CN102286421A

CN102286421A - 淡紫拟青霉的液体发酵培养方法

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Publication number: CN102286421A
Application number: CN201110274968XA
Authority: CN
Inventors: 汪来发; 朴春根; 王曦茁; 李永; 刘春秀; 郭民伟; 田国忠; 林彩丽
Original assignee: Research Institute of Forest Ecology Environment and Protection of Chinese Academy of Forestry
Current assignee: Research Institute of Forest Ecology Environment and Protection of Chinese Academy of Forestry
Priority date: 2011-09-16
Filing date: 2011-09-16
Publication date: 2011-12-21

Abstract

本发明公开了一种淡紫拟青霉的液体发酵培养方法，包括：制备淡紫拟青霉孢子悬浮液；制备淡紫拟青霉的液体发酵培养基；向液体发酵培养基中接种淡紫拟青霉孢子悬浮液，发酵培养；所述液体发酵培养基的组成成分包括碳源和氮源；所述的碳源选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉或玉米粉中的任一种或多种；所述的氮源选自硝酸钠、硫酸铵、蛋白胨或黄豆粉中的任一种或多种。本发明对淡紫拟青霉的发酵培养的各工艺参数，包括培养基的组成成分和用量、培养基的初始pH值、孢子悬液的接种量、发酵培养的温度和转速等进行了筛选和优化，获得了最适宜产孢的各工艺参数。本发明发酵培养方法孢子产量高、生产成本相对较低，适用于规模化生产淡紫拟青霉菌剂。

Description

淡紫拟青霉的液体发酵培养方法

技术领域

本发明涉及一种真菌的液体发酵培养方法，尤其涉及淡紫拟青霉(P.lilacinus)的液体发酵培养方法，属于淡紫拟青霉的液体发酵培养领域。

背景技术

淡紫拟青霉(P.lilacinus)属半知菌纲、丝孢菌目、丝孢菌科、拟青霉属，广泛分布于世界各地，具有功效高、寄主广、易培养等优点。淡紫拟青霉是目前防治植物寄生线虫的主要天敌真菌之一，极具研究和开发价值。淡紫拟青霉是南方根结线虫与白色胞囊线虫卵的有效寄生菌，对南方根结线虫的卵寄生率高达60％-70％。对多种线虫都有防治效能，其寄主有根结线虫、胞囊线虫、金色线虫、异皮线虫、甚至人畜肠道蛔虫，是防治根结线虫的生防制剂。淡紫拟青霉也能分泌毒素对线虫起毒杀作用。此外，还有部分淡紫拟青霉对植物病原菌具有拮抗效能。

在淡紫拟青霉的培养过程中，尤其是在液体深层发酵过程中，淡紫拟青霉能分泌大量的对线虫起杀毒作用的毒素(CAYREL JC.et al.Study of the nematocidal properties of the culture filtrate of thenematophagous fungus Paecliomyces lilacimus(J).RevudedNematologie.1989.12：331-336)。

现有的淡紫拟青霉的发酵培养和发酵工艺的研究还很不成熟，存在着许多急需解决的问题，例如，随着培养基的组成、碳源、氮源、C/N和湿度、光照、温度等因子的改变而诱发的菌株变异问题，导致菌丝生长速度加快但产孢量下降，其生防效果也随之下降。采取合理的发酵培养基质和发酵工艺，不但可以有效解决菌株变异问题，对于提高孢子产率进而实现规模化生产也十分重要。因此，为了提高液体发酵中淡紫拟青霉的孢子产量，需要对发酵培养基的组成及液体发酵条件等工艺参数进行优化和筛选以最大限度的提高淡紫拟青霉的孢子产量。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，以产孢量为考核指标，对淡紫拟青霉的液体发酵培养过程中的C、N源营养需求，培养温度，pH值条件，溶氧状况等条件进行优化或考察，获得液体发酵培养基的最佳组成或最适宜的发酵条件，有效提高淡紫拟青霉的孢子产量、降低生产成本低，为大规模杀线菌剂的研制和规模化生产提供技术支撑。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种淡紫拟青霉的液体发酵培养方法，包括：制备淡紫拟青霉孢子悬浮液；制备淡紫拟青霉的液体发酵培养基；向液体发酵培养基中接种淡紫拟青霉孢子悬浮液，发酵培养，即得；其中，所述的液体发酵培养基的组成成分包括碳源和氮源；所述的碳源包括但不限于葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉或玉米粉中的任一种或多种，优选为葡萄糖、可溶性淀粉或玉米粉，更优选为葡萄糖；其中，所述碳源的用量优选为40.0g/L。

所述的氮源包括但不限于硝酸钠、硫酸铵、蛋白胨或黄豆粉中的任一种或多种；优选为硝酸钠、硫酸铵或黄豆粉中的一种或多种；更优选的，所述氮源由硝酸钠、硫酸铵和黄豆粉组成；所述氮源的用量优选为10.0-20.0g/L；其中，NaNO₃的用量优选为5.0-10.0g/L，进一步优选为5.0-6.0g/L，更优选为5.0g/L；(NH₄)₂SO₄的用量优选为2.5-5.0g/L，进一步优选为2.5-2.8g/L，更优选为2.5g/L；黄豆粉的用量优选为2.5-5.0g/L，进一步优选为2.5-2.8g/L，更优选为2.5g/L。

为了达到更好的技术效果，所述液体发酵培养基中还可含有无机盐；其中，所述的无机盐包括但不限于磷酸二氢钾或七水硫酸镁；所述无机盐的用量优选为0.5-1.5g/L，更优选为1.5g/L。

本发明通过大量的实验发现，液体发酵培养基的初始pH值对于淡紫拟青霉的孢子产量有着非常显著的影响，当液体发酵培养基的初始pH值为3-9时均能产孢；本发明通过进一步的实验发现，液体发酵培养基的初始pH值在5.0-7.0，尤其当初始pH值为5.0-5.5时，淡紫拟青霉的孢子产量相对较高；当液体发酵培养基的初始pH值是5.0时，淡紫拟青霉的产孢量达到最高，相比于其它pH值的产孢量有显著性差异。

淡紫拟青霉对氧的需求有一定的限制，本发明人通过进一步的实验发现，液体培养基在摇瓶中的装液量对于孢子产量也有一定的影响，摇瓶装量对产孢量有显著影响，在发酵过程中，装量应控制在合适的范围内，装量过低、过高不但不适合产孢而且还会造成资源的浪费。500mL的摇瓶中培养基的装量为100mL和200mL时较适合产孢，装量在50mL时产孢量较低，装量在300mL和400mL时产孢量也显著降低，最终，本发明通过试验发现液体培养基的摇瓶装量为200mL(500mL的摇瓶)(占摇瓶体积的40％(v/v))时，产孢子量为最高。

孢子悬液的接种量对产孢量也有一定影响，本发明发现当接种量相对较低时，增加接种量产孢量明显增加，当接种量由1.0％增加至2.0％时，产孢量增加近1倍，而当接种量由3.0％增加至5.0％时，产孢量增长趋势相对减弱。因此，在发酵过程中选择3.0％～5.0％的接种量，尤其为4.5％～5.0％的接种量较为适宜，最有利于提高孢子产量。

淡紫拟青霉在24℃-30℃范围内均能生长产孢，但随着温度的升高，产孢高峰出现的时间相应推迟，所以温度过低或过高均不适宜孢子的产生。本发明通过试验发现，在发酵培养中，发酵培养温度为25℃-27℃较适宜产孢，进一步的试验发现，当发酵培养温度为26℃时最适宜产孢，在此温度下进行发酵培养产孢量接近60×10⁷个/ml。

此外，本发明人通过试验发现，在发酵培养过程转速的高低对产孢量有非常显著的影响。本发明通过优化试验发现，摇床转速为80-250r/min时都可产孢。为了摸索出最适宜的转速条件以最大限度的提高孢子产量，本发明对转速进行了反复优选，最终发现当摇床转速为180-240r/min时较为适宜产孢，进一步的试验发现，当摇床转速为220r/min时，产孢量达到最高。

本发明对淡紫拟青霉的发酵培养的各工艺参数，包括培养基的组成成分和用量、培养基的初始pH值、孢子悬液的接种量、发酵培养的温度和转速等，进行了筛选和优化，最终摸索出了最适宜产孢的各工艺参数，本发明发酵培养方法孢子产量高、生产成本相对较低。

附图说明

图1基础培养基试验各组产孢量比较结果。

图2基础培养基试验各组生物量比较结果。

图3试验各组发酵终点pH值比较结果。

图4复合培养基条件下产孢量结果。

图5无机盐对产孢量的影响。

图6摇瓶装量对产孢量的影响。

图7接种量对产孢量的影响。

图8温度对产孢量的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实验例淡紫拟青霉液体发酵培养各工艺参数的优化筛选实验

1、实验方法

1.1基础培养基的选项

1.1.1菌种

淡紫拟青霉(P.lilacinus)菌株购自中国林业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为：cfcc 86080。

1.1.2材料

C源：葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，可溶性淀粉，玉米粉；

N源：硝酸钠，硫酸铵，蛋白胨，黄豆粉；

无机盐：磷酸二氢钾，硫酸镁；

1.1.3方法

培养基组合：对以上碳源，氮源进行全排列组合，组成20种培养配方(见表1)。

培养基配比(克/升，g/L)：碳源40，氮源20，无机盐0.5。

菌种制备：取15mL质量浓度为0.005g/L的吐温80倒入经PDA培养5d的淡紫拟青霉平板中，用无菌水洗下孢子，振荡，混匀制成孢子悬浮液。

培养条件：500mL三角瓶中装入培养基200mL，121℃湿热灭菌30min，冷却至室温，用体积浓度为0.5mol/L的HCl和NaOH调节初始pH值为6.0。在无菌条件下，接种孢子悬浮液，接种量为2％(v/v)，置25℃摇床160r/min培养，每处理设3次重复。

表1 20组培养基C、N源配合

代码	C、N组合	代码	C、N组合	代码	C、N组合
						A1	葡萄糖+(NH₄)₂SO₄	B1	蔗糖+(NH₄)₂SO₄	C1	淀粉+(NH₄)₂SO₄
A2	葡萄糖+黄豆粉	B2	蔗糖+黄豆粉	C2	淀粉+黄豆粉
						A3	葡萄糖+NaNO₃	B3	蔗糖+NaNO₃	C3	淀粉+NaNO₃
A4	葡萄糖+蛋白胨	B4	蔗糖+蛋白胨	C4	淀粉+蛋白胨
						D1	麦芽糖+(NH₄)₂SO₄	E1	玉米粉+(NH₄)₂SO₄
D2	麦芽糖+黄豆粉	E2	玉米粉+黄豆粉
						D3	麦芽糖+NaNO₃	E3	玉米粉+NaNO₃
D4	麦芽糖+蛋白胨	E4	玉米粉+蛋白胨

1.2复合培养基的筛选

1.2.1培养基

根据基础培养基筛选的结果，选择适合产孢的C、N源，筛选出3种复合培养基配方，用a，b，c表示不同培养基配方，产孢量和基础培养基进行比较。

基础培养基(g/L)：葡萄糖40，NaNO₃20，KH₂PO₄0.5，MgSO₄·7H₂O0.5；

复合培养基a(g/L)：葡萄糖40，NaNO₃10，(NH₄)₂SO₄10，KH₂PO₄0.5，MgSO₄·7H₂O 0.5；

复合培养基b(g/L)：葡萄糖40，NaNO₃10，(NH₄)₂SO₄5，黄豆粉5，KH₂PO₄0.5，MgSO₄·7H₂O 0.5；

复合培养基c(g/L)：葡萄糖40，NaNO₃10，(NH₄)₂SO₄5，黄豆粉5，肌醇0.1，生物素0.03，KH₂PO₄0.5，MgSO₄·7H₂O 0.5。

1.2.2培养条件

其菌种制备和培养方法同(1.1.3)的方法。接种后摇床同批培养，以产孢量作为筛选标准，筛选出最佳复合培养基。

1.3培养条件的选择

1.3.1无机盐对产孢量的影响

在筛选出的基础培养基和复合培养基中分别添加及不添加无机盐(KH₂PO₄0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L)，其它培养条件同1.1.3，设3个重复，接种后摇床同批培养(下同)。

1.3.2.初始pH对产孢量的影响

以复合培养基b为发酵培养基，用体积浓度为0.5mol/L灭菌的HCl和NaOH将初始pH值分别调为3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，接种后摇床同批培养。

1.3.3摇瓶装量对产孢量的影响

以复合培养基b为发酵培养基，摇瓶装量分别为50mL，100mL，200mL，300mL，400mL，接种量为5％(v/v)，接种后摇床同批培养。

1.3.4接种量对产孢量的影响

以复合培养基b为发酵培养基，摇瓶装量为200mL，接种量分别为1％，2％，3％，5％(v/v)，接种后摇床同批培养。

1.3.5发酵温度对产孢量的影响

以复合培养基b为发酵培养基，设温度为24℃，26℃，28℃，30℃，接种量为5％(v/v)，接种后摇床同批培养。

1.3.6摇床转速对产孢量的影响

以复合培养基b为发酵培养基，接种量为5％(v/v)，发酵温度为26℃，接种后分别按照以下的摇床转速进行发酵培养：80r/min、100r/min、150r/min、180r/min、200r/min、220r/min、240r/min、250r/min。

1.4.发酵条件的优化选择

1.4.1试验因子各水平设计

对A碳源、B氮源、C接种量、DpH值、E无机盐、F装量、G转速七因素三水平进行L₁₈(37)的正交设计

表2试验因素水平表

1.4.2培养方法

各组试验的实施按照正交试验具体计划进行，菌种制备：取15mL质量浓度为0.005g/L的吐温80倒入经PDA培养5d的淡紫拟青霉平板中，用无菌水洗下孢子，振荡，混匀制成孢子悬浮液。每组试验处理设3次重复。

1.5淡紫拟青霉代谢特性的发酵参数优选

分别在基础培养基、复合培养基和优化培养基下：自发酵24h开始，每隔12h取发酵液进行孢子数量、生物量、pH值、还原糖、氨基氮含量的测量，并绘制必要的曲线。

孢子数目：发酵液稀释一定倍数后用血球计数板计数。

生物量：发酵液抽滤，60℃干燥至恒重。

还原糖测定：采用3，5-二硝基水杨酸法。

氨基氮(NH₂N)测定：采用甲醛滴定法进行测定。

pH值：采用PHB-4型便携式酸度剂测定。

2、实验结果和分析

2.1基础培养基选择结果

2.1.1产孢量比较

从图1淡紫拟青霉不同培养基产孢量可见，A1，A3，C3，E3的C、N组合培养基产孢量相对较高，而A1组产孢量最高为15.5×10⁷个/mL，C3组产孢量居于其次为13.3×10⁷个/mL。产孢量较高的这四组培养基条件下产孢顺序是A1＞C3＞E3＞A3。其它组合的产孢量相对较低，可见以葡萄糖+(NH₄)₂SO₄和淀粉+NaNO₃组合的培养基适合产孢，经过综合考虑，本发明最优选A1为基础培养基。

2.1.2生物量产量比较

比较不同培养基终点生物量(图2)，A1，A3，C3，E3产孢量较高的培养基组合条件下，终点生物量都明显偏低，都低于1.0g/100mL，而产孢量不高的其他组合生物量大多较高，最高可达到3.565g/100mL。所以对于淡紫拟青霉，适合营养生长的培养基生物量高而相对情况下也就抑制了孢子的产量。

2.1.3发酵终点pH值比较

发酵终点pH值按照培养基组合较有规律的变化(图3)。每组培养基组合中1、2号的终点pH值均偏低，在2.32～3.67之间，而每组3，4号培养基pH值较高在5.05～7.84之间，这可能和选取的N源有关，1、2号的组合选取的N源为(NH₄)₂SO₄和黄豆粉；3、4号的组合选取的N源为硝酸钠和蛋白胨。所以，发酵过程中选取合适的N源，随着发酵的继续，对于保证菌株可以在最佳的pH值范围内生长产孢很有必要。

2.2复合培养基的筛选结果

如图4所示，相对于基础培养基，b、c两组复合培养基产孢量均提高，而复合培养基a的产孢量却远远低于基础培养基，其氮源是NaNO₃10g/L，(NH₄)₂SO₄10g/L，可见这两种氮源的组合不适合产孢。b组培养基相对a组增加了1种氮源，氮源配比为NaNO₃10g/L，(NH₄)₂SO₄5g/L和黄豆粉5g/L。可见增加的黄豆粉作为有机氮源使产孢量大大提高。c组培养基是在b组培养基的基础上添加了肌醇和生物素，可以看出添加这两种物质并没有提高产孢量，其原因可能是该组培养基营养物质丰富使该菌偏向营养生长而抑制了产孢量。本发明最终优选b组为优化的复合培养基配方。

2.3无机盐对产孢量的影响

无机盐对产孢量有显著的影响(图5)，添加和不添加无机盐KH₂PO₄0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，对产孢量影响显著，在不添加无机盐的情况下产孢量明显降低，基础培养基不加无机盐比基础加盐产孢量下降了56％，而复合培养基不加盐比复合培养基加盐产孢量下降了73％。所以，本发明发现，在复合培养基中添加无机盐是十分重要的。

2.4初始pH值对产孢量的影响

淡紫拟青霉有较广的生长适宜pH值范围，pH值从3-9均能产孢。但初始pH值在5.0-7.0时产孢量较高。pH值低于5.0或高于7.0，产孢量均受到不同程度的抑制，其中，当初始pH值为5.0时，产孢量达到了最高(表3)。

表3

2.5摇瓶装量对产孢量的影响

摇瓶装量对产孢量有显著影响(图6)，装量为100mL和200mL时较适合产孢，装量在50mL时产孢量较低，装量在300mL和400mL时产孢量也降低，所以，淡紫拟青霉对氧的需求有一定的限制，摇瓶装量为200mL(40％，v/v)时最适合产孢。在发酵过程中，装量应控制在合适的范围内，装量过低、过高不但不适合产孢而且还会造成资源的浪费。

2.6接种量对产孢量的影响

从图7可以看出，接种量对产孢量有一定影响，当接种量相对较低时，增加接种量产孢量明显增加，当接种量由1％增加至2％时，产孢量增加近1倍，而当接种量由3％增加至5％时，产孢量增长趋势相对减弱。因此，在发酵过程中选择3％～5％的接种量较为适宜。

2.7温度对产孢量的影响

淡紫拟青霉在24℃～30℃范围内均能生长产孢。进一步的试验发现，当发酵温度为25℃-27℃时较为适宜产孢，其中，当发酵温度为26℃最适宜其产孢，产孢量可达到60×10⁷个/ml。但是，随着温度的进一步升高，产孢高峰出现的时间相应推迟，所以温度过低或过高均不适宜孢子的产生。

2.8摇床转速对产孢量的影响

试验结果见表4。

从试验结果可见，当摇床转速为180-240r/min时，产孢量与其它转速的产孢量有显著提升(p＜0.01)，其中，当转速为220r/min时，产孢量达到了最高。

2.9正交试验结果

2.9.1产孢量比较

表5正交试验各组产孢量

由表5产孢量结果可见，试验组7产孢量较高，达到了66.13×10⁷个/mL，其产量比基础培养基高出4倍多，比复合培养基b提高了近0.36％。试验组7的液体发酵培养基组成及发酵条件是：葡萄糖40g/L，NaNO₃5g/L，(NH₄)₂SO₄2.5g/L，黄豆粉2.5g/L，无机盐1.5g/L(KH₂PO₄1.5g/L或MgSO₄·7H₂O 1.5g/L)，液体发酵培养基在摇瓶中的装液体积占摇瓶体积的40％(每500mL摇瓶装量为200mL)，接种量为5％(v/v)，液体发酵培养基的初始pH值5，转速为220r/mim。试验各组经分析，各重复组变异系数差异较大，试验组1和5变异系数分别为26.51％和33.99％。产孢量高的试验组7各重复变异系数为5.74％，可见，在试验组7的试验条件下，产孢量高且较为稳定。

表6极差分析表

表7方差分析结果

α＝0.05

正交试验经方差分析，pH值和转速的3个水平对孢子产量的影响显著。碳源、氮源、无机盐、接种量、装量各水平的改变对产孢量影响不显著。

试验结果经极差分析，碳源的最佳水平是水平3，即：40g/L的葡萄糖较好；

氮源的最佳水平是1，即氮源的用量优选为10g/L；

接种量选择3水平，即：5.0％(v/v)的接种量为最适宜；

pH值对产孢量影响显著，初始pH值选择1水平，即：初始pH值为5.0。

无机盐选择水平3，即：1.5g/L的无机盐较为适宜。

装量选择水平2，即：装量控制在40％(v/v)。

从试验结果看，转速对产孢量影响显著；220r/min的转速产孢量较高，所以选择水平3。

从极差分析试验因子对淡紫拟青霉孢子产量影响的主次顺序为：D＞G＞A＞F＞E＞C＞B。本试验所得的最优发酵条件

A₃B₁C₃D₁E₃F₂G₃。

Claims

1.一种淡紫拟青霉(P. lilacinus)的液体发酵培养方法，包括：制备淡紫拟青霉孢子悬浮液；制备淡紫拟青霉的液体发酵培养基；向液体发酵培养基中接种淡紫拟青霉孢子悬浮液，发酵培养；其特征在于：所述的液体发酵培养基的组成成分包括碳源和氮源；所述的碳源选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉或玉米粉中的任一种或多种；所述的氮源选自硝酸钠、硫酸铵、蛋白胨或黄豆粉中的任一种或多种。

2. 按照权利要求1所述的液体发酵培养方法，其特征在于：所述的碳源是葡萄糖；所述氮源由硝酸钠、硫酸铵和黄豆粉组成。

3. 按照权利要求1或2所述的液体发酵培养方法，其特征在于：所述碳源的用量为40.0 g/L；所述氮源的用量为10.0-20.0g/L。

4. 按照权利要求2所述的液体发酵培养方法，其特征在于：所述NaNO₃ 的用量为5.0-10.0 g/L，优选为5.0-6.0 g/L；所述(NH₄)₂SO₄的用量为2.5-5.0g/L，优选为2.5-2.8 g/L；所述黄豆粉的用量为2.5-5.0 g/L，优选为2.5-2.8g/L。

5. 按照权利要求1-4任何一项所述的液体发酵培养方法，其特征在于：所述液体发酵培养基中含有无机盐。

6. 按照权利要求5所述的液体发酵培养方法，其特征在于：所述的无机盐是磷酸二氢钾或七水硫酸镁；优选的，所述无机盐的用量为0.5-1.5 g/L。

7. 按照权利要求1所述的液体发酵培养方法，其特征在于：将液体发酵培养基的初始pH值调为5.0-7.0后接种淡紫拟青霉孢子悬浮液进行发酵培养；优选的，将液体发酵培养基的初始pH值调为5.0-5.5后接种淡紫拟青霉孢子悬浮液进行发酵培养；更优选的，将液体发酵培养基的初始pH值调为5.0后接种淡紫拟青霉孢子悬浮液进行发酵培养。

8. 按照权利要求1所述的液体发酵培养方法，其特征在于：按v/v计，液体发酵培养基在摇瓶中的装液体积占摇瓶体积的40%。

9. 按照权利要求1所述的液体发酵培养方法，其特征在于：按v/v计，所述的接种量为3.0％-5.0％，优选为4.5％-5.0％。

10. 按照权利要求1所述的液体发酵培养方法，其特征在于：所述的发酵培养条件为：发酵温度为24℃-30℃，优选为25℃-27℃，更优选为26℃；摇床转速为80-250 r/min，优选为180-240 r/min，更优选为220 r/min。