其速较氮、磷、钾含量，结果如表3。

        表3  Ac菌剂处理区与对照区土壤速效氮、磷、钾比较

        速效氮(mg/kg)         速效磷(mg/kg)    速效钾(mg/kg)对照            136                  210               171产品I           152                  352               380

由上述实施例可知，本发明的固氮菌微生物肥料对茎类和蔬菜等作物均具有良好的肥效。且由于制备这种微生物肥料的过程简单，固体发酵工艺不需将发酵液浓缩脱水，没有废液排出，适于工业化生产。

Claims (2)

1.一种固氮菌微生物肥料的制备方法，包括Ac菌斜面菌种培养，摇瓶培养，种子罐扩大培养，发酵罐液体发酵，其特征在于液体发酵工序后进行固体发酵，Ac菌固体发酵是用草炭、菇渣或风化煤经干燥、粉碎、过80目筛、灭菌后制成吸附剂，每公斤吸附剂加10～15％蔗糖无菌水溶液50～150ml混合，调pH至6.5～7.0，再加入Ac菌发酵液100～150ml，充分混匀，置25～30℃下发酵2～7天，再按1∶9的重量比与增补培养基混合均匀制得微生物肥料。

2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于所说的增补培养基，是将鸡粪有机肥，经发酵、干燥、粉碎、过80目筛、灭菌，按20-35％的含水量加入无菌水后制得。