CN102086439A

CN102086439A - 人参真菌及其提取物的制备方法及人参真菌提取物用途

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Publication number: CN102086439A
Application number: CN2010105489891A
Authority: CN
Inventors: 陶承光; 杨涛; 杨镇; 胡文绣; 马晓颖; 王娜; 肖军; 王红; 肇莹; 陈珣; 龚娜
Original assignee: Liaoning Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Liaoning Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2010-11-18
Filing date: 2010-11-18
Publication date: 2011-06-08
Anticipated expiration: 2030-11-18
Also published as: CN102086439B

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，主要是涉及一种从长白山野生人参须根中分离获得的一株内生菌及人工培养条件下的菌丝提取物及其在促进玉米生长、提高抗逆性和提高产量方面的作用。该菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，该真菌分类名称为：细极链格孢Alternaria tenuissima。本发明的目的是通过相关产品的应用，促进玉米根系发育、提高肥料利用效率、提高耐旱能力，增加玉米产量。

Description

人参真菌及其提取物的制备方法及人参真菌提取物用途

一、技术领域：

本发明属于微生物技术领域，主要涉及一种人参真菌及其提取物的制备方法及用途，特别是涉及一种野生人参内生真菌及其提取物的制备方法及用途。

二、背景技术：

植物内生菌是具有一定转化性的植物共生菌。许多研究表明，内生菌与植物长期共同进化的结果，形成了与共生植物互惠互利的共生形式和作用机制。植物内生菌是一个非常庞大的群体。复杂的进化过程形成了各种复杂的代谢调控机制。由此推测植物内生菌种存在提控植物生长的物质。传统的五大激素都在不同的内生菌中发现。随着研究仪器设备技术的发展，人们可以检测更为微量的化学成分，由此为内生菌的研究领域进一步拓展提供了条件。本专利提及的内生菌人参支链孢属链孢菌人参专化型产生高活性植物生长促进物质此前还未见报道。

三、发明内容：

1、发明目的：

本发明提供一种人参真菌、该人参真菌及其提取物的制备方法及人参真菌提取物的用途，其目的是通过相关产品的应用，促进玉米根系发育、提高肥料利用效率、提高耐旱能力，增加玉米产量。

2、技术方案：

本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种人参真菌，其特征在于：该真菌分类名称为：链孢菌人参专化型，拉丁文名称为：Alternaria sp. Panax ginseng C. A. Mey。在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2010年8月30，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏代号为：MF004，保藏编号为：CGMCC.NO.4065。

该真菌引物SYS4963_SYS4963P1扩增DNA序列如下：

ACTGCGGAGGGATCATTACACAAATATGAAGGCGGGCTGGAACCTCTCGGGGTTACAGCCTTGCTGAATTATTCACCCTTGTCTTTTGCGTACTTCTTGT TTCCTTGGTGGGTTCGCCCACCACTAGGACAAACATAAACCTTTTGTAATTGCAATCAGCGTCAGTAACAAATTAATAATTACAACTTTCAACAACGGAT CTCTTGGTTCTGGCATCGATNAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTNAACGCACATTGCGCC CTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGGGCGTCTTGTCTCTAGCTTTGCTGGAGACTCGCC TTAAAGTAATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACAAGTCGCACTCTCTATCAGCAAAGGTCTAGCATCCATTAAGCCTTTTTTTCAACTT

该序列是链孢菌人参专化型分类的分子依据。

如上所述的人参真菌的制备方法，其特征在于：步骤如下：

（1）人参内生真菌的分离：

① 健康的野生人参样品采集后立即处理、洗净，然后将根切成小段，用75%的酒精冲洗，用10%巴氏消毒液洗15～20分钟，最后用无菌水冲洗3～5次；

② 将上述消毒过的根在无菌条件下分别切割成0.5cm长的小段接种于孟加拉红培养基平板上，置于28℃度培养箱培养2～8天后，即可见样品切割过的边缘长出菌丝，经平板反复分离、纯化；

（2）人参内生真菌液体发酵培养：

将“②”步骤中分离的真菌接到平板PDA培养基上，25℃培养5-7天，用打孔器琼脂挖块接种于装有50mL种子培养液的250mL三角烧瓶，于28℃，120r/min下旋转摇床上培养3天作为种子，以10%量接种入装有150mL发酵培养基的500mL三角瓶中，同样条件下培养5天，终止发酵，放入4℃冰箱中保存备用。

上述步骤（2）中种子培养液与发酵培养基相同，均为PDA培养基。

人参真菌提取物的制备方法，其特征在于：将上述“（2）”步骤中的菌丝体洗涤后60℃下烘干，称重，然后经高速粉碎机粉碎，用同体积乙醇浸提24h，浸提3次，用磁力搅拌器将其混匀，超声波震荡1h，真空抽滤，收集滤液备用。

人参真菌的提取物的用途，其特征在于：所述的人参真菌提取物用于促进包括玉米等主要农作物生长、提高抗逆性和提高产量。

3、优点及效果：

本发明涉及一株来源于长白山野生人参根内的一株真菌，从该真菌人工培养的菌丝内可提取出能够促进玉米等主要农作物生长、提高耐旱、耐涝、促进根际微生物生长、促进开花、提高产量的作用的活性成分。提取的活性成分可以播种前与少量的根际促生长细菌联合使用处理玉米等作物种子，在开花授粉后喷施作物叶面，可明显促进作物抗旱和产量的提高，大幅度提高作物栽培的经济效益。本发明提出了利用液体有氧发酵技术大量生产该菌菌丝及提取其中活性成分的方法以及田间应用技术。

四、附图说明：

图1为人参内生真菌醇提取物10ng/ml对玉米催芽后各种指标的影响；

图2为内生菌菌丝醇提取物高压毛细管电泳获得成分指纹图谱；

照片1为利用本发明人参中分离真菌平板图；

照片2为人参内生真菌提取物1ng/ml和10ng/ml对玉米的催芽效果图；

照片3为人参内生真菌提取物对玉米3-5天催芽情况；

照片4为从内生真菌中扩增DNA序列图。

专利菌种说明：

本专利所涉及的菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，单位地址中国北京市朝阳区北辰西路1号院，该真菌分类名称为：细极链格孢，拉丁文名称为：Alternaria tenuissima，保藏代号为：MF004，保藏编号为：4065，保藏日期为2010年8月18。

五、具体实施方式：

下面结合附图对本发明做进一步的说明：

人参真菌及提取物的制备方法：

人参内生真菌的制备：

（1）野生人参内生真菌的分离：

①健康的野生人参样品采集后立即处理、洗净后，将根切成小段，用75%的酒精冲洗，用10%巴氏消毒液洗15-20分钟，最后用无菌水冲洗3-5次。

②将上述消毒过的根在无菌条件下分别切割成0.5cm长的小段接种于孟加拉红培养基平板上，置于28度培养箱培养2-8天后，即可见样品切割过的边缘长出菌丝，经平板划线法和平板稀释法反复分离、纯化；

将上述消毒过的根在无菌条件下分别切割成0.5cm长的小段接种于孟加拉红培养基平板上，即可见样品切割过的边缘长出菌丝，经平板划线法和平板稀释法反复分离、纯化，培养观察菌落的形态，并对菌落的生长情况及特征作相应的记录(包括影像记录)。然后对菌株进行编号，在进入“（2）”步骤，将真菌转移到PDA斜面上培养5-7天，放入4℃冰箱中保存。

为检查表面消毒是否彻底，进行对照实验。将上述同样消毒处理过的根切段不作切割直接接种于孟加拉红培养基平板上，置于相同条件下培养，结果对照用的根周围无任何菌长出，证明得到的真菌是植物组织内的，而不是表面的附生菌。

（2）、人参内生真菌液体发酵培养

将②中分离的真菌接到平板PDA培养基上，25℃培养5-7天，用打孔器琼脂挖块接种于装有50mL种子培养液（PD培养基）的250mL三角烧瓶，于28℃，120r/min下旋转摇床上培养3天作为种子，以10%量接种入装有150mL发酵培养基(同种子培养液)的500mL三角瓶中，同样条件下培养5天，终止发酵，放入4℃冰箱中保存备用；

人参内生菌菌丝醇提取物的制备：

将上述“（2）”步骤中的菌丝体洗涤后60℃下烘干，称重，然后高速粉碎机粉碎，用同体积乙醇浸提24h，浸提3次，用磁力搅拌器将其混匀，超声波震荡1h，真空抽滤，收集滤液备用。然后将滤液制备成样品进行试验和测试；样品溶液的配制：将处理好的代谢物粗品用适量的甲醇溶解，并用0.22μm孔径的有机滤膜滤过，弃去初滤液，收集续滤液作为样品溶液。

对上述样品进行人参内生菌菌丝醇提取物高压毛细管检测，高压毛细管电泳条件如下：未涂层石英毛细管(50μm×57cm，有效检测长度48cm)；运行缓冲液20mmol/L硼砂缓冲液(pH 9.0)；20mmol/L硼酸溶液；检测波长214nm；分离电压20kV；温度 28℃；压力进样10s。毛细管柱使用前用0.1 mol/L的NaOH、水和电泳缓冲液分别冲洗1min，2min和3min。

对上述人参内生菌菌丝醇提取物的活性测定：

将上述人参内生菌菌丝醇提取物配制成不同的浓度，对玉米，大豆，黄瓜，油菜进行催芽试验测试人参内生菌菌丝醇提取物对玉米、大豆等种子萌发阶段的促进作用，如照片2所示醇提取物对玉米催芽最适浓度为10ng/ml。

将上述人参内生菌菌丝醇提取物配成0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、30ng/ml、100ng/ml不同浓度对玉米和大豆等种子进行催芽试验，玉米在28℃温浴1h，然后在无菌的培养皿里放双层滤纸，每皿放20粒，加10ml蒸馏水，培养3-5天。观察每天的发芽情况如照片3所示，及时补充等量水分。从上述数据可以看出人参内生菌菌丝醇提取物对玉米和大豆的种子有明显的催芽效果。

人参内生真菌菌丝醇提取物组分鉴定：

高效毛细管电泳仪菌株指纹图谱的建立

利用高效毛细管电泳对菌丝体醇提取物进行指纹图谱的建立，发现本发明的组分中含有微量的吲哚乙酸和赤霉素等植物激素，并且对吲哚乙酸和赤霉素等植物激素的电泳图进行比对，对比情况如图1所示。

人参内生真菌生物学分类：

如照片2所示，利用CTAB法对筛选的真菌进行基因组DNA的提取，并且用ITS4与ITS5一对通用引物进行基因的扩增和测序。DNA的浓度和纯度的检测是利用紫外光吸收和琼脂糖凝胶电泳进行检测的。照片2为从内生真菌中扩增DNA序列图；从照片4中可以看出人参内生真菌基因组片段大小约为500bp左右。

另外，人参内生真菌提取物在促进玉米生长和提高抗逆性方面的应用，具体实施如下：

取两块距离不远的地作为对比试验田，分别为对比组和实验组，两块地距离不远会尽量的满足两块地的生长环境一致，每块地为一亩，实验地点为北方普通的适于玉米生长的田地，然后取北方黄玉米的种子，对对比组的种子进行常规的播种，对实验组的种子利用本发明的人参内生真提取物进行处理，处理步骤为：人参内生真提取物5ng/ml-10ng/ml对玉米种子进行浸泡1-2天；将两块地的种子同时进行播种，在开花前2周左右对实验组喷施作物叶面，或在结实初期喷施作物叶面；喷施过程选择晴天的傍晚进行，以免雨水或阳光的因素，影响作物对喷施物的吸收，喷施的标准是尽量使叶面均匀的布满喷施物。

待进入成熟期后分别对两组进行观察，发现对比组的成熟期为150天，而实验组的成熟期为145天，由此可以看出，实验组的玉米生长期较对比组提前十五天左右；产量方面，对比组为近1350斤的亩产量，而实验组的产量则接近1525斤的亩产量，也就是说应用本发明的人参内生真菌提取物的实验组可以明显的提前玉米的成熟时间和提高亩产量。

实施例1：

人参内生真菌的制备方法，其特征在于：步骤如下：

（1）人参内生真菌的分离：

① 健康的野生人参样品采集后立即处理、洗净，然后将根切成小段，用75%的酒精冲洗，用10%巴氏消毒液洗15分钟，最后用无菌水冲洗3次；

② 将上述消毒过的根在无菌条件下分别切割成0.5cm长的小段接种于孟加拉红培养基平板上，置于28℃度培养箱培养2天后，即可见样品切割过的边缘长出菌丝，经平板反复分离、纯化；

（2）人参内生真菌液体发酵培养：

将“②”步骤中分离的真菌接到平板PDA培养基上，25℃培养5天，用打孔器琼脂挖块接种于装有50mL种子培养液的250mL三角烧瓶，于28℃，120r/min下旋转摇床上培养3天作为种子，以10%量接种入装有150mL发酵培养基的500mL三角瓶中，同样条件下培养5天，终止发酵，放入4℃冰箱中保存备用。

人参内生真菌提取物的制备方法，其特征在于：将上述“（2）”步骤中的菌丝体洗涤后60℃下烘干，称重，然后经高速粉碎机粉碎，用同体积乙醇浸提24h，浸提3次，用磁力搅拌器将其混匀，超声波震荡1h，真空抽滤，收集滤液备用。

得到的人参内生真菌的提取物可用于促进包括玉米等主要农作物生长、提高抗逆性和提高产量等方面。

实施例2：

人参内生真菌的制备方法，其特征在于：步骤如下：

（1）人参内生真菌的分离：

① 健康的野生人参样品采集后立即处理、洗净，然后将根切成小段，用75%的酒精冲洗，用10%巴氏消毒液洗20分钟，最后用无菌水冲洗5次；

② 将上述消毒过的根在无菌条件下分别切割成0.5cm长的小段接种于孟加拉红培养基平板上，置于28℃度培养箱培养8天后，即可见样品切割过的边缘长出菌丝，经平板反复分离、纯化；

（2）人参内生真菌液体发酵培养：

将“②”步骤中分离的真菌接到平板PDA培养基上，25℃培养7天，用打孔器琼脂挖块接种于装有50mL种子培养液的250mL三角烧瓶，于28℃，120r/min下旋转摇床上培养3天作为种子，以10%量接种入装有150mL发酵培养基的500mL三角瓶中，同样条件下培养5天，终止发酵，放入4℃冰箱中保存备用。

实施例3：

人参内生真菌的制备方法，其特征在于：步骤如下：

（1）人参内生真菌的分离：

① 健康的野生人参样品采集后立即处理、洗净，然后将根切成小段，用75%的酒精冲洗，用10%巴氏消毒液洗18分钟，最后用无菌水冲洗4次；

② 将上述消毒过的根在无菌条件下分别切割成0.5cm长的小段接种于孟加拉红培养基平板上，置于28℃度培养箱培养5天后，即可见样品切割过的边缘长出菌丝，经平板反复分离、纯化；

（2）人参内生真菌液体发酵培养：

将“②”步骤中分离的真菌接到平板PDA培养基上，25℃培养6天，用打孔器琼脂挖块接种于装有50mL种子培养液的250mL三角烧瓶，于28℃，120r/min下旋转摇床上培养3天作为种子，以10%量接种入装有150mL发酵培养基的500mL三角瓶中，同样条件下培养5天，终止发酵，放入4℃冰箱中保存备用。

本发明充分的利用了真菌与植物的关系，而真菌与植物的关系可产生调控植物生长物质的真菌，包括有益真菌和病原真菌、这是未来技术的发展趋势。本发明从野生人参中分离的能产生促进玉米等作物生长的内生菌，该菌为支链孢，从该菌的菌丝提取物成分分析发现含有微量的吲哚乙酸和赤霉素以及一些未知的成分。但从其活性来分析：由于其活性非常高，推测不是现有已知的五大类激素。而此前还没有关于从人参支链孢属链孢菌人参专化型内生菌产生高活性植物生长促进物质的报道，尤其是这些活性成分除促进根系生长外，还具有诱导植物耐旱、耐低温、促进根际微生物生长等功能。本发明的人参内生真菌可与植物共生进化来促进植物的生长发育，植物内生菌在与植物共生进化的过程中，形成了互惠的机制，这些机制通过对内生菌产生的活性成分的分析会逐步清楚。通过人工生产大量植物内生菌来获得有益作物生长的活性物质是一项经济有效环境友好的产业。

Claims

1.一种人参真菌，其特征在于：该真菌分类名称为：细极链格孢，拉丁文名称为：Alternaria tenuissima，在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2010年8月18，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏代号为：MF004，保藏编号为：4065。

2.根据权利要求1所述的人参真菌，其特征在于：该真菌引物SYS4963_SYS4963P1扩增DNA序列如下：

ACTGCGGAGGGATCATTACACAAATATGAAGGCGGGCTGGAACCTCTCGGGGTTACAGCCTTGCTGAATTATTCACCCTTGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCTTGGTGGGTTCGCCCACCACTAGGACAAACATAAACCTTTTGTAATTGCAATCAGCGTCAGTAACAAATTAATAATTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATNAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTNAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGGGCGTCTTGTCTCTAGCTTTGCTGGAGACTCGCCTTAAAGTAATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACAAGTCGCACTCTCTATCAGCAAAGGTCTAGCATCCATTAAGCCTTTTTTTCAACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGGCGGAGGAAA。

3.一种如权利要求1所述的人参真菌的制备方法，其特征在于：步骤如下：

（1）人参内生真菌的分离：

（2）人参内生真菌液体发酵培养：

4.根据权利要求3所述的人参真菌的制备方法，其特征在于：步骤（2）中种子培养液与发酵培养基相同，均为PDA培养基。

5.一种人参真菌提取物的制备方法，其特征在于：将上述“（2）”步骤中的菌丝体洗涤后60℃下烘干，称重，然后经高速粉碎机粉碎，用同体积乙醇浸提24h，浸提3次，用磁力搅拌器将其混匀，超声波震荡1h，真空抽滤，收集滤液备用。

6.一种人参真菌的提取物的用途，其特征在于：所述的人参真菌提取物用于促进包括玉米等主要农作物生长、提高抗逆性和提高产量。