CN104108964B

CN104108964B - 一种全营养微生物生防有机肥的制备方法与应用

Info

Publication number: CN104108964B
Application number: CN201410322413.1A
Authority: CN
Inventors: 陈靠山; 樊恒达; 张鹏英; 于志丹; 周南; 郭艳玲; 王太林; 王静
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2014-07-08
Filing date: 2014-07-08
Publication date: 2016-06-15
Anticipated expiration: 2034-07-08
Also published as: CN104108964A

Abstract

本发明涉及一种全营养微生物生防有机肥的制备方法与应用，包括如下步骤：(1)将拟康氏木霉TRIPI和黑根霉RN-9进行平板培养；(2)将拟康氏木霉TRIPI和黑根霉RN-9菌丝块进行PDB液体培养；(3)将液体培养液进行发酵培养，制得发酵液；(4)将农家肥原料接种发酵液，混合均匀，经堆料发酵，制得发酵料；(5)向发酵料中加入其他成分，混合均匀，制得全营养微生物生防有机肥；本发明制备的全营养微生物生防有机肥对病原菌的抑制率较高，对黄瓜枯萎病的相对防效较高，与单一菌种发酵液制备的生防有机肥相比，黄瓜根际土壤、黄瓜根系、黄瓜茎秆中的病原菌含量较低，并且黄瓜叶片防御酶的反应快，酶活高，持续时间长。

Description

一种全营养微生物生防有机肥的制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种全营养微生物生防有机肥的制备方法与应用，属于复合微生物肥料技术领域。

背景技术

土壤是指覆盖于地球陆地表面，具有肥力特征，能够生长绿色植物的疏松物质层，主要组成成分为矿物质、有机质、微生物、水分等。土壤中所含微生物种类有很多，主要有细菌、真菌、放线菌、藻类和原生动物等。土壤越肥沃，微生物越多。但是由于世界人口数量增多，住房面积、城市面积加大，导致土地面积的急剧降低。农民为了追求经济效益，开始过度使用土地，从而出现了一系列的农业问题，其中土传病害尤为严重。

土传病害是指生活在土壤中的病原体在条件适宜时从作物根部或茎基部侵害作物而引起的病害。农民为追求经济效益，进而出现高度集约化种植，重茬率增高，种植品种单一，导致土壤病原菌大量积累及土壤有机质含量减少；同时过多使用农药化肥，使土壤中的有益生物减少，药害肥害急剧加重，土壤的自主修复能力减弱；由于引起土传病害的病原菌自身一般为多寄主微生物，导致其具有很强的侵染能力，可以侵染数种乃至数百种农作物和杂草植物，并且在恶劣的环境下有特殊的生存方式，植物界认定为最难防治的病害之一。

土传病害的实质是由于土壤中病原微生物的大量繁殖及有益微生物及生防微生物的减少造成的。首先生防菌在土传病害的防治中起着非常重要的作用，生防菌的种类和数量众多，具有惊人的繁殖速度；许多生防菌存在于植物根际和地上部，对植物的生态比较适宜；其大多可以人工培养，便于控制；有些生防菌不仅能防治病害而且可以增加作物产量。其次，土壤有机质含量的增加可以改善土壤有益微生物及生防微生物的生长环境，有利于其快速繁殖及生长，同时，有机质含量的增加有利于土壤无机质的转化，土壤酶活力的提升，土壤肥力的提升，维持土壤的可持续利用。解决土传病害的最为重要的有效措施是向土壤中施入以大量的有机质为载体的大量多种有益生防微生物及生防微生物

随着生物科技的迅速发展，生物肥料应运而生，生物肥料主要以生防菌为中心，是一种新型复合肥料。现在市面上销售的料大多为单一虽然有部分的生物肥料含2-4种菌种，但是大多是将生防菌单独发酵之后，然后按照一定的混合比例将发酵液混合，这种肥料并不能达到叠加的技术效果。

本发明中，在种子培养阶段，通过控制发酵时间、温度、转速等措施，将两种生防菌按照一定的比例进行混合发酵，使发酵液中的孢子含量达到最高，且孢子活力较高。在混合发酵过程中，两种生防菌相互作用，使发酵液中的次生代谢物质的种类及含量增加。在防治土传病害方面，这种生产方式可以达到叠加的效果。

发明内容

本发明针对土传病害和现有生物肥料作用不佳等问题，提供一种无污染、高效、实用的生物肥料的制备方法及应用。

具体来说，是以丝状拟康氏木霉和黑根霉为中心，并且将两种真菌进行混合发酵，以畜禽粪便、作物秸秆、树枝、落叶等原料为主要堆肥材料，添加黄腐酸钾、甲壳素、常量元素、微量元素等，制备全营养微生物生防有机肥。这种复合型生物肥料可以抑制病原微生物的生长，调节土壤理化生及生化性状，提供农作物生长所必需的营养物质，提高作物产量和品质，增强作物的抗逆性，并且不会对环境产生污染，是一种绿色高效的复合型生物肥料。

本发明技术方案如下：

一种全营养微生物生防有机肥的制备方法，包括如下步骤：

(1)将拟康氏木霉(Trichodermapseudokiningii)TRIPI和黑根霉(Rhizopusnigricans)RN-9接种于PDA平板培养基上进行平板培养；

(2)将步骤(1)平板培养后的拟康氏木霉(Trichodermapseudokiningii)TRIPI和黑根霉(Rhizopusnigricans)RN-9菌丝块转接至PDB培养基中，进行摇瓶培养，制得液体培养液；

(3)将步骤(2)制得的液体培养液按体积比为1:(1～3)接种于麸皮葡萄糖培养基中，经发酵培养，制得菌种发酵液；

上述麸皮葡萄糖培养基每升组分如下：

麸皮50～70克，葡萄糖20克，水定容至1L；

(4)将农家肥原料干料粉碎后，按干重的30～50wt％加水，混合均匀，然后按农家肥原料干料的干重的1.5～5wt％接种步骤(3)制得的发酵液，混合均匀，经堆料发酵3～5天，制得拟康氏木霉(Trichodermapseudokiningii)TRIPI和黑根霉(Rhizopusnigricans)RN-9的孢子数之和不小于0.5亿/克的发酵料；

(5)按步骤(4)制得的发酵料质量的0.02％～0.05％加入甲壳素、7.0％～8.0％加入尿素、0.5％～1.5％加入硫酸钙(CaSO₄)、5.0％～12.0％加入三水合磷酸氢二钾(K₂HPO₄·3H₂O)、1.0％～5.0％加入凹凸棒土，混合均匀，然后按步骤(4)制得的发酵料质量的1％～5％加入甲基纤维素、1％～5％加入羧甲基纤维素钠、1％～5％加入乙基纤维素，混合均匀，制得全营养微生物生防有机肥。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的拟康氏木霉(Trichodermapseudokiningii)TRIPI购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，菌种保藏编号CGMCCNO.1443；

黑根霉(Rhizopusnigricans)RN-9于2013年11月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号CGMCCNO.8436，保藏地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的培养条件为在25℃～30℃培养36h～60h。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中的菌丝块为用内径为5mm的打孔器在菌落边缘打孔后，用接种环挑取获得。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中的液体培养条件为在25℃～30℃、100～150rpm条件下，培养8～15天。更优的，液体培养条件为在28℃、120rpm条件下，培养4～5天。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中的发酵培养条件为在25℃～30℃、100～150rpm条件下，培养3～5天。更优的，发酵培养条件为在28℃、120rpm条件下，培养4天。

根据本发明优选的，所述步骤(4)中的农家肥原料为作物秸秆、树叶、杂草。

根据本发明优选的，所述步骤(4)中的粉碎为粉碎至长度1～3cm。

根据本发明优选的，所述步骤(4)中的堆料发酵为：将堆料堆成截面为宽1.5～2.5m、高0.8～1.2m的条形堆，每天翻堆3～4次。

上述平板PDA培养基为本领域常用培养基，也可按如下组分配制：

马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂18g，蒸馏水定容至1000mL。

上述PDB培养基为本领域常用培养基，也可按如下组分配制：

马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水定容至1000mL。

有益效果

本发明制备的全营养微生物生防有机肥对病原菌的抑制率较高，对黄瓜枯萎病的相对防效较高，与单一菌种发酵液制备的生防有机肥相比，黄瓜根际土壤、黄瓜根系、黄瓜茎秆中的病原菌含量较低，并且黄瓜叶片防御酶的反应快，酶活高，持续时间长。

附图说明

图1-1：五种生防菌之间的对峙实验结果照片；

图中：CK为对照组，中间组为实验组；其中，1、黑根霉与TPI，2、黑根霉与TPⅡ，3、黑根霉与TPⅢ，4、黑根霉与TPⅣ，5、TPI与TPⅡ，6、TPI与TPⅢ，7、TPI与TPⅣ，8、TPⅡ与TPⅢ，9、TPⅡ与TPⅣ，10、TPⅣ与TPⅢ；

图2-1五种生防菌对灰葡萄孢的抑制效果曲线图；

图2-2：五种生防真菌与灰霉的对峙实验正面结果照片；

图2-3：五种生防真菌对灰霉的对峙试验反面结果照片；

图2-4五种生防菌对尖孢镰刀菌黄瓜专化型的抑制效果曲线图；

图2-5五种生防真菌对尖孢镰刀菌黄瓜专化型的抑制试验正面结果照片；

图2-6五种生防真菌对尖孢镰刀菌黄瓜专化型的抑制试验反面结果照片；

图3-1生防菌发酵液对尖孢镰刀菌黄瓜专化型的抑制效果柱状图；

图3-2生防菌发酵液对灰葡萄孢的抑制效果柱状图；

图4-1生防菌发酵液对黄瓜枯萎病的盆栽实验结果照片；

图5-1荧光定量PCR不同起始模板lg拷贝数和CT值的标准曲线；

图5-2不同处理对黄瓜茎秆中尖孢镰刀菌含量的抑制率柱状图；

图5-3不同处理对黄瓜根系中尖孢镰刀菌含量的抑制率柱状图；

图5-4不同处理对土壤中尖孢镰刀菌含量的抑制率柱状图；

图6-1不同处理黄瓜叶片中的SOD酶活变化曲线；

图6-2不同处理黄瓜根茎中的SOD酶活变化曲线；

图6-3不同处理黄瓜叶片中PAL酶活变化曲线；

图6-4不同处理黄瓜根茎中PAL酶活变化曲线；

图6-5不同处理黄瓜叶片中POD酶活变化曲线；

图6-6不同处理黄瓜根茎中POD酶活变化曲线；

图7-1全营养微生物生防有机肥对棉花枯萎病的田间防治效果照片；

图7-2全营养微生物生防有机肥对棉花枯萎病的田间防治效果照片；

图7-3全营养微生物生防有机肥对棉花枯萎病的田间防治效果照片；

图7-4全营养微生物生防有机肥对棉花枯萎病的田间防治效果照片；

图7-5全营养微生物生防有机肥对棉花枯萎病的田间防治效果照片；

图7-6全营养微生物生防有机肥对棉花枯萎病的田间防治效果照片；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

培养基

平板PDA培养基组分如下：

马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂18g，蒸馏水定容至1000mL。

PDB培养基组分如下：

马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水定容至1000mL。

实施例1

一种全营养微生物生防有机肥的制备方法，包括如下步骤：

(1)将拟康氏木霉(Trichodermapseudokiningii)TRIPI和黑根霉(Rhizopusnigricans)RN-9接种于PDA平板培养基上，在28℃进行平板培养48h；

(2)将步骤(1)平板培养后的拟康氏木霉(Trichodermapseudokiningii)TRIPI和黑根霉(Rhizopusnigricans)RN-9用内径为5mm的打孔器在菌落边缘打孔后，用接种环挑取菌丝块转接至PDB培养基中，在28℃、120rpm条件下，进行PDB液体培养10天，制得液体培养液；

(3)将步骤(2)制得的液体培养液按1:1接种于麸皮葡萄糖培养基中，在25℃、100rpm条件下，发酵培养5天，制得发酵液；

上述麸皮葡萄糖培养基每升组分如下：

麸皮70克，葡萄糖20克，水定容至1L；

(4)将小麦秸秆干料粉碎至长度1～3cm后，按干重的40wt％加水，混合均匀，然后按小麦秸秆干重的2wt％接种步骤(3)制得的发酵液，混合均匀，将堆料堆成截面为宽2m、高1m的条形堆，每天翻堆3～4次，经堆料发酵5天，制得发酵料；经检测，拟康氏木霉(Trichodermapseudokiningii)TRIPI和黑根霉(Rhizopusnigricans)RN-9的孢子数之和＞0.65亿/克；

(5)按步骤(4)制得的发酵料质量的0.05％加入甲壳素、7.0％加入尿素、1.5％加入硫酸钙(CaSO₄)、5.0％加入三水合磷酸氢二钾(K₂HPO₄·3H₂O)、5.0％加入凹凸棒土，混合均匀，然后按步骤(4)制得的发酵料质量的5％加入甲基纤维素、1％加入羧甲基纤维素钠、5％加入乙基纤维素，混合均匀，制得全营养微生物生防有机肥。

所述步骤(1)中的拟康氏木霉(Trichodermapseudokiningii)TRIPI购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，菌种保藏编号CGMCCNO.1443；

实施例2

一种全营养微生物生防有机肥的制备方法，包括如下步骤：

(1)将拟康氏木霉(Trichodermapseudokiningii)TRIPI和黑根霉(Rhizopusnigricans)RN-9接种于PDA平板培养基上，在25℃进行平板培养60h；

(2)将步骤(1)平板培养后的拟康氏木霉(Trichodermapseudokiningii)TRIPI和黑根霉(Rhizopusnigricans)RN-9用内径为5mm的打孔器在菌落边缘打孔后，用接种环挑取菌丝块转接至PDB培养基中，在25℃、150rpm条件下，进行PDB液体培养15天，制得液体培养液；

(3)将步骤(2)制得的液体培养液按体积比1:2接种于麸皮葡萄糖培养基中，在30℃、150rpm条件下，发酵培养3天，制得发酵液；

上述麸皮葡萄糖培养基每升组分如下：

麸皮50克，葡萄糖20克，水定容至1L；

(4)将杂草干料粉碎至长度1～3cm后，按干重的30wt％加水，混合均匀，然后按小麦秸秆干重的5wt％接种步骤(3)制得的发酵液，混合均匀，将堆料堆成截面为宽2m、高1m的条形堆，每天翻堆3～4次，经堆料发酵3天，制得发酵料；经检测，拟康氏木霉(Trichodermapseudokiningii)TRIPI和黑根霉(Rhizopusnigricans)RN-9的孢子数之和＞0.55亿/克；

(5)按步骤(4)制得的发酵料质量的0.02％加入甲壳素、8.0％加入尿素、0.5％加入硫酸钙(CaSO₄)、12.0％加入三水合磷酸氢二钾(K₂HPO₄·3H₂O)、1.0％加入凹凸棒土，混合均匀，然后按步骤(4)制得的发酵料质量的1％加入甲基纤维素、5％加入羧甲基纤维素钠、1％加入乙基纤维素，混合均匀，制得全营养微生物生防有机肥。

实施例3

一种全营养微生物生防有机肥的制备方法，包括如下步骤：

(1)将拟康氏木霉(Trichodermapseudokiningii)TRIPI和黑根霉(Rhizopusnigricans)RN-9接种于PDA平板培养基上，在30℃进行平板培养36h；

(2)将步骤(1)平板培养后的拟康氏木霉(Trichodermapseudokiningii)TRIPI和黑根霉(Rhizopusnigricans)RN-9用内径为5mm的打孔器在菌落边缘打孔后，用接种环挑取菌丝块转接至PDB培养基中，在30℃、100rpm条件下，进行PDB液体培养8天，制得液体培养液；

(3)将步骤(2)制得的液体培养液按体积比1:3接种于麸皮葡萄糖培养基中，在28℃、120rpm条件下，发酵培养4天，制得发酵液；

上述麸皮葡萄糖培养基每升组分如下：

麸皮50克，葡萄糖20克，水定容至1L；

(4)将玉米秸秆干料粉碎至长度1～3cm后，按干重的50wt％加水，混合均匀，然后按小麦秸秆干重的1.5wt％接种步骤(3)制得的发酵液，混合均匀，将堆料堆成截面为宽2m、高1m的条形堆，每天翻堆3～4次，经堆料发酵5天，制得发酵料；经检测，拟康氏木霉(Trichodermapseudokiningii)TRIPI和黑根霉(Rhizopusnigricans)RN-9的孢子数之和＞0.6亿/克；

(5)按步骤(4)制得的发酵料质量的0.04％加入甲壳素、7.5％加入尿素、1.0％加入硫酸钙(CaSO₄)、10.0％加入三水合磷酸氢二钾(K₂HPO₄·3H₂O)、3.0％加入凹凸棒土，混合均匀，然后按步骤(4)制得的发酵料质量的3％加入甲基纤维素、3％加入羧甲基纤维素钠、3％加入乙基纤维素，混合均匀，制得全营养微生物生防有机肥。

试验例1

对峙培养测定生防菌之间的拮抗活性

在对峙实验中，共有五种生防真菌：

黑根霉(Rhizopusnigricans)RN-9，以下简称黑根霉；保藏编号CGMCCNO.8436

拟康氏木霉Ⅰ(Trichodermapseudokoningii)TRIPI，以下简称TPⅠ；保藏标号CGMCCNO.1443

拟康氏木霉Ⅱ(Trichodermapseudokoningii)，以下简称TPⅡ，购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNO.3.6612；

木霉Ⅰ(TrichodermaPers.)，以下简称TPSI，购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNO.3.301；

木霉Ⅱ(TrichodermaPers.)，以下简称TPSⅡ，购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNO.3.1539；

试验方法：在盛有PDA的培养皿两侧，分别接种直径为5mm的生防真菌菌丝块。28℃培养108h，并且每12h记录菌丝生长长度。

实验结果如表1-1、1-2、1-3、1-4和图1-1所示：在培养至108h时，通过五种生防菌之间的抑制率可以发现黑根霉生长速率最快，并且其菌丝为气生菌丝，TPⅠ的抑制率最大。故选择黑根霉和TPⅠ为最佳生防菌株。

表1-1四种生防菌对黑根霉的抑制率

表1-2三种生防菌对TPⅠ的抑制率

表1-3两种生防菌对TPⅡ的抑制率

表1-4TPSI对TPSⅡ的抑制率

试验例2

对峙培养测定生防菌和病原菌之间的拮抗活性

试验方法如试验例1

实验结果如表2-1、2-2和图2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6所示：五种生防真菌与两种病原菌的对峙试验，其中，TPⅠ对病原菌的抑制作用较强，黑根霉次之，其余的三种生防真菌的抑制作用较弱。所以，从对峙实验中，选择出了两种抑制作用较强的生防菌株即黑根霉和TPⅠ。随后用这两种真菌进行混合发酵。

表2-1五种生防菌对灰葡萄孢的抑制效果

表2-2五种生防菌对尖孢镰刀菌黄瓜专化型的抑制效果

试验例3

抑制真菌菌丝生长速率法测定生防菌发酵液对病原菌菌丝的抑制活性

试验方法：将具有遗传稳定性状的黑根霉和TPⅠ接种于平板PDA培养基上，28℃培养48h，然后用内径为5mm的打孔器在菌落边缘打孔，再用接种环挑取菌丝块(按照黑根霉：TPⅠ＝1:0，0:1，1:1，2:1，3:1，4:1，5:1，分别标记为：黑根霉、TPⅠ、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)于盛有500mlPDB培养基中，28℃，120rpm，时间为10天，然后用4层纱布过滤出去菌丝，得发酵液。然后将发酵液浓缩10倍，将发酵液和PDA培养基按照体积比为1:1的比例倒入培养皿中，然后将内径为5mm的灰葡萄孢和尖孢镰刀菌黄瓜专化型接种到以上培养皿中，分别标记为TPⅠ、黑根霉、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，28℃培养5天，并且每天记录菌丝长度。

如表3-1、3-2和图3-1、3-2所示：黑根霉、TPⅠ单独发酵与混合发酵相比，混合发酵的发酵液比混合发酵的发酵液对病原菌的抑制作用较弱。其中，根霉发酵液的抑制作用最弱，II号发酵液对病原菌的抑制作用最强，I号发酵液次之。但是这两种发酵液相对于TPⅠ发酵液的抑制作用较强。

表3-1生防菌发酵液对尖孢镰刀菌黄瓜专化型的抑制效果

表3-2生防菌发酵液对灰葡萄孢的抑制效果

试验例4

盆栽试验测定生防菌对病原菌的防治效果

试验方法：本实验使用“津春四号”黄瓜种子，以灭菌沙壤土为基质，黄瓜种子用体积百分比75％的酒精消毒，置30℃恒温箱催芽移栽入盆，每盆3株，每处理4盆，一片真叶期灌根接种，首先每棵黄瓜植株接种5ml发酵液，12h后接种尖孢镰刀菌，接种时用一硬板片插入植株四周的土中数次，以达到伤根的目的，然后每株灌2ml培养一周的浓度为1×10⁷cfu/ml的孢子悬浮液。试验设4个处理：

(1)只接种尖孢镰刀菌；(2)接种黑根霉发酵液和尖孢镰刀菌孢子悬浮液；(3)接种TPⅠ发酵液和尖孢镰刀菌孢子悬浮液；(4)接种黑根霉和TPⅠ混合发酵液和尖孢镰刀菌孢子悬浮液；温室保持25～28℃，接种9d后调查病情，计算病情指数和相对防效。以FOC(10⁷cfu/ml)按上述方法处理，接种后每隔3d调查一次各处理的发病情况，计算病情指数和相对防效。可参考《黄瓜枯萎病抗病性鉴定方法研究》(翁祖信，蒋兴祥，肖小文.《中国蔬菜》，1985,2：30～33.)中记载的培根接种法。

实验结果如表4-1和图4-1所示：单独用TPⅠ发酵液和黑根霉发酵液防治的病情指数均低于混合菌株发酵液的病情指数，且达到显著性差异；TPⅠ防治效果好于黑根霉，而两种菌等比例混合发酵液处理的病情指数在同等病原菌压力下均低于用单一菌防治的病情指数。说明接种混合菌对防治黄瓜枯萎病具有叠加效应。

表4-1生防菌对黄瓜枯萎病病指的防治效果(15d)

试验例5

qPCR试验定量黄瓜各组织和土壤中病原菌的含量

试验方法：采用CTAB法提取基因组DNA；

使用引物FocF8(5′-GCGTGTATTTGGCATGTTGC-3)和FocR2(5′-TCAACGGGACTCCCTTCG-3′)对尖孢镰刀菌菌丝DNA进行扩增，然后通过实时荧光定量PCR技术观察不同浓度的模板DNA对扩增效率及荧光吸收强度的影响，确定最合适的DNA模板浓度。在合适的浓度范围内选择5个模板梯度进行反应，确定阀值和基线，绘制出标准曲线。将测得的CT值带入标准曲线方程测出待测样品中病原菌的拷贝数。

实验结果如图5-1、5-2、5-3、5-4所示，通过检测黄瓜根际土壤、黄瓜根系、黄瓜茎秆中的尖孢镰刀菌的含量，与黑根霉处理组相比，TPⅠ处理组的病原菌含量较少，混合处理组的病原菌含量最少，这说明TPⅠ处理组比黑根霉处理组的防治效果好，混合处理组防治效果最好。

试验例6

植物酶活测定黄瓜防御酶的变化趋势

试验方法：试验共设5个处理组，其中A组是清水处理组；B组、C组、D组、E组是指在黄瓜两片子叶期，利用伤根处理的方法接种病原菌(10⁷cfu/ml)，同时，在C组、D组、E组的土壤中分别接种10ml黑根霉、TPI、黑根霉/TPI混合发酵液。测定苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)检测黄瓜防御酶的变化。

实验结果如图6-1、6-2、6-3、6-4、6-5、6-6所示，A组的黄瓜叶和根茎防御酶酶活维持在恒定水平；B组的黄瓜根茎发生防御反应的速度比叶快，且防御酶酶活性高；与C组、D组相比，E组的黄瓜叶和根茎发生防御反应的速度快、防御酶酶活性强及维持时间长。

试验例7

全营养微生物生防有机肥对棉花枯萎病的防治效果

试验方法：实验设置在滨州市博兴县金种子生物科技有限公司的试验田，该试验田主要用于筛选抗病品系。试验组和对照组为15m²棉花试验田，在播种前，对试验田的土壤进行处理，分别施用实施例1-3制备的全营养微生物生防有机肥，即为实验组Ⅰ、实验组Ⅱ、实验组Ⅲ，施用量均为150公斤/亩的全营养微生物生防有机肥，然后翻土；对照组不做处理，做三个平行组，分别在6月、7月、8月，调查棉花病指。

实验结果如表7-1、7-2和图7-1、7-2、7-3、7-4、7-5、7-6所示，全营养微生物生防有机肥对棉花枯萎病的相对防效达到了65.2％，有效的改善土壤的理、化、生性状，棉花产量增加约56.93％。

表7-1全营养微生物生防有机肥对棉花枯萎病的田间防治效果(山东滨州)

表7-2全营养微生物生防有机肥对棉花枯萎病的田间防治效果(山东滨州)

注：R_0,25表示大于0.25mm水稳性团聚体总量。

试验例8全营养微生物生防有机肥对番茄根腐病的防治效果

在山东聊城试验田，试验组和对照组为15m²番茄试验田，在播种前，对试验田的土壤进行处理，分别施用实施例1-3制备的全营养微生物生防有机肥，即为实验组Ⅰ、实验组Ⅱ、实验组Ⅲ，施用量均为150公斤/亩，然后翻土。对照组不作处理，做三个平行组。

实验结果如表8-1和8-2所示，使用全营养微生物生防有机肥后，全营养微生物生防有机肥对番茄根腐病的相对防效达到66.67％，有效的改善土壤的理、化、生性状，番茄产量增加约60.78％。

表8-1全营养微生物生防有机肥对番茄根腐病的防治效果(山东聊城)

表8-2全营养微生物生防有机肥对番茄根腐病的防治效果(山东聊城)

注：R_0,25表示大于0.25mm水稳性团聚体总量。

试验例9全营养微生物生防有机肥对梨树腐烂病的防治效果

在山东烟台实验地块，秋天处理，分别施用实施例1～3制备的全营养微生物生防有机肥，即为实验组Ⅰ、实验组Ⅱ、实验组Ⅲ，施用量均为每颗苹果树用10公斤的全营养微生物生防有机肥，然后翻土，记为实验组，对照组不做处理。

实验结果如表9-1所示，全营养微生物生防有机肥对梨树腐烂病的防治效果达64.5％。

表9-1全营养微生物生防有机肥对梨树腐烂病的防治效果

试验例10全营养微生物生防有机肥对花生产量及性状的影响

在山东招远实验地块，试验组和对照组为30m²花生试验田，在播种前，对试验组的土壤进行处理，分别施用实施例1-3制备的全营养微生物生防有机肥，即为实验组Ⅰ、实验组Ⅱ、实验组Ⅲ，施用量均为150公斤/亩的全营养微生物生防有机肥，然后翻土，对照组不作处理。

实验结果如表10-1所示，使用全营养微生物生防有机肥之后，与对照组相比，处理组的花生产量明显提高56.92％。

表10-1全营养微生物生防有机肥对花生产量及性状的影响

Claims

1.一种全营养微生物生防有机肥的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(2)将步骤(1)平板培养后的拟康氏木霉(Trichodermapseudokiningii)TRIPI和黑根霉(Rhizopusnigricans)RN-9菌丝块转接至PDB培养基中，进行PDB液体培养，制得液体培养液；

(3)将步骤(2)制得的液体培养液按体积比为1:(1～3)接种于麸皮葡萄糖培养基中，经发酵培养，制得发酵液；

上述麸皮葡萄糖培养基每升组分如下：

麸皮50～70克，葡萄糖20克，琼脂18-20克，水定容至1L；

(5)按步骤(4)制得的发酵料质量的0.02％～0.05％加入甲壳素、7.0％～8.0％加入尿素、0.5％～1.5％加入硫酸钙(CaSO₄)、5.0％～12.0％加入三水合磷酸氢二钾(K₂HPO₄·3H₂O)、1.0％～5.0％加入凹凸棒土，混合均匀，然后按步骤(4)制得的发酵料质量的1％～5％加入甲基纤维素、1％～5％加入羧甲基纤维素钠、1％～5％加入乙基纤维素，混合均匀，制得全营养微生物生防有机肥；

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的培养条件为在25℃～30℃培养36h～60h。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的菌丝块为用内径为5mm的打孔器在菌落边缘打孔后，用接种环挑取获得。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的液体培养条件为在25℃～30℃、100～150rpm条件下，培养8～15天。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，液体培养条件为在28℃、120rpm条件下，培养10天。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中的发酵培养条件为在25℃～30℃、100～150rpm条件下，培养3～5天。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，发酵培养条件为在28℃、120rpm条件下，培养4天。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中的农家肥原料为作物秸秆、树叶、杂草。

9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中的粉碎为粉碎至长度1～3cm。

10.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中的堆料发酵为：将堆料堆成截面为宽1.5～2.5m、高0.8～1.2m的条形堆，每天翻堆3～4次。