CN106834136B - 淡紫拟青霉及其规模化制备方法 - Google Patents

淡紫拟青霉及其规模化制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种淡紫拟青霉及其规模化制备方法，属于拟青霉的制备技术领域。本发明所述的淡紫拟青霉，该菌株为拟青霉(Paecilomyces)属中的淡紫拟青霉菌株INTR‑2，该菌株的保藏编号为CGMCC No.12080。所述的淡紫拟青霉的规模化制备方法，是采用液固双相发酵工艺，经液体培养基种子发酵及以玉米秸秆为主要原料的固体培养基分盘发酵，固态发酵过程采用中央空调、温控系统和高压微雾加湿器进行控温控湿，发酵产物采用低温烘干后磨料制粉。本发明所述的淡紫拟青霉，其对多种线虫的防治效果好，用于生产高标准有机农产品；同时本发明提供了一种简单易行的规模化制备方法，效率高，成本低。

Description

淡紫拟青霉及其规模化制备方法
技术领域
本发明涉及一种淡紫拟青霉及其规模化制备方法，属于拟青霉的制备技术领域。
背景技术
淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)属半知菌亚门(Deuteromyeotina)、丝孢纲(HypHomyeetes)、丝孢目(HypHomycetales)、丛梗孢科(Monilaeeae)、拟青霉属(Paecilomyces)，是一种高效、广谱的生防真菌，对多种线虫，如根结线虫、胞囊线虫、金色线虫、异皮线虫等，具有良好的防治效果。此外，淡紫拟青霉还具有可适应不同气候条件、对线虫卵具有较高的寄生率、可以有效控制土壤线虫数量、不污染环境、生产原料来源丰富、对人畜无害、靶标生物不容易产生抗药性等优点，是生产高标准有机农产品的首选药剂。
但是，目前生产淡紫拟青霉菌剂的主要培养材料(麸皮、玉米粉、豆粕、米糠等)的成本较高，进而导致淡紫拟青霉产品的售价较高，加上生产过程中产孢量低、孢子活性损伤大等因素，限制了淡紫拟青霉产品的推广及应用。因此，如何实现低成本、高效益的规模化优质生产是淡紫拟青霉菌株应用亟待解决的问题。
玉米是我国主要农作物之一，玉米秸秆除少部分用作饲料外，大部分被焚烧掉，不仅造成环境污染，而且易产生火灾等隐患。
发明内容
本发明的目的在于提供一种淡紫拟青霉，其对多种线虫的防治效果好，用于生产高标准有机农产品；同时本发明提供了一种简单易行的规模化制备方法，效率高，成本低。
本发明所述的淡紫拟青霉，该菌株为拟青霉(Paecilomyces)属中的淡紫拟青霉菌株INTR-2，该淡紫拟青霉菌株已于2016年1月18日，保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，分类命名为淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)，保藏编号为CGMCC No.12080。
淡紫拟青霉菌株是从山东省淄博市沂源县大张庄镇被禾谷孢囊线虫(Heteroderaavenae)侵染的小麦根部土壤中采用Czapek’s培养基涂布分离所得的高产孢菌株。
用所述的淡紫拟青霉防治禾谷孢囊线虫病、金色线虫病或异皮线虫病等病害。
所述的淡紫拟青霉的规模化制备方法，是采用液固双相发酵工艺，经液体培养基种子发酵及以玉米秸秆为主要原料的固体培养基分盘发酵，固态发酵过程采用中央空调、温控系统和高压微雾加湿器进行控温控湿，发酵产物采用低温烘干后磨料制粉。
所述液体培养基由以下重量百分含量的原料制成：玉米粉0.01％-1％，玉米浆0.01％-2％，脲0.01％-1％，葡萄糖0.01％-3％，硫酸铵0.01％-2％，磷酸氢二铵0.01％-2％，酵母粉0.01％-3％。
所述固体培养基由以下重量百分含量的原料制成：玉米秸秆10％-40％，米糠5％-30％，玉米粉30％-85％，硫酸铵0.01％-2％；固体培养基的含水量为30％-70％。
所述的液固双相发酵工艺，是先将淡紫拟青霉株接种到液体培养基中进行种子培养，再采用自动化接种工艺将液体种子接种到以玉米秸秆为主要原料的固体培养基中进行固态发酵，自动化接种工艺中的接种量为1％-15％。
所述分盘发酵是指当淡紫拟青霉进入快速生长期、温度上升到30℃以上时，将半成品曲料转移到不锈钢筛盘中继续发酵。
所述固态发酵过程中，温度控制在20-30℃，湿度控制在80％-99％。
所述低温烘干时，温度控制在25-50℃。
所述生产过程中所有与灭过菌的物料直接或间接接触的设备均是采用纯不锈钢材料或其他不生锈、耐腐蚀、抗老化、易清洗的材料制成。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)固体培养基所用的玉米秸秆来源广泛、价格低廉，大大降低了生产成本。此外，将玉米秸秆变废为宝、环境友好，极具应用前景和推广价值；
(2)所有与灭过菌的物料直接或间接接触的设备都是采用纯不锈钢制作，便于清洗消毒，且耐腐蚀、抗老化，解决了清洗和灭菌的死角问题，经过多次实践检验，实现设备检测零杂菌的突破；
(3)采用蒸球蒸料、接种机自动化接种工艺，在不增加耗能的情况下，劳动效率提高了5倍，每天运行的班次由传统的1个增加至2个，产量翻了10翻，生产效率大幅度提高；
(4)采用液体接种，均匀度大为改观，不再出现局部生长过快或者过慢现象，且增加了物料的湿度，又避免了物料发粘状况；此外，液体接种后可直接分盘发酵，省去堆积培养环节，节省劳动力，增加生产稳定性；
(5)采用分盘发酵的方式，将快速生长期的半成品曲料转移到不锈钢筛盘中继续发酵，增加了物料的表面积，排除二氧化碳等废气，使曲料重新充分与氧气接触，又便于喷水降温、加湿，更好的控制淡紫拟青霉的产酶发孢条件，因为当淡紫拟青霉到达菌丝生长对数期，耗氧量达到峰值，同时产生大量的热与二氧化碳等废气，通风量的增加带走了曲料的部分水分，温度的急剧升高(30℃以上)、废气的大量产生、水分的丢失严重恶化了淡紫拟青霉的生长繁殖条件，导致传统发酵产品的各种酶活力低；
(6)生产过程中，采用中央空调、温控系统、高压微雾加湿器进行严格控温控湿，中央空调的三级空气过滤装置，使进风完全无菌，其中散热器、表冷器的使用，可实现冷暖风的自由输送，实现了温度的自动精准控制；高压微雾加湿器具有耗电少、成本低、雾化效果佳的优点，其产生的水粒子直径仅为1-5μm，在空气中水粒子分布均匀，不产生凝水，运行稳定性好、加湿效率高(最高达到99％)等特点，能精准控湿且易于自动化管理；因此，中央空调、温控系统及高压微雾加湿器的应用解决了传统工艺梅雨季节湿度大、温度高、物料发粘、烧曲坏曲，寒冬季节干燥(北方)、温控效果差、易干曲等难题，实现了固体发酵过程条件的精准控制；
(7)建立了一条全新的低温烘干工艺，提高了烘干效率及孢子活性，烘干车间室内地面安装蒸汽盘管来提高室温；车间密封，阻隔外界潮气进入；进风经过三级空气过滤后，再经过除湿器除湿后方能进入烘干车间，完全阻隔外界杂质杂菌以及潮气进入；室内每100m3设750w风扇一台，增加了室内空气流动性；排风扇两台，及时将湿气、旧风排出；采用新的烘干工艺后，烘干时间由以前的48-72小时，缩短到现在的24-36小时，在提高了烘干效率的同时，也保证了产品质量，成品水分由以前的10％-12％降为6％-8％，同时也避免了出现阴雨天气久烘不干的坏曲现象；
(8)采用本发明所述的规模化制备方法生产淡紫拟青霉，产孢量高达71770亿个/g(干重)，且制备的产品活性高、保存周期长，室温贮藏11个月后孢子萌发率仍能达到90％左右。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不限制本发明的实施。
实施例1
淡紫拟青霉菌株的分离与筛选：
1.Czapek’s培养基(w/v)：
蔗糖3％，NaNO3 0.3％，K2HPO4 0.1％，MgSO4 0.05％，KCl 0.05％，FeSO4 0.001％，琼脂2％，pH6.0～6.5。
2.土壤采样：
采集被禾谷孢囊线虫侵染的小麦根部土壤样品。
3.分离：
将1g土壤样品加入装有100mL无菌生理盐水和玻璃珠的三角瓶中充分摇振，静置后取上清用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，每个稀释浓度吸取100μL均匀涂布到Czapek’s培养基平板上，26℃静置培养4-5d，将菌落形态、颜色及菌丝镜检形态等特征与淡紫拟青霉相符且生长速度较快的单菌落转移到新的培养基中继续培养，直至大量产孢。
4.初筛：
用无菌生理盐水将平皿中的孢子洗脱下来并进行10倍梯度稀释，每个稀释浓度吸取100μL均匀涂布到Czapek’s培养基平板上，26℃静置培养4-5d，将菌落形态、颜色及菌丝镜检形态等特征与淡紫拟青霉相符且生长速度较快的单菌落转移到新的培养基中继续培养，直至大量产孢。
5.重复步骤4(初筛)6次。
6.复筛：
挑选长势最好的10个菌株进行500mL摇瓶发酵，每个菌株做5个重复摇瓶，比较10个菌株的生长速度、产孢速度、最大生物量及最大产孢量，最终选择产孢速度最快、产孢量最大的1株菌株进行后续研究。
实施例2
淡紫拟青霉的分子生物学菌种鉴定：
1.DNA提取：
用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒提取筛选菌株的基因组DNA。
2.ITS序列扩增：
用真菌ITS序列通用引物对筛选菌株进行ITS序列扩增。PCR反应体系为：10×PCR缓冲液5.0μL，dNTPs(2.5mM)4.0μL，引物ITS1和ITS4各2.0μL，ExTaq酶(5U/μL)2.0μL，DNA模板2.0μL，ddH2O 34μL；PCR运行程序：94℃预变性5min，95℃变性60s、55℃退火60s、72℃延伸90s，34个循环，最后72℃终延伸10min。
3.PCR产物纯化：
将PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，切下电泳胶上大小为700bp左右的主要PCR产物，并使用捷瑞生物工程(上海)有限公司PCR产物纯化试剂盒进行PCR产物纯化。
4.测序：
将纯化后的PCR产物送样至上海生工进行测序，所得分离菌株的ITS序列为：5’-CAGACGGAGTCTTTACGAGTTATACAACTCCCAAACCCACTGTGAACCTTACCTCAGTTGCCTCGGCGGGACCGCCCCGGCCGCCGCGCAAGCGGCGCCGGACTCCAAGGCGCCCGCCGCAGGGACCCAAAACTCTTTTGCATTACGCCCAACGGCGGGAATTTTTTCTCTGAGTGCATAAGCAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAGCCCCCCCGGGGGCCTCGGTGTTGGGGGACGGCACACCAGCCGCCCCCGAAATGCAGTGGCGACCTCGCCGCAGCCTCCCCTGCGTAGTAGCACACACCTCGCACCGGAGCGCGGAGACGGTCACGCCGTAAAACGCCCAACTTCTTAGAGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAGACGCGAAGGGAAAAGG-3’
5.比对：
将上述ITS序列在NCBI上进行比对，发现该序列与淡紫拟青霉(Purpureocilliumlilacinum)菌株INTR-2的ITS序列同源性为99％，E value值为0。因此，可确定该分离菌株即为淡紫拟青霉菌。
6.保藏：
我们随后将该菌株送到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行保藏，保藏编号为CGMCC No.12080。
实施例3
淡紫拟青霉的规模化生产：
1.菌种：所用淡紫拟青霉保藏编号为CGMCC No.12080。
2.斜面培养基：PDA培养基。
3.液体培养基：葡萄糖2％，酵母粉0.5％，硫酸铵0.5％，磷酸氢二铵0.5％，玉米浆0.3％，玉米粉0.2％，脲0.1％。
4.固体培养基：玉米秸秆24％，米糠16％，玉米粉60％，0.1％的(NH4)2SO4水溶液将含水量调至50％左右。
5.将26℃培养9d的淡紫拟青霉斜面接种到装有400mL液体培养基的1L摇瓶中，26℃、150r/min培养7d。
6.将5个1L摇瓶中的种子液接种到装有60L液体培养基的100L种子发酵罐中，26℃、150r/min培养6d。
7.将干固体培养基进行高压蒸汽灭菌。灭菌条件为：121℃，1h。灭菌完成后，打开中央空调进风(无菌风)，保持蒸料车间内正压力无菌风的供应，然后开盖放料。灭菌物料经破碎机，将结块或发粘的料块打散，再经凉料机冷却降温。
注：针对传统设备设施灭菌不彻底，且易生锈、易与消毒液产生化学反应等问题，现用的料斗、绞龙、破碎机、凉料机等蒸料机组所有与灭过菌的物料直接或间接接触的设备都是采用纯不锈钢制作，便于清洗消毒、耐腐蚀、抗老化，解决了清洗和灭菌的死角问题。
8.当物料温度降至28-30℃时，采用蒸球蒸料，接种机自动接种的方式，将种子发酵罐中的种子液接种到固体培养基中，搅拌均与后将初始含水量调至50％左右。
9.通过中央空调、温控系统、高压微雾加湿器将环境温度控制在26±1℃，湿度控制在90％-95％，培养5d后，将半成品曲料转移到不锈钢筛盘中继续培养5d，温度和湿度不变。
10.发酵产物进行低温烘干，室温控制为春、秋、冬季30-32℃，夏季32-35℃，烘至含水量在10％以下。
11.磨料制粉。
12.淡紫拟青霉产孢量为71770亿个/g(干重)，淡紫拟青霉发酵产物孢子萌发率随室温贮藏时间的变化情况见表1。
表1淡紫拟青霉发酵产物孢子萌发率随室温贮藏时间的变化
贮藏时间 2个月 5个月 8个月 11个月
孢子萌发率(％) 98.7％ 97.7％ 94.5％ 90.3％
可见，该淡紫拟青霉规模化生产工艺孢子产量高，发酵产品孢子损伤小，孢子活性维持时间长，利于工业生产及应用。
实施例4
淡紫拟青霉规模化生产产品防治禾谷孢囊线虫病的田间试验：
1.菌种：所用淡紫拟青霉保藏编号为CGMCC No.12080。
2.实验地：山东省淄博市小麦发病严重的地块，将试验地合理分为9个小区，每个小区20m2。试验的小麦品种为山农31号，按照常规方法播种。
3.处理：试验共有3组。即，对照组：喷洒清水10kg/ha；淡紫拟青霉组：喷洒淡紫拟青霉规模化生产菌剂100kg/ha；神农丹组：喷洒5％神农丹(涕灭威)10kg/ha(ha为面积单位：公顷)。每个试验组做3个小区重复。
4.虫口调查方法：每个小区进行随机10个点取样，每点取10株，染色调查根内幼虫数，染色方法详见刘维志(1998)，根据幼虫数计算相对防效。
5.相对防效计算公式：
相对防效(％)＝(对照组幼虫数一处理组幼虫数)/对照组幼虫数
6.田间试验结果：
表2淡紫拟青霉规模化生产产品对禾谷孢囊线虫病的田间防效
处理 幼虫数(10株) 相对防效(％)
淡紫拟青霉 127.18 63.19
神农丹 187.66 45.68
对照 345.46 /
由表2中的田间防效结果可知，用本发明提供的淡紫拟青霉菌株及以以玉米秸秆为原料的规模化生产工艺生产的淡紫拟青霉产品对禾谷孢囊线虫病具有良好的田间防治效果，其田间防效甚至显著高于常用化学农药神农丹。
5’-CAGACGGAGTCTTTACGAGTTATACAACTCCCAAACCCACTGTGAACCTTACCTCAGTTGCCTCGGCGGGACCGCCCCGGCCGCCGCGCAAGCGGCGCCGGACTCCAAGGCGCCCGCCGCAGGGACCCAAAACTCTTTTGCATTACGCCCAACGGCGGGAATTTTTTCTCTGAGTGCATAAGCAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAGCCCCCCCGGGGGCCTCGGTGTTGGGGGACGGCACACCAGCCGCCCCCGAAATGCAGTGGCGACCTCGCCGCAGCCTCCCCTGCGTAGTAGCACACACCTCGCACCGGAGCGCGGAGACGGTCACGCCGTAAAACGCCCAACTTCTTAGAGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAGACGCGAAGGGAAAAGG-3’

Claims (10)

1.一种淡紫拟青霉，其特征在于：该菌株为拟青霉(Paecilomyces)属中的淡紫拟青霉菌株INTR-2，该菌株的保藏编号为CGMCC No.12080。
2.根据权利要求1所述的淡紫拟青霉，其特征在于：用所述的淡紫拟青霉防治禾谷孢囊线虫病、金色线虫病或异皮线虫病。
3.一种权利要求1所述的淡紫拟青霉的规模化制备方法，其特征在于：采用液固双相发酵工艺，经液体培养基种子发酵及以玉米秸秆为主要原料的固体培养基分盘发酵，固态发酵过程采用中央空调、温控系统和高压微雾加湿器进行控温控湿，发酵产物采用低温烘干后磨料制粉。
4.根据权利要求3所述的淡紫拟青霉的规模化制备方法，其特征在于：液体培养基由以下重量百分含量的原料制成：玉米粉0.01％-1％，玉米浆0.01％-2％，脲0.01％-1％，葡萄糖0.01％-3％，硫酸铵0.01％-2％，磷酸氢二铵0.01％-2％，酵母粉0.01％-3％。
5.根据权利要求3所述的淡紫拟青霉的规模化制备方法，其特征在于：固体培养基由以下重量百分含量的原料制成：玉米秸秆10％-40％，米糠5％-30％，玉米粉30％-85％，硫酸铵0.01％-2％；固体培养基的含水量为30％-70％。
6.根据权利要求3所述的淡紫拟青霉的规模化制备方法，其特征在于：先将淡紫拟青霉株接种到液体培养基中进行种子培养，再采用自动化接种工艺将液体种子接种到以玉米秸秆为主要原料的固体培养基中进行固态发酵，自动化接种工艺中的接种量为1％-15％。
7.根据权利要求3所述的淡紫拟青霉的规模化制备方法，其特征在于：分盘发酵是指当淡紫拟青霉进入快速生长期、温度上升到30℃以上时，将半成品曲料转移到不锈钢筛盘中继续发酵。
8.根据权利要求3所述的淡紫拟青霉的规模化制备方法，其特征在于：固态发酵过程中，温度控制在20-30℃，湿度控制在80％-99％。
9.根据权利要求3所述的淡紫拟青霉的规模化制备方法，其特征在于：低温烘干时，温度控制在25-50℃。
10.根据权利要求3所述的淡紫拟青霉的规模化制备方法，其特征在于：生产过程中所有与灭过菌的物料直接或间接接触的设备均是采用纯不锈钢材料制成。
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