CN104212722A - 一株淡紫拟青霉及其培养方法和在作物病虫防治上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种淡紫拟青霉菌株及其培养方法和应用。该淡紫拟青霉菌株为淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)CPLI0708，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.8450。该淡紫拟青霉菌株的培养方法步骤：A、菌株活化：在PDA斜面上划线培养活化菌株；B、菌株液体发酵培养：将活化好的菌株转入装有液体培养基的三角瓶中，振荡培养：C、菌株固体发酵培养：将载体、营养基质和水按体积混合均匀制成固体发酵培养基，装入保鲜袋，接种液体发酵种子，搅拌均匀后培养。该菌株分生孢子对温室蚜虫、粉虱等刺吸式害虫具有很强的杀虫效果，发酵液对大豆孢囊线虫幼虫具有强致死作用，可用于无公害蔬菜的生产。
Description
技术领域
本发明涉及一株淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)菌株及其培养方法，及其在防治保护地害虫蚜虫、粉虱和大豆孢囊线虫中的应用。
背景技术
我国保护地蔬菜有五千多万亩的种植面积，保护地蔬菜是北方居民冬春季的主要蔬菜来源，具有重要的国民经济意义。冬春蔬菜保护地主要发生的害虫为粉虱(白粉虱和烟粉虱等)、蚜虫(瓜蚜等)，常年危害产量损失在30％以上。目前防治保护地害虫的主要手段是化学防治，如喷洒有机磷、菊酯及吡虫啉等化学农药，这些农药的大量使用造成了严重的农产品农药残留超标和农田环境污染。大豆是我国重要的蔬菜作物和油料经济作物，种植面积达1亿亩，具有极其重要的国民经济价值。大豆孢囊线虫(Heterodera glycines Ichinohe)是大豆在生产过程中最重要的病害之一，被称为大豆的“癌症”，严重影响了大豆的产量与品质。由于迄今为止没有发现对其具有明显抗病性的种质资源，大豆孢囊线虫病仍然是农业生产中的世界性难题。目前，大豆孢囊线虫的防治主要依靠化学农药，如二溴氯丙烷、二溴乙烷、呋喃丹等，这些防治线虫的化学农药多是高毒农药。
随着生活水平的不断提高，人们对食品质量的要求越来越高，对食品安全和环境污染问题越来越关注，无公害食品和绿色食品生产应运而生。同时，食品安全问题往往是国际农产品贸易壁垒中的筹码，贯彻绿色植保非常必要。保护地害虫粉虱、蚜虫和大豆孢囊线虫繁殖力强，易对化学药剂产生抗药性，迫切需要发展绿色防控来替代或减少化学农药的使用。作为生物农药，生防真菌不同于化学农药，具有全新的作用机理、对环境无污染、无残留，是农业病虫害绿色防控体系的重要组成部分。本发明针对这一农业生产的重要需求而研发，发现一株高效生防真菌，研究了该菌株的生物学特性和应用技术。
发明内容
为了防治保护地蚜虫、粉虱和大豆孢囊线虫等害虫，本发明的首要目的在于提供一种淡紫拟青霉菌菌株。
本发明的另一目的在于提供一种淡紫拟青霉菌的培养方法。
本发明的再一个目的在于提供一种淡紫拟青霉菌在作物病虫防治上的应用。
为了实现以上目的，本发明采用如下技术措施：
(1)一种淡紫拟青霉菌的获得及生物学特性：
将我国河北省廊坊市采集的土样，用无菌水稀释后，涂布于加有多果定和链霉素的培养基上，置于25℃，培养3～5天，挑取单菌落转移到斜面上获得菌株，申请人将其命名为淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708。该淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708于2013年11月11日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏号为CGMCCN0.8450，分类命名为淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708。
菌株形态鉴定特征：淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708在25℃培养3天后，在PDA平板上菌落呈白色，产孢后逐渐变成浅粉红色，培养7d后，菌落呈紫红色、圆形、隆起、粉状，表面没有分泌物。淡紫拟青霉的分生孢子梗末端膨大。分生孢子为单细胞，椭圆形至纺锤形，呈链状、平滑、无色至黄色，2.5μm～4μm宽，孢梗上具有瓶颈状不规则的分枝或轮生分枝，瓶梗基部较宽。
菌株的培养特征：淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708菌株生长温度范围可以从12℃～36℃，生长和产孢的最适温度范围是25℃～28℃，10℃和40℃时停止生长，36℃时停止产孢。该菌株在不同培养基上生长和产孢差异较大。
1、在基础培养基(氯化钾0.50g，七水硫酸亚铁0.01g，磷酸氢二钾1.0g，七水硫酸镁0.50g，硝酸钠2g，蔗糖30g，琼脂15g，水1000ml，pH自然)的基础上，用等当量的不同的碳源取代基础培养基中的碳源。淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708菌株的菌落生长及产孢特性如下。
淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708菌株7天在葡萄糖培养基上菌落直径为1.845cm，麦芽糖培养基上为2.643cm，蔗糖培养基上为1.796cm，可溶性淀粉培养基上为1.982cm，乳糖培养基上为1.945cm，甘油培养基上为1.935cm。
淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708菌株13天在葡萄糖培养基上产孢量为3.264×109个孢子／ml，麦芽糖上为20.88×109个孢子／ml，蔗糖上为1.968×109个孢子／ml，可溶性淀粉上为5.088×109个孢子／ml，乳糖上为3.984×109个孢子／ml，甘油上为2.64×109个孢子／ml。
表1不同碳源上淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708菌株的菌落生长特征
注：表中数据为5次重复的平均值±标准误(S.E)
表2不同碳源上淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708菌株的产孢特征
注：表中数据为5次重复的平均值±标准误(S.E)
2、用麦芽糖替代基础培养基中的蔗糖，以等当量的5种氮源[蛋白胨、硝酸钾、硫酸铵、脲(尿素)和酵母浸粉]分别替代基础培养基中的硝酸钠(以硝酸钠作对照)。在不同氮源的琼脂培养基上，淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708菌株的菌落生长及产孢特性如下。
淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708菌株培养7天，在硝酸钾培养基上的菌落直径为2.072cm，在硫酸铵培养基上的菌落直径为1.916cm，在蛋白胨培养基上的菌落直径为2.431cm，在酵母浸粉培养基上的菌落直径为2.621cm，在脲培养基上的菌落直径为2.212cm，在硝酸钠培养基上的菌落直径为1.712cm。
淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708菌株培养13天，在硝酸钾培养基上产孢为18.72×108个孢子／ml，在硫酸铵培养基上产孢为7.2×108个孢子／ml，在蛋白胨培养基上产孢为31.2×108个孢子／ml，在酵母浸粉培养基上产孢为11.04×108个孢子／ml，在脲培养基上产孢为19.68×108个孢子／ml，在硝酸钠培养基上产孢为10.08×108个孢子／ml。
表3不同氮源上淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708菌株的菌落生长特征
注：表中数据为5次重复的平均值±标准误(S.E)
表4不同氮源上淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708菌株的产孢特征
注：表中数据为5次重复的平均值±标准误(S.E)
3、在改良的PDA培养基(马铃薯200g／L，葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，琼脂20g／L，加蒸馏水定容1000ml)上，不同温度下淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708菌株的菌落和产孢特性：
淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708菌株在改良的PDA培养基上，15℃下的菌落生长直径为0.632cm，19℃下的菌落生长直径为1.077cm，23℃下的菌落生长直径为1.389cm，27℃下的菌落生长直径为1.4cm，29℃下的菌落生长直径为2.202cm，31℃下的菌落生长直径为1.932cm。
淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708菌株在在改良的PDA培养基上，15℃下的产孢为11.79×106个孢子／ml，19℃下的产孢为8.73×106个孢子／ml，23℃下的产孢为56.16×106个孢子／ml，27℃下的产孢为35.46×106个孢子／ml，29℃下的产孢为116.888×106个孢子／ml，31℃下的产孢为107.46×106个孢子／ml。
表5不同温度下淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708菌株的菌落生长特征
注：表中数据为5次重复的平均值±标准误(S.E)
表6不同温度下淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708菌株的产孢特征
注：表中数据为5次重复的平均值±标准误(S.E)
(2)一种淡紫拟青霉菌的培养方法及效果：
1、淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708的活化：将淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708菌株划线培养于PDA斜面上，于25℃条件下培养6d～8d；
2、淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708的液体发酵培养：将5ml无菌水倒入活化的淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708菌株斜面上，用旋涡震荡器将真菌孢子洗下获得孢子悬浮液，将孢子悬浮液接种到装有200ml液体培养基(葡萄糖25g，酵母浸粉20g，蒸馏水1000ml)的500ml三角瓶中，于180rmp／min，25℃条件下振荡培养2d～3d；
3、淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708的固体发酵培养：将载体、营养基质和水按体积比6：1：1混合均匀制的固体发酵培养基，按每袋200ml装入聚乙烯保鲜袋，121℃灭菌0.5h～1h，冷却后，将步骤2的淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708液体发酵菌液按5％～10％的体积比接种到固体发酵培养基中，再次搅拌均匀，26℃～28℃培养6d～10d。
4、在上述培养方法下，淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708菌株的固体发酵特性：
淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708菌株在玉米营养基质下，陶球载体的产孢量为2.88×108个／克基质，孢子萌发率为97.1％；在大米营养基质下，陶球载体的产孢量为2.16×108个／克基质，孢子萌发率为99.1％。
表7营养基质和载体对蜡蚧轮枝菌发酵产孢的影响
注：表中数据为5次重复的平均值±标准误(S.E)
(3)一种淡紫拟青霉在作物病虫防治上的应用：
淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708菌株产生的分生孢子，对温室害虫粉虱和蚜虫具有高侵染能力，孢子能附着在害虫的表皮，并萌发产生芽管，菌株借助芽管从昆虫的节间膜侵入，继而消化和破坏昆虫的组织，杀死昆虫。淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708菌株分生孢子可配制成可湿性粉剂进行植物叶面喷雾杀虫，其配方组成含量比例(重量比)为：淡紫拟青霉菌纯孢粉(含孢子95％)10％、葡萄糖(粉末)2％、木质素磺酸钠1％、淀粉3％，分散剂WLND1004％、湿润剂SW3％、白炭黑78％，均匀混合而成。田间应用时将该制剂加水稀释1500倍，其悬浮液中蜡蚧轮枝菌孢子的浓度为106个／ml,使用大容量喷雾器均匀喷洒在有害虫(粉虱、蚜虫)的植物表面，在相对湿度85％的保护地环境中，对粉虱、蚜虫、蓟马6天的寄生率达到90％。淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708菌株发酵产生的次生代谢物对于大豆孢囊线虫具有高毒力。发酵液配制液体制剂浇灌施用可用于防治大豆孢囊线虫，在100倍稀释条件下，对大豆孢囊线虫二龄幼虫的毒杀率达90％以上，在大田中对大豆孢囊线虫防效超过80％。淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708菌株可有效控制害虫种群，可用于无公害蔬菜和绿色食品蔬菜的生产保护地。
表8淡紫拟青霉不同菌株发酵液稀释100倍后对大豆孢囊线虫二龄幼虫的毒杀活性
注：表中数据为5次重复的平均值±标准误(S.E)
表9淡紫拟青霉不同菌株发酵液处理对大豆田孢囊线虫的效果
注：表中数据为5次重复的平均值±标准误(S.E)
具体实施方式
实施例1：真菌菌株孢子的大量培养技术
将该菌株的菌种在25℃的摇瓶中培养40h～50h，将其作为种子，按8％的体积量接到玉米粉与陶球组成的固体培养上，25℃无菌袋内培养7天，开袋培养2天。培养结束后，35℃的烘房中烘干2天，粉碎烘干的培养物，过筛(250目、320目、400目)，即可得到纯孢粉(含孢子95％)。
实施例2：防治保护地蔬菜温室白粉虱和蚜虫
将生产所得到的纯孢粉，按：纯孢粉(含孢子95％)10％、葡萄糖(粉末)2％、木质素磺酸钠1％、淀粉3％，分散剂BD553％、湿润剂BENOL790A3％、硅藻土78％，均匀混合而成。即可为田间应用制剂。制剂加水1500倍稀释，喷雾防治温室白粉虱，当室内温度为23-27℃，相对湿度85％以上时，6天对害虫的寄生率达到90％。
实施例3：防治大豆田孢囊线虫病
室内发酵采用装有液体培养基(工业葡萄糖25g，酵母浸粉20g，豆饼粉35g、NaNO33g，K2HPO41.5g，MgSO41g，FeSO40.02g蒸馏水1000ml)的5L三角瓶，于180rmp／min，25℃条件下振荡培养3-5d。大规模工业生产按比例放大即可。真菌发酵液按0.01％体积加入羧甲基纤维素(CMC)，液体制剂稀释100倍后浇灌大豆田土壤，90天后，对大豆孢囊线虫防治效果达到80％。
Claims (4)
1.一种淡紫拟青霉，其特征为淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)CPLI0708，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.8450。
2.权利要求1所述的一种淡紫拟青霉菌株，其特征在于：所述淡紫拟青霉菌株属丝孢目、拟青霉属：在PDA平板上菌落呈白色，产孢后逐渐变成浅粉红色，培养7d后，菌落呈紫红色、圆形、隆起、粉状，表面没有分泌物；淡紫拟青霉的分生孢子梗末端膨大；分生孢子为单细胞，椭圆形至纺锤形，呈链状、平滑、无色至黄色，2.5μm～4μm宽，孢梗上具有瓶颈状不规则的分枝或轮生分枝，瓶梗基部较宽；淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708菌株生长温度范围可以从12℃～36℃，生长和产孢的最适温度范围是25℃～28℃，10℃和40℃时停止生长，36℃时停止产孢；该菌株在不同培养基上生长和产孢差异较大，菌株7天在葡萄糖培养基上菌落直径为1.845cm，麦芽糖培养基上为2.643cm，蔗糖培养基上为1.796cm，可溶性淀粉培养基上为1.982cm，乳糖培养基上为1.945cm，甘油培养基上为1.935cm；菌株13天在葡萄糖培养基上产孢量为3.264×109个孢子／ml，麦芽糖上为20.88×109个孢子／ml，蔗糖上为1.968×109个孢子／ml，可溶性淀粉上为5.088×109个孢子／ml，乳糖上为3.984×109个孢子／ml，甘油上为2.64×109个孢子／ml；菌株培养7天，在硝酸钾培养基上的菌落直径为2.072cm，在硫酸铵培养基上的菌落直径为1.916cm，在蛋白胨培养基上的菌落直径为2.431cm，在酵母浸粉培养基上的菌落直径为2.621cm，在脲培养基上的菌落直径为2.212cm，在硝酸钠培养基上的菌落直径为1.712cm；菌株培养13天，在硝酸钾培养基上产孢为18.72×108个孢子／ml，在硫酸铵培养基上产孢为7.2×108个孢子／ml，在蛋白胨培养基上产孢为31.2×108个孢子／ml，在酵母浸粉培养基上产孢为11.04×108个孢子／ml，在脲培养基上产孢为19.68×108个孢子／ml，在硝酸钠培养基上产孢为10.08×108个孢子／ml；菌株在改良的PDA培养基上，15℃下的菌落生长直径为0.632cm，19℃下的菌落生长直径为1.077cm，23℃下的菌落生长直径为1.389cm，27℃下的菌落生长直径为1.4cm，29℃下的菌落生长直径为2.202cm，31℃下的菌落生长直径为1.932cm；菌株在在改良的PDA培养基上，15℃下的产孢为11.79×106个孢子／ml，19℃下的产孢为8.73×106个孢子／ml，23℃下的产孢为56.16×106个孢子／ml，27℃下的产孢为35.46×106个孢子／ml，29℃下的产孢为116.888×106个孢子／ml，31℃下的产孢为107.46×106个孢子／ml。
3.权利要求1所述的一种淡紫拟青霉的培养方法，其步骤是：
A、淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708的活化：将淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708菌株划线培养于PDA斜面上，于25℃条件下培养6d～8d；
B、淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708的液体发酵培养：将5ml无菌水倒入活化的淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708菌株斜面上，用旋涡震荡器将真菌孢子洗下获得孢子悬浮液，将孢子悬浮液接种到装有200ml液体培养基(葡萄糖25g，酵母浸粉20g，蒸馏水1000ml)的500ml三角瓶中，于180rmp／min，25℃条件下振荡培养2d～3d；
C、淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708的固体发酵培养：将载体、营养基质和水按体积比6：1：1混合均匀制的固体发酵培养基，按每袋200ml装入聚乙烯保鲜袋，121℃灭菌0.5h～1h，冷却后，将步骤2的淡紫拟青霉(P.lilacinus)CPLI0708液体发酵菌液按5％～10％的体积比接种到固体发酵培养基中，再次搅拌均匀，26℃～28℃培养6d～10d。
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| 刘春秀等: "淡紫拟青霉液体发酵条件的优化", 《四川农业大学学报》, vol. 30, no. 4, 31 December 2012 (2012-12-31), pages 410 - 414 * |
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