CN102919279B - 防治根结线虫的复合微生物制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种防治根结线虫的复合微生物制剂及其制备方法。所述复合微生物制剂包括：淡紫拟青霉孢子粉或发酵液、增效剂和载体；其中，所述的增效剂选自植物生长激素、诱抗剂或具有杀线效果的无机盐中的任意一种或多种。本发明从植物生长激素、诱抗剂或无机盐中筛选出能够增加淡紫拟青霉防效且不影响淡紫拟青霉孢子萌发和菌丝生长的增效剂，将所筛选到的增效剂和载体加入到淡紫拟青霉孢子粉或发酵液中制备得到防治根结线虫的复合微生物制剂。本发明复合微生物制剂对根结线虫具有良好的防治效果，还能够提高植物的抗病力并能显著促进植物根系生长。
Description
技术领域
本发明涉及一种真菌复配制剂，尤其涉及一种防治根结线虫的淡紫拟青霉(P.lilacinus)复合微生物制剂及其制备方法，本发明还涉及该复合微生物制剂在防治植物根结线虫中的用途，属于淡紫拟青霉生防制剂领域。
背景技术
淡紫拟青霉(P.lilacinus)是一种土壤及多种植物根围的习居菌，对南方根结线虫的寄生率很高，可达80％以上。现已认为淡紫拟青霉是一种非常重要的植物寄生线虫卵寄生真菌，目前已广泛应用于防治根结线虫、胞囊线虫等有害植物寄生线虫。到目前为止，世界上已经有了多种以淡紫拟青霉分生孢子为主要有效成分的杀线制剂，其中包括可湿性粉剂、颗粒剂及微胶囊菌剂等。
淡紫拟青霉可以寄生线虫卵且寄生率高，但是对二龄幼虫的寄生效果较差，而且淡紫拟青霉在一定程度上还有利于卵孵化，所以在其制剂中添加具有对二龄幼虫有杀害作用但不影响淡紫拟青霉孢子萌发和菌丝生长的物质将能有效提高淡紫拟青霉的杀线虫效果。因此，筛选能够出促进淡紫拟青霉分生孢子萌发或抑制根结线虫卵孵化的增效物，将其与淡紫拟青霉孢子进行复配得到复合微生物制剂将能够有效提高淡紫拟青霉孢子防治根结线虫的效果。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种有效防治根结线虫的淡紫拟青霉复合微生物制剂；
本发明的目的之二是提供一种制备上述淡紫拟青霉复合微生物制剂的方法；
本发明的目的之三是将所述的淡紫拟青霉复合微生物制剂应用于防治植物根结线虫。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
一种防治根结线虫的复合微生物制剂，包括：淡紫拟青霉孢子粉或发酵液、增效剂和载体；其中，所述的增效剂选自植物生长激素、诱抗剂或/和无机盐中的任意一种或多种。
所述的植物生长激素优选为吲哚乙酸、2,4-D、萘乙酸或吲哚丁酸中的任意一种或多种；其中，按质量百分比计，吲哚乙酸占制剂总量的0.00001-0.005％，优选为0.0001-0.001％，最优选为0.001％；2,4-D占制剂总量的0.00005-0.005％；萘乙酸占制剂总量的0.00001-0.001％，更优选为0.00001-0.0001％；吲哚丁酸占制剂总量的0.0003-0.0008％，优选为：0.0003-0.0005％，更优选为0.0005％。
所述的诱抗剂优选为草酸或水杨酸；按质量百分比计，草酸占制剂总量的0.05-0.15％，优选为0.05-0.1％；水杨酸占制剂总量的0.001-0.01％。
本发明通过实验发现，制剂中含有高浓度的草酸对淡紫拟青霉孢子萌发有显著的促进作用，其中，当制剂中草酸的用量为500-1500mg/L(即：0.05-0.15％)，尤其是500-1000mg/L(即：0.05-0.1％)时，其对于淡紫拟青霉孢子萌发的促进作用最为显著。本发明进一步的实验发现，制剂中浓度为10-1000mg/L的水杨酸对淡紫拟青霉孢子萌发抑制率和菌丝日生长速率抑制率的影响均为极显著(P<0.01)。通过LSD多重比较表明，水杨酸各用量之间存在差异性(P<0.05)。各用量水杨酸对淡紫拟青霉孢子萌发菌丝日生长速率均有一定抑制作用，制剂中低用量(10-100mg/L)的水杨酸对其抑制率较小，随着其在制剂中用量的增加抑制率显著增高，当其在制剂中的含量大于500mg/ml时，孢子萌发抑制率大于50％，菌丝生长速率抑制率达到了100％。因此，本发明制剂中水杨酸的用量优选为占制剂总量的0.001-0.01％。
本发明还考察了多种无机盐对于淡紫拟青霉孢子萌发或其菌丝生长的影响效果。试验结果发现，大多数的无机盐对于淡紫拟青霉孢子或萌发或菌丝生长均有严重的抑制作用，不适宜作为淡紫拟青霉的增效剂。本发明从大量的无机盐中最终筛选到CuSO4、(NH4)2SO4、NH4Cl和NH4NO3这四种无机盐对于淡紫拟青霉孢子或萌发或菌丝生长具有一定的促进作用，有作为淡紫拟青霉杀线虫的增效剂的可能性；其中，NH4Cl对淡紫拟青霉孢子萌发有较为显著的促进作用，NH4NO3对淡紫拟青霉孢子萌发和菌丝生长均有明显的促进作用，这两种铵盐不仅对根结线虫卵的孵化抑制率很高，对二龄根结线虫幼虫表现为半致死浓度的这两种铵盐对淡紫拟青霉分生孢子寄生卵表现为促进作用，由此，本发明发现将NH4Cl或NH4NO3加入到淡紫拟青霉孢子粉或发酵液中能显著提高淡紫拟青霉的杀线虫效果。本发明通过更进一步的试验发现，无机盐占制剂总量的1.0-2.2％，尤其是1.0-1.1wt％时，最有利于淡紫拟青霉孢子萌发或菌丝生长。
淡紫拟青霉孢子粉或发酵液可通过各种商业途径购买得到，本领域所属技术人员也可按照文献中所公开的方法制备得到淡紫拟青霉孢子粉或发酵液；
作为参考，本领域技术人员可参考下述方法制备得到淡紫拟青霉孢子粉：(1)制备淡紫拟青霉发酵液；(2)从淡紫拟青霉发酵液中回收孢子产物；(3)干燥所回收的淡紫拟青霉孢子产物，即得淡紫拟青霉粉。
淡紫拟青霉发酵液的制备方法已在各种文献中公开(例如：周靖等.淡紫拟青霉(P.lilacinus)培养条件的优化.微生物学杂志.2007年3月第27卷第2期.45-48；毛成利等，淡紫拟青霉的研究开发.化学工程师.2004年7月.63-64.)，本领域所属技术人员可按照文献中所公开的各种方法制备得到淡紫拟青霉发酵液；例如，采用三级培养方法，即：种子培养、二级液体扩大培养和液体发酵培养，制备得到淡紫拟青霉菌发酵液；其中，在液体发酵培养时，可以采用发酵罐发酵或采用摇瓶培养的方式进行发酵培养；三级培养所用到的培养基及其培养条件均已在文献中公开，作为参考，其中，所述的液体发酵培养基的组成成分包括碳源和氮源；所述的碳源包括但不限于葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉或玉米粉中的任一种或多种。所述的氮源包括但不限于硝酸钠、硫酸铵、蛋白胨或黄豆粉中的任一种或多种。
本发明的目的之二的是提供了一种制备上述淡紫拟青霉复合制剂的方法，该方法包括以下步骤：将各组分混合在一起，搅拌均匀，粉碎过筛，制备得到相应的微生物制剂，可以是颗粒制剂、粉剂、可湿性粉剂或微胶囊菌剂等。
其中，所述的载体可以是硅藻土、高岭土、木屑、活性碳或草炭、农作物秸秆、干燥的农家肥等；此外，本发明的制剂中还可加入辅料或/和助剂；所述的辅料可以是蟹壳粉或几丁质等；所述的助剂可以是润湿剂、分散剂或稳定剂等。
本发明从植物生长激素、诱抗剂、无机盐等多种促进植物根系生长的或提高植物抗病性或提高杀线效果的物质中筛选对淡紫拟青霉孢子萌发和菌丝生长影响较小的物质作为增效剂，将所筛选到的增效剂与淡紫拟青霉孢子粉或发酵液复配得到本发明淡紫拟青霉复合微生物制剂，该复合微生物制剂能够有效促进促进植物根系生长，诱导植物根系产生对根结线虫等病害的抗性，且能够提高淡紫拟青霉对根结线虫的防治效果。
说明：如无特别说明，本发明中所述的百分比均为质量百分比。
附图说明
图1植物生长激素对淡紫拟青霉孢子萌发的影响试验结果。
图2植物生长激素对淡紫拟青霉菌丝生长的影响试验结果。
图3诱抗剂对淡紫拟青霉孢子萌发的影响试验结果。
图4诱抗剂对淡紫拟青霉菌丝生长速率的影响试验结果。
图5无机盐对淡紫拟青霉孢子生长的影响试验结果。
图6无机盐对淡紫拟青霉菌丝生长的影响试验结果。
说明：图1-图6所有数据都是基于对照组CK的基础上计算出来，所以所有图中CK组的数据为0。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
生物材料
淡紫拟青霉(P.lilacinus)菌株购自中国林业微生物菌种保藏管理中心，菌种商业购买编号为：cfcc 86080。
预备实施例 淡紫拟青霉孢子粉的制备
一、淡紫拟青霉(P.lilacinus)发酵液的制备
1、将淡紫拟青霉菌种活化后，进行摇瓶种子培养；
摇瓶种子培养培养基的组成(按质量百分比计)：
液体发酵条件：500ml三角瓶中装入种子培养基200ml，高压灭菌后接种淡紫拟青霉孢子悬浮液，接种量为1.5-3％，置于24-28℃，摇床150-200r/min，培养18-36h。
2、二级液体扩大培养(按质量百分比计)：
二级液体扩大培养的培养基组成：
将上述二级液体扩大培养基发酵罐中在位灭菌；
液体发酵条件：发酵温度25-28℃，罐压0.6-0.8bar，其通氧量可以是100-300L/h，转速150-250rpm，起始pH值5.5-6.0。
3、液体发酵培养：
液体发酵培养的培养基组成：
将上述液体培养基发酵罐中在位灭菌；
液体发酵条件：发酵温度为28-30℃，其通氧量可以是100-300L/h，前24h，通气量控制在100-150L/h，后期控制在250-300L/h；起始pH：5.0-6.0；转速：150-200r/min；罐压：0.6-0.8Mpa，发酵周期控制在6d，一般镜检孢子浓度达到109个/ml以上即可。
二、从发酵液中回收并干燥孢子产物
将发酵液离心，离心条件为：相对离心力为4000g，离心时间为40mi n，每100毫升发酵液中加入絮凝剂2.0g；弃上清，将沉淀菌浆用硅藻土载体吸附后阴干至产品中的含水量低于10％，即得孢子粉。
实施例1 可湿性粉剂的制备
按下述质量百分配比称取各组分：淡紫拟青霉孢子粉85.999％,吲哚乙酸0.001％，硅藻土10％，润湿剂PEG 2％、分散剂木钠2％；将淡紫拟青霉孢子粉和硅藻土混合均匀后粉碎过325目筛；将粉碎后的产物与吲哚乙酸、润湿剂和分散剂混合均匀后用气流磨磨细，混合均匀，即得。
实施例2 可湿性粉剂的制备
按下述质量百分配比称取各组分：淡紫拟青霉孢子粉85.99％,吲哚乙酸0.01％，硅藻土10％，润湿剂PEG2％、分散剂木钠2％；将淡紫拟青霉孢子粉和硅藻土混合均匀后粉碎过325目筛；将粉碎后的产物与吲哚乙酸、润湿剂和分散剂混合均匀后用气流磨磨细，混合均匀，即得。
实施例3 可湿性粉剂的制备
按下述质量百分配比称取各组分：淡紫拟青霉孢子粉85.99999％,吲哚乙酸0.0001％，硅藻土10％，润湿剂PEG2％、分散剂木钠2％；将淡紫拟青霉孢子粉和硅藻土混合均匀后粉碎过325目筛；将粉碎后的产物与吲哚乙酸、润湿剂和分散剂混合均匀后用气流磨磨细，混合均匀，即得。
实施例4 可湿性粉剂的制备
按下述质量百分配比称取各组分：淡紫拟青霉孢子粉85.99999％,萘乙酸0.0001％，硅藻土10％，润湿剂PEG2％、分散剂木钠2％；将淡紫拟青霉孢子粉和硅藻土混合均匀后粉碎过325目筛；将粉碎后的产物与萘乙酸、润湿剂和分散剂混合均匀后用气流磨磨细，混合均匀，即得。
实施例5 可湿性粉剂的制备
按下述质量百分配比称取各组分：淡紫拟青霉孢子粉85.999％,萘乙酸0.001％，硅藻土10％，润湿剂PEG2％、分散剂木钠2％；将淡紫拟青霉孢子粉和硅藻土混合均匀后粉碎过325目筛；将粉碎后的产物与萘乙酸、润湿剂和分散剂混合均匀后用气流磨磨细，混合均匀，即得。
实施例6 可湿性粉剂的制备
按下述质量百分配比称取各组分：淡紫拟青霉孢子粉85.9995％,吲哚丁酸0.0005％，硅藻土10％，润湿剂PEG2％、分散剂木钠2％；将淡紫拟青霉孢子粉和硅藻土混合均匀后粉碎过325目筛；将粉碎后的产物与吲哚丁酸、润湿剂和分散剂混合均匀后用气流磨磨细，混合均匀，即得。
实施例7 可湿性粉剂的制备
按下述质量百分配比称取各组分：淡紫拟青霉孢子粉85.995％,2,4-D 0.005％，硅藻土10％，润湿剂PEG2％、分散剂木钠2％；将淡紫拟青霉孢子粉和硅藻土混合均匀后粉碎过325目筛；将粉碎后的产物与2,4-D、润湿剂和分散剂混合均匀后用气流磨磨细，混合均匀，即得。
实施例8 可湿性粉剂的制备
按下述质量百分配比称取各组分：淡紫拟青霉孢子粉85.99995％,2,4-D 0.00005％，硅藻土10％，润湿剂PEG2％、分散剂木钠2％；将淡紫拟青霉孢子粉和硅藻土混合均匀后粉碎过325目筛；将粉碎后的产物与2,4-D、润湿剂和分散剂混合均匀后用气流磨磨细，混合均匀，即得。
实施例9 可湿性粉剂的制备
按下述质量百分配比称取各组分：淡紫拟青霉孢子粉85.95％,草酸0.05％，硅藻土10％，润湿剂PEG2％、分散剂木钠2％；将淡紫拟青霉孢子粉和硅藻土混合均匀后粉碎过325目筛；将粉碎后的产物与草酸、润湿剂和分散剂混合均匀后用气流磨磨细，混合均匀，即得。
实施例10 可湿性粉剂的制备
按下述质量百分配比称取各组分：淡紫拟青霉孢子粉85.85％,草酸0.15％，硅藻土10％，润湿剂PEG2％、分散剂木钠2％；将淡紫拟青霉孢子粉和硅藻土混合均匀后粉碎过325目筛；将粉碎后的产物与草酸、润湿剂和分散剂混合均匀后用气流磨磨细，混合均匀，即得
实施例10 可湿性粉剂的制备
按下述质量百分配比称取各组分：淡紫拟青霉孢子粉85.999％,水杨酸0.001％，硅藻土10％，润湿剂P EG2％、分散剂木钠2％；将淡紫拟青霉孢子粉和硅藻土混合均匀后粉碎过325目筛；将粉碎后的产物与水杨酸、润湿剂和分散剂混合均匀后用气流磨磨细，混合均匀，即得。
实施例11 可湿性粉剂的制备
按下述质量百分配比称取各组分：淡紫拟青霉孢子粉85.99％,水杨酸0.01％，硅藻土10％，润湿剂P EG2％、分散剂木钠2％；将淡紫拟青霉孢子粉和硅藻土混合均匀后粉碎过325目筛；将粉碎后的产物与水杨酸、润湿剂和分散剂混合均匀后用气流磨磨细，混合均匀，即得。
实施例12 可湿性粉剂的制备
按下述质量百分配比称取各组分：淡紫拟青霉孢子粉85％,NH4Cl1％，硅藻土10％，润湿剂PEG2％、分散剂木钠2％；将淡紫拟青霉孢子粉和硅藻土混合均匀后粉碎过325目筛；将粉碎后的产物与NH4Cl、润湿剂和分散剂混合均匀后用气流磨磨细，混合均匀，即得。
实施例13 可湿性粉剂的制备
按下述质量百分配比称取各组分：淡紫拟青霉孢子粉84.9％,NH4NO31.1％，硅藻土10％，润湿剂PEG2％、分散剂木钠2％；将淡紫拟青霉孢子粉和硅藻土混合均匀后粉碎过325目筛；将粉碎后的产物与润湿剂、分散剂和N H4NO3混合均匀后用气流磨磨细，混合均匀，即得。
实施例14 可湿性粉剂的制备
按下述质量百分配比称取各组分：淡紫拟青霉孢子粉84.9495％、NH4Cl 1％，硅藻土10％，润湿剂PEG2％、分散剂木钠2％、吲哚丁酸0.0005％，草酸0.05％；将淡紫拟青霉孢子粉和硅藻土混合均匀后粉碎过325目筛；将粉碎后的产物与润湿剂、分散剂、吲哚丁酸和草酸混合均匀后用气流磨磨细，混合均匀，即得。
试验例1 植物生长激素和诱抗剂对于淡紫拟青霉孢子萌发和菌丝生长速率影响的筛选试验
1．植物生长激素种类及用量对淡紫拟青霉孢子萌发或菌丝生长的影响试验
1.1试验方法
1.1.1植物生长调节剂对淡紫拟青霉孢子萌发的影响
取0.1mL浓度为103个孢子/mL的淡紫拟青霉孢子悬浮液，涂布在含不同浓度植物生长调节剂的平板上；以不含植物生长调节剂的PDA平板为对照CK。每个处理重复3次。将所有处理的平板置于25℃下培养3-4d后，进行CFU计数。然后以对照组CK为基准计算出分生孢子的萌发抑制率，即：
抑制率(％)=1-实验组CFU/对照组CFU
1.1.2植物生长调节剂对淡紫拟青霉菌丝生长的影响
在含有植物生长调节剂的PDA平板上接种蘸有淡紫拟青霉孢子悬浮液的直径为6mm的滤纸片，以不含植物生长调节剂为对照，每个处理重复3次，每隔3d测量菌落的生长直径，计算菌落直径日增长量：菌落直径日增长量(mm/d)=d/生长天数。然后以对照组CK为基准计算出菌丝生长抑制率，即：
抑制率(％)=1-实验组菌丝生长速率/对照组菌丝生长速率
1.2 试验结果
试验结果见图1和图2，试验结果表明，制剂中吲哚乙酸(IAA)的终浓度或用量为0.1-50mg/L或0.1-50mg/kg(即：0.00001-0.005%)时，其对淡紫拟青霉孢子萌发表现出一定的促进作用，吲哚乙酸在制剂中的用量为10mg/L(即：0.001％)时，其对孢子萌发表现出非常强的促进作用，与其它浓度相比存在显著性差异(P<0.05)；当其在制剂中的用量达到100mg/L时，其对淡紫拟青霉孢子萌发的抑制率表现出较强的抑制作用，抑制率超过了25％，当其在制剂中的用量达到了1000mg/L时孢子萌发完全被抑制，但菌丝仍然可以慢速生长。吲哚乙酸对淡紫拟青霉菌丝的生长呈现出微弱的抑制作用，当其用量为1.0-10.0mg/L时，对于淡紫拟青霉菌丝的生长几乎不表现出抑制作用。经过综合考察，制剂中吲哚乙酸的用量可以为0.1-50mg/L(0.00001-0.005%)，优选为1.0-10.0mg/L(0.0001-0.001%)，更优选为10.0mg/L(0.001%)。
从试验结果可见，吲哚丁酸对于淡紫拟青霉孢子萌发的抑制作用较弱，其在制剂中的浓度为3.0-10.0mg/L时，对于淡紫拟青霉孢子的萌发表现出一定的促进作用，其在制剂中的浓度为5.0mg/L(即：0.0005％)时，对于淡紫拟青霉孢子萌发的促进作用最为显著(P<0.05)。吲哚丁酸在制剂中的用量为3.0-8.0mg/L时，对于紫拟青霉孢子菌丝的生长均表现出促进作用。当制剂中吲哚丁酸的用量为5.0mg/L时，淡紫拟青霉孢子萌发率最高，菌丝日生长量也为最大，且与其它浓度相比呈现极显著差异(P<0.05)。综合上述试验结果，可以看出吲哚丁酸在制剂中的用量为3.0-8.0mg/L(0.0003-0.0008%)时较为适宜，优选为3.0-5.0mg/L(0.0003-0.0005%)，最优选为5.0mg/L(0.0005%)。
从试验结果可见，用量为0-500mg/L的2,4-D对淡紫拟青霉孢子萌发抑制率和菌丝日生长速率的影响均不显著。低用量(即：0.5-50mg/L)的2,4-D对淡紫拟青霉孢子萌发和菌丝日生长量均有促进作用，略高于对照组，本发明通过试验发现，制剂中2,4-D用量0.5-50mg/L或0.5-50mg/kg(即0.00005-0.005%)时，其作为淡紫拟青霉杀线虫剂的增效剂的效果为最好。
从试验结果可见，制剂中用量为0-100mg/L的萘乙酸对淡紫拟青霉孢子萌发和菌丝日生长量的影响均不显著，均低于对照组，对孢子的萌发和生长没有促进作用。当用量达到1000mg/L时，淡紫拟青霉孢子萌发和菌丝生长菌完全被抑制。通过LSD多重比较表明，各浓度之间差异性不显著(P<0.05)。
2.诱抗剂的种类及浓度对淡紫拟青霉孢子萌发或菌丝生长速率的影响试验
2.1 试验方法
2.1.1诱抗剂对淡紫拟青霉孢子萌发的影响
取0.1mL浓度为103个孢子/mL的淡紫拟青霉孢子悬浮液，涂布在含不同浓度诱抗剂的平板上。以不含诱抗剂的PDA平板为对照。每个处理重复3次。将所有处理的平板置于25℃下培养3-4d后，进行CFU计数。然后以对照组CK为基准计算出分生孢子的萌发抑制率，即：
抑制率(％)=1-实验组CFU/对照组CFU
2.1.2诱抗剂对淡紫拟青霉菌丝生长的影响
在含有诱抗剂的PDA平板上接种蘸有淡紫拟青霉孢子悬浮液的直径为6mm的滤纸片，以不含诱抗剂为对照，每个处理重复3次，每3d测量菌落的生长直径，计算菌落直径日增长量：菌落直径日增长量(mm/d)=d/生长天数。然后以对照组CK为基准计算出菌丝生长抑制率，即：
抑制率(％)=1-实验组菌丝生长速率/对照组菌丝生长速率
2.2试验结果
试验结果见图3和图4，将试验结果通过方差分析表明，制剂中草酸的用量为50-1000mg/L时，其对淡紫拟青霉孢子萌发抑制率的影响为显著(P<0.05)，对其菌丝日生长速率的影响为不显著。通过LSD多重比较表明，草酸各用量之间并不存在差异性(P<0.05)。制剂中草酸的用量为50-100mg/L时)草酸对淡紫拟青霉孢子萌发有抑制作用，但是高用量的(500-1500mg/L)的草酸对淡紫拟青霉孢子萌发有促进作用。草酸各种用量浓度对淡紫拟青霉菌丝日生长速率均有一定抑制作用，而且各浓度之间不存在差异性。综合各实验结果，本发明确定，采用用量为500-1000mg/L(即：0.05-0.1％)的草酸来作为淡紫拟青霉杀线虫剂的增效剂的效果为最好。
试验结果通过方差分析表明(图3、图4)，制剂中水杨酸的用量为10-1000mg/L时，其对淡紫拟青霉孢子萌发抑制率和菌丝日生长速率抑制率的影响均为极显著(P<0.01)。通过LSD多重比较表明，水杨酸各用量之间存在差异性(P<0.05)。各用量水杨酸对淡紫拟青霉孢子萌发菌丝日生长速率均有一定抑制作用，低用量(10-100mg/L)的水杨酸对淡紫拟青霉孢子萌发抑制率较小，但是随着用量的增加抑制率显著增高，当用量大于500mg/L时，孢子萌发抑制率大于50％，菌丝生长速率抑制率达到了100％。因此，本发明确定水杨酸在制剂中的用量优选为10-100mg/L(即：0.001-0.01％)。
3 几种具有杀线虫效果的无机盐对淡紫拟青霉孢子萌发或菌丝生长的影响试验
3.1 试验方法
3.1.1无机盐对淡紫拟青霉孢子萌发的影响
在营养液添加相应的无机盐和淡紫拟青霉分生孢子，调整到相应的无机盐的浓度和分生孢子浓度，混匀，恒温26℃振荡(120r/min)培养12h，重复三次取样测定各处理中的孢子萌发数，以芽管的长度超过孢子宽度的一半视为萌发。然后以对照组CK为基准计算出分生孢子的萌发抑制率，即：
抑制率(％)=1-实验组萌发数/对照组萌发数
3.1.2无机盐对淡紫拟青霉菌丝生长的影响
在含有相应浓度的PDA平板上接种蘸有淡紫拟青霉孢子悬浮液的直径为6mm的滤纸片，以不含无机盐为对照，每个处理重复3次，每3d测量菌落的生长直径，计算菌落直径日增长量：菌落直径日增长量(mm/d)=d/生长天数。然后以对照组CK为基准计算出菌丝生长抑制率，即：
抑制率(％)=1-实验组菌丝生长速率/对照组菌丝生长速率
3.2试验结果
由表1-3、图5和图6可见，NH4HCO3、柠檬酸、K2HPO4、FeCl3四种杀线虫化合物对淡紫拟青霉孢子萌发或菌丝生长速率抑制率都较大，所以不适于作为淡紫拟青霉杀线虫的增效剂；CuSO4、(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3对淡紫拟青霉孢子萌发和菌丝生长的抑制率很小，而且N H4Cl对其孢子萌发有促进作用，NH4NO3对淡紫拟青霉孢子萌发和菌丝生长均有促进作用，所以本发明优选用CuSO4、(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3这四种无机盐对根结线虫半致死率的浓度来作为淡紫拟青霉的增效剂。
表1 几种无机盐对淡紫拟青霉孢子萌发抑制率影响的方差分析结果
表2 几种无机盐对淡紫拟青霉菌丝生长抑制率影响的方差分析结果
通过方差分析表明，几种具有杀线虫效果的无机盐和柠檬酸对淡紫拟青霉孢子萌发和菌丝生长速率的影响是极显著的。随后对其不同种类的增效剂进行LSD多重比较，结果见图5和6。
表3 三种增效剂对淡紫拟青霉侵染根结线虫卵的影响
由表3可以看出，FeCl3虽然对根结线虫卵的孵化抑制很大，但是对淡紫拟青霉侵染根结线虫卵的抑制率很高，所以不适合作为淡紫拟青霉制剂的增效剂。而NH4Cl和NH4NO3不仅对根结线虫卵的孵化抑制率很高，对二龄幼虫表现为半致死浓度的这两种铵盐对淡紫拟青霉分生孢子寄生卵也表现为促进作用，所以本发明最优选采用1.0-1.1％的铵盐作为淡紫拟青霉孢子制剂的增效剂。
Claims (7)
1.一种防治线虫的复合微生物制剂，其特征在于：由淡紫拟青霉(P.lilacinus)孢子粉或发酵液、增效剂和载体组成；其中，所述的增效剂选自植物生长激素、诱抗剂或具有杀线虫效果的无机盐中的任意一种或多种；所述的植物生长激素为吲哚乙酸、2,4-D、萘乙酸或吲哚丁酸中的任意一种或多种；按质量百分比计，吲哚乙酸占制剂总量的0.00001-0.005％；2,4-D占制剂总量的0.00005-0.005％；萘乙酸占制剂总量的0.00001-0.001％；吲哚丁酸占制剂总量的0.0003-0.0008％；
所述的诱抗剂为草酸或水杨酸；按质量百分比计，草酸占制剂总量的0.05-0.15％；水杨酸占制剂总量的0.001-0.01％；
所述的无机盐是CuSO4或铵盐；所述的铵盐是(NH4)2SO4、NH4Cl或NH4NO3；按质量百分比计，无机盐占制剂总量的0.1-2.2％。
2.按照权利要求1所述的复合微生物制剂，其特征在于：吲哚乙酸占制剂总量的0.0001-0.001％；萘乙酸占制剂总量的0.00001-0.0001％；吲哚丁酸占制剂总量的0.0003-0.0005％。
3.按照权利要求2所述的复合微生物制剂，其特征在于：吲哚乙酸占制剂总量的0.001％；吲哚丁酸占制剂总量的0.0005％。
4.按照权利要求1所述的复合微生物制剂，其特征在于：草酸占制剂总量的0.05-0.1％。
5.按照权利要求1所述的复合微生物制剂，其特征在于：按质量百分比计，无机盐占制剂总量1.0-1.1％。
6.一种制备权利要求1-5任何一项所述复合微生物制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：将各组分混合均匀，干燥，粉碎过筛，即得。
7.权利要求1-5任何一项所述复合微生物制剂在防治植物根结线虫中的用途。
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