CN102296036B

CN102296036B - 一株短小芽孢杆菌及其在防病促生中的应用

Info

Publication number: CN102296036B
Application number: CN 201110146683
Authority: CN
Inventors: 王静; 孔凡玉; 张成省
Original assignee: Tobacco Research Institute of CAAS
Current assignee: Shandong Shibang Agrochemical Co ltd
Priority date: 2011-06-01
Filing date: 2011-06-01
Publication date: 2012-12-26
Anticipated expiration: 2031-06-01
Also published as: CN102296036A

Abstract

本发明公开了一株短小芽孢杆菌，命名为：短小芽孢杆菌Bacillus pumilus，已于2010年08月23日由中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCC No.4117。本发明的短小芽孢杆菌可以用于制备生物防治烟草或蔬菜真菌病害的菌剂，也可以用于制备促进烟草或蔬菜生长的生长剂，能够促进作物生长，尤其是烟草。该菌株热稳定性好，抗逆性强，促生效果俱佳，是优质的微生物农药，是优质的微生物农药资源。可以预见，本发明的菌株将有着广阔的应用前景。

Description

一株短小芽孢杆菌及其在防病促生中的应用

技术领域

本发明涉及一株短小芽孢杆菌，及其在防治烟草真菌、细菌病害以及促生中的应用。

背景技术

烟草从育苗到收获，往往会遭受多重真菌病害的危害，国内有记载的烟草真菌、细菌病害60余种，其中危害重的近10种，主要包括烟草黑胫病、烟草青枯病、赤星病、炭疽病、低头黑病及白粉病等。有些病原可在烟草的各个生育期危害，有些病原只在烟草的某个生育期危害某些器官；除此之外，有些烟草病害如烟草白粉病等有一定的区域性，另外一些病害如烟草黑胫病、烟草赤星病和烟草炭疽病几乎没有区域限制，常随着不同年份的气候而发生流行。随着烟草专业化生产的不断发展，对品质产量的要求越来越高，加强研究和防治烟草真菌病害是保证烟草优质、高产的主要措施。

近年来，烟草真菌和细菌病害的危害呈上升趋势，造成烟田严重减产。据全国烟草病虫害预测预报及综合防治网统计，2007和2008年16个烤烟主产省真菌、细菌病害发生面积均累计800万亩以上，产量损失3000万千克以上，产值损失3亿元以上，烟草病害的危害已成为制约我国烟草产业发展的一个重要瓶颈。

烟草主要真菌和细菌病害的症状及危害如下：(1)烟草黑胫病：病原菌主要从茎基部侵染并产生黑斑，很快向茎上扩展，病株叶片自上而下依次变黄，纵剖病株茎部，髓部变黑褐色，干缩成碟片状，碟片间可见白色菌丝。病原菌为烟草疫霉菌。目前，烟草黑胫病除东北烟区零星发生外，全国其它烟区均普遍发生，我国烤烟平均每年因烟草黑胫病造成的经济损失达1亿元以上，仅次于烟草病毒病。(2)烟草青枯病：该病在我国俗称为“烟瘟”、“半边疯”，是由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种细菌性维管束病害，发病烟株叶片萎蔫下垂直至枯死。对烟草产量和质量影响极大，是威胁世界烟草生产的毁灭性病害之一，在中国南方烟区普遍发生，目前该病造成的损失已各类侵染性病害第4位，必须重视该病的防治工作；(3)烟草赤星病：又称“火炮斑”，一般从下部叶片开始发生，以后逐渐向上部叶片发展，最初叶片上出现黄褐色斑点，以后变成褐色，病斑产生明显的同心轮纹，质脆，易破，病斑边缘明显，外围有淡黄色晕环，病斑中央有黑色的霉状物；是烤烟生产上主要病害之一，多发生于生长中后期，对烤烟生产影响很大。(4)烟草炭疽病：多发生于苗期，发病初期，在叶片上产生暗绿色水浸状斑点，1-2d内可扩展成直径2-5mm的圆斑，中央为灰白色或黄褐色，稍凹陷，边缘明显，稍隆起呈赤褐色，俗称“水点子”，天气多雨时叶片柔嫩，病斑多呈褐色，有时有轮纹或产生小黑点即病原菌的分子孢子盘。茎上病斑较大，呈网状纵裂条斑、凹陷。病原为烟草刺盘孢菌。

鉴于化学防治对环境的污染和生态平衡的破坏，因此烟草病害的生物防治越来越被重视。利用有益微生物防治植物病害，已成为一个十分活跃并开始显示良好应用前景的领域。许多论著报道(Cook，K.J.and Baker K.F.The nature and practice of biological controlof plant pathogens.1984，APS press USA)认为生物防治在未来农业中具有重要地位。大量的研究表明，无论是自然发生的生物防治现象还是人们用于生物防治的生物类型中，生防细菌的作用是非常明显的。其主要优势在于：1)细菌的种类和数量众多，在植物根际和地上部大量存在；2)细菌对病原菌的作用方式较广，可以通过竞争、拮抗和诱导植物产生抗性等方式对病原菌产生影响；3)具有惊人的繁殖速度；4)许多细菌存在于植物根际和地上部，对植物的生态比较适宜；5)细菌大多可以人工培养，便于控制，在实践中易于操作；6)有些细菌不仅能防治病害而且可以增加作物产量。

因此本发明将从生物防治方面进行探索，筛选防效促生效果好的拮抗细菌菌株，并对其防病促生效果进行研究，为将来通过常规和分子生物学途径，利用这些拮抗细菌及其抗菌物质防治烟草真菌和细菌病害提供研究基础和实验材料。

在植物的根围、叶围及其它微生态区系中，拮抗细菌广泛存在，且由于培养方便、生长周期短、作为新拮抗菌来源具有很大的开发潜力。烟草真菌病害是危害烟草生产中最严重的病害，每年都造成烟叶产量的严重损失和品质下降，是烟草生产中一个很重要的制约因素。如何有效地防治和减轻烟草真菌病害的危害一直是许多科研工作者的目标。不合理的化学防治不仅提高了防治成本导致烟叶农药残留量增加，且抗药性不断增强，影响烟叶质量；选育抗病品种很难，且抗性容易丧失。因此不断寻找新的烟草真菌、细菌病害防治方法是一项长期的任务。国内对烟草真菌、细菌病害的生物防治已有报道，但多数生防菌株仅针对于某一种病害有良好的防治效果，对多种真菌、细菌病害病原菌均具有生防作用的芽孢杆菌菌株国内鲜有研究和报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一株防病促生生防短小芽孢杆菌菌株，其可用于烟草真菌、细菌病害的生物防治，为真菌、细菌病害的防治提供了新的微生物资源。

本试验将从生物防治方面进行探索，筛选防效促生效果好的拮抗细菌菌株，并对其防病促生效果进行研究，为将来通过常规和分子生物学途径，利用这些拮抗细菌及其抗菌物质防治烟草真菌和细菌病害提供研究基础和实验材料。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一株短小芽孢杆菌，命名为：短小芽孢杆菌Bacillus pumilus，已于2010年08月23日由中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCC No.4117。

本发明的菌株菌株具有蛋白酶活性，室内拮抗试验显示该菌株对烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var.nicotianaer)、烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)、赤星病菌(Alternaria alternata(Fries)Keissler)及炭疽病菌(Colletotrichum micotianae verna)均有较好的抑制作用；其发酵液抑制黑胫病菌和赤星病菌菌丝的生长并致菌丝畸形、膨大。

本发明针对烟草主要真菌和细菌病害病原菌：烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var.nicotianaer)、烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)、赤星病菌(Alternaria alternata(Fries)Keissler)及炭疽病菌(Colletotrichum micotianae verna)，通过室内平板对峙法和活体温室防效测定，筛选出在温室条件下对具有良好防病作用的拮抗菌株AR03，测定其16srDNA全序列，应用其中的BLAST软件和DNAMAN软件进行分析，AR03菌株的序列与短小芽孢杆菌16s rDNA部分序列相同，同源性100％，因此鉴定AR03菌株为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)。该菌株的培养条件为30℃，普通牛肉汁蛋白胨培养基，pH7.0。该菌株为芽孢杆菌属(Bacillus)、短小芽孢杆菌种；经鉴定，关于该菌株的信息包括：能形成芽孢；含菌发酵液对上述三种真菌的抑制作用显著，而除菌发酵液对病原真菌无抑制作用(见图2)。

生物学测定表明，AR03菌体及发酵液在牛肉汁平板上能够抑制黑胫病菌、烟草赤星病菌及炭疽病菌及青枯雷尔氏菌的生长；AR03菌体对黑胫病菌菌丝的抑制表现为处理后的菌丝细胞质聚集为球状，与细胞膜脱离，不能正常生长；AR03菌体对赤星病菌菌丝的抑制表现为分隔菌丝严重变形、膨大，顶端生长畸形。

另外，AR03菌株尚具有蛋白酶活性(见图9)。防病试验显示，AR03菌株发酵液对烟草黑胫病的防治效果理想，不但能推迟烟草黑胫病的发病时间；在接种后第30d时，AR03发酵液处理的防效达到68.4％，高于对照药剂58％甲霜·锰锌处理的防效。对青枯病的防治试验显示，AR03发酵液对烟草青枯病的防效为70.2％。

促生试验结果显示，在自然菌土中，经AR03处理后烟苗的各指标均比对照高，平均株高、整株鲜重、整株干重和根干重的增长率分别是42.5％、39.0％、109.4％和130.2％，促生作用明显。

由上可见，本发明的短小芽孢杆菌可以用于制备生物防治烟草或蔬菜真菌病害的菌剂，也可以用于制备促进烟草或蔬菜生长的生长剂，能够促进作物生长，尤其是烟草，蔬菜可以是黄瓜、辣椒、茄子、番茄等。

本发明通过优化菌株AR03的发酵条件，建立了AR03最佳发酵条件为：0.9％牛肉膏+1.5％蛋白胨+1％葡萄糖+0.5％NaCl；发酵起始pH值为7.3、300ml的三角瓶装瓶量为60ml、接种量为8％、温度为31℃、转速为140r/min，发酵时间为36h。利用AR03固体发酵菌剂防治烟草黑胫病的田间试验结果显示，AR03与72％甲霜灵锰锌联合使用的防效和促生作用最佳，单独施用AR03效果次之，均好于单独施用化学药剂。该菌株热稳定性好，抗逆性强，促生效果俱佳，是优质的微生物农药，是优质的微生物农药资源。可以预见，本发明的菌株将有着广阔的应用前景。

附图说明

本发明的短小芽孢杆菌命名为Bacillus pumilus，已于2010年08月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNO.4117，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，邮编：100101。

图1为实施例1中AR03对烟草黑胫病菌的拮抗活性示意图，其中，左为AR03，右为空白对照。

图2为AR03发酵液对烟草黑胫病菌的拮抗活性。其中，上面两皿为AR03除菌发酵液处理，下面皿为无菌水处理。

图3为AR03对黑胫病菌菌丝生长的抑制作用示意图，其中，左为黑胫病菌正常菌丝，右为AR03处理后畸形菌丝。

图4为AR03对烟草赤星病菌的拮抗活性示意图，其中，左为AR03，右为空白对照。

图5为AR03发酵液对烟草赤星病菌的拮抗活性示意图，其中，左为AR03发酵液，右为无菌水。

图6为AR03对赤星病菌菌丝生长的抑制作用示意图，其中，左为黑胫病菌正常菌丝，右为AR03处理后畸形菌丝。

图7为AR03对烟草炭疽病菌的拮抗活性示意图。

图8为AR03对青枯雷尔氏菌的拮抗活性示意图。

图9为AR03蛋白酶活性示意图。

图10为AR03菌株对烟草青枯病盆栽防治效果示意图，其中，右为AR03发酵液灌根处理，右为CK。

图11为AR03菌株促生作用示意图，其中，左为AR03处理，右为对照。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1 AR03及其发酵液对烟草主要真菌、细菌病害病原菌的拮抗作用

接种AR03于NA平板上30℃培养48h，然后采用平板对峙法，即在燕麦平板上接种黑胫病菌、赤星病菌、炭疽病菌菌饼(直径为3mm)，用接种环挑取AR03并以菌饼为中心等距离划线，置于30℃培养5d，对青枯雷尔氏菌的抑制采用平板扩散法；观察AR03对上述各致病菌的抑制情况。从室内平板抑菌效果看，AR03菌体对烟草黑胫病菌、赤星病菌、炭疽病菌及青枯雷尔氏菌均具有很好的抑制作用(见图1、4、7和8)。

AR03菌株发酵液的拮抗活性是将活化的AR03接种于NB培养基中30℃振荡培养48h得到发酵液，分别取其含菌发酵液和去菌体后的上清液按照滤纸条法测定其对黑胫病菌的拮抗活性，具体方法如下：分别在无菌滤纸条(7mm×3mm)均匀滴入50μl，按照十字交叉方向小心将滤纸条置于培养皿中，然后将黑胫病菌和赤星病菌菌饼等距离接种在滤纸条的空当中，30℃培养5d，观察烟草黑胫病菌的拮抗活性，从结果可以看出，AR03含菌发酵液对烟草黑胫病菌、赤星病菌均有很强的拮抗作用，而除菌上清液无抑制作用(见图2、5)。

实施例2 AR03发酵液对烟草黑胫病的盆栽防治效果

AR03发酵液对烟草黑胫病和青枯病的盆栽防治效果：采用AR03发酵液灌根的方法处理烟苗，具体方法如下：将活化的AR03菌株接入NB培养基中，摇床振荡培养48h后，稀释100倍(培养液浓度为1*10⁸cfu/ml)，备用。黑胫病菌菌谷的制备：黑胫病菌活化后，接入装有谷子培养基的三角瓶中，恒温(28)培养8d，即黑胫病菌长满谷子培养基后从三角瓶中取出，碾碎即得到菌谷。供试烟草品种为小黄金1025，取3-4片叶烟苗，移栽到花盆中，用AR03培养液灌根，每株50ml，间隔7天连续灌根2次。第一次灌根后5天接种黑胫病菌菌谷，方法是在烟苗的茎基部挖穴，施入2克/株，然后封穴。共处理12株烟苗复，对照药剂为58％甲霜灵·锰锌可湿性粉剂，600倍稀释，每株灌根50ml，间隔7天连续灌根2次；设空白CK。调查结果显示(见表1)，第1次调查，即接种后15d，拮抗细菌AR03培养液(1×10⁸cfu/ml)对烟草黑胫病的的田间防治效果为79.3％，而对照药剂58％甲霜.锰锌WP的防效仅为64.8％，差异显著；第2次调查，即接种后30d，AR03菌株对烟草黑胫病的防治效果下降为68.4％，而对照药剂的防效为60.6％，差异不显著。

表1拮抗细菌AR03培养液防治烟草黑胫病试验^*

实施例3 AR03菌株对黑胫病菌、赤星病菌菌丝生长的抑制作用

以黑胫病菌和赤星病菌为靶标菌，即接种AR03于NA平板上30℃培养48h，然后采用平板对峙法，即在燕麦平板上接种黑胫病菌、赤星病菌，用接种环挑取AR03并以菌饼为中心等距离划线，置于30℃培养5d，分别挑取黑胫病菌和赤星病菌菌饼边缘菌丝于显微镜下镜检(见图3与图6)，结果显示经AR03处理后的黑胫病菌菌饼边缘菌丝与正常菌丝相比，其细胞质聚集为球状，与细胞膜脱离，不能正常生长；而经AR03处理后的赤星病菌菌饼边缘菌丝与正常菌丝相比，抑制作用表现为分隔菌丝严重变形、膨大，且顶端生长畸形。挑取畸形的边缘菌丝于燕麦培养基上培养，不能正常生长。

实施例4 AR03菌株蛋白酶活性测定

蛋白酶活性测定采用蛋白培养基进行，蛋白培养及配方为：脱脂奶粉10克，琼脂3克，蒸馏水定容至200ml，121℃灭菌，备用。测定方法如下：将蛋白培养基溶化并制成平板。取灭菌牙签将AR03菌株点接于蛋白培养基平板上，接菌后培养2-4d，观察菌落生长情况和透明圈的大小，分别测定透明圈直径R₂与菌落直径R₁，利用R₂/R₁比值定性表示其蛋白酶活性。结果显示(见图9)，AR03菌株有蛋白酶活性，其酶活大小，即R₂/R₁为1.40。AR03菌株的蛋白酶活性显示了该菌株对真菌的抑制机理-寄生作用，即通过产生酶来降解寄主病原菌的细胞壁。

实施例5采用剪叶法测定AR03发酵液对烟草青枯病的盆栽防效

AR03发酵液对烟草青枯病的温室防效：(1)幼苗灌菌：取4-5片真叶烟苗移栽于装有灭菌土的育苗盘中，缓苗后约3d，于根际接种拮抗菌菌悬液，取5ml浇淋于茎基部，充分保护烟株根际。如上述方法重复接种两次，间隔为7d。对照接入等量清水。(2)接种发病：1d后，将繁殖的青枯菌配制成1×10⁶cfu/ml的菌悬液，剪叶法接种，接种方法如下：即在烟苗苗从顶部往下第3和第4片全展开叶片上，用灭菌剪刀蘸上青枯菌菌悬液后于叶片单侧剪一刀口，剪口约长2.5-3.0cm，用无菌水接种为对照，每处理各50株烟苗。接种后于30℃保湿培养2d。(3)观察记录：置放于温室28-30℃条件下观察烟株发病情况。见病株后，逐日观察植株症状表现至第20d。根据幼苗发病速度及病斑扩展程度分为5个级别：0级：无明显症状；1级：剪口区褪绿变黄；2级：剪口区形成黄色坏死斑或褐色坏死斑；3级：剪口区形成褐色坏死斑并沿叶脉扩展；4级：剪口区坏死斑迅速扩展至茎基部，且植株萎蔫。计算发病率及根据病情分级计算病情指数，公式为：

试验结果(见表2、图9)显示，AR03发酵液对烟草青枯病的防效为70.2％，且经发酵液处理的烟苗叶片大且叶色浓绿，茎秆粗壮，长势好。

表2 AR03发酵液对烟草青枯病的防治效果

实施例6 AR03发酵液对烟草的促生作用

AR03菌株促生作用的测定：实验采用营养盘种植方式，于自然土中进行，幼苗浸根的方式处理烟苗，方法如下：将大田壤土∶农家肥∶蛭石按照7∶2∶1比例配制基质，将自然土填装于育苗盘中。小心挖出3-4片真叶的烟苗，轻轻抖落附着于根部的土壤，并将其浸泡于预选配制好的待测生防菌菌悬液(浓度约为10⁸cfu/ml)中，40min后取出并移栽育苗盘中，间隔7d后，用菌悬液灌根1次，5ml/株；对照为清水处理。每处理10株，三次重复，于温室30℃保湿培养。末次处理后20d，随机选取10株烟苗，小心将苗整株挖出，洗去根部泥土，测量其株高、整株鲜重、根鲜重等指标。然后180℃烘干至恒重，测整株干重及根干重(见图10、表3)。促生实验结果表明，接种生防菌AR03于自然土中种植的烟苗时，能够明显促进烟草生长，整株鲜重和干重增长显著，且叶色浓绿，叶片肥厚且大；在自然菌土中，测定AR03处理后烟苗的各指标均比对照高，平均株高、整株鲜重、整株干重和根干重的增长率分别是42.5％、39.0％、109.4％和130.2％，促生作用明显，同时也说明AR03对烟草是安全的。

表3 AR03菌株对自然土中烟草的促生作用测定

实施例7 AR03菌株分类地位的分子鉴定

以AR03菌体基因组DNA为模板，PCR反应扩增得到一条1.4kb左右的特异性片段，回收该片段进行序列测定，结果表明，AR03菌株16s rDNA基因片段长度为1380bp，通过INTERNET网(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)，用BLAST软件将AR0316s rDNA序列与Genbank中已知序列进行比较。在Genbank数据库中搜索发现，AR03菌株的16s rDNA序列与芽孢杆菌属细菌的16s rDNA序列相似，比对结果中Bacillus pumilus一类菌株占到90％以上，其次是Bacillus sp.，并且一致性都达到了99％。从比对结果中选取了11个菌株，与菌株AR03进行比对并得到图3所示的系统发育树(见图11)。通过对上图发育树的分析发现，菌株AR03与Bacillus pumilus的亲缘关系最近，结合AR03形态特征、培养特征及生理生化指标测定等表型鉴定结果，鉴定AR03菌株为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。

实施例8 AR03菌株摇瓶发酵条件优化、固体发酵及其田间防效

1摇瓶发酵条件的优化方案：试验所用的种子培养基为牛肉汁培养基(1000ml水中加酵母粉0.5g+葡萄糖10g+蛋白胨5g+牛肉膏3g)；待测培养基的配制如下：

(1)号培养基：淀粉0.15％+葡萄糖0.5％+尿素0.1％+磷酸氢二钾0.3％+磷酸二氢钾0.15％+硫酸镁0.05％+酵母膏0.02％+氯化铁0.01％+碳酸钙0.01％+豆粕1％；

(2)号培养基：淀粉0.15％+葡萄糖0.5％+尿素0.1％+磷酸氢二钾0.3％+磷酸二氢钾0.15％+硫酸镁0.05％+酵母膏0.02％+氯化铁0.01％+碳酸0.01％+豆粕1％+30.8mg/l的硫酸锰溶液0.1％；

(3)号培养基：牛肉膏0.3％+蛋白胨1％+葡萄糖1％+氯化钠0.5％；

(4)号培养基：牛肉膏0.3％+蛋白胨1％+葡萄糖1％+氯化钠0.5％+淀粉0.3％+30.8mg/l的硫酸锰溶液0.1％；将4种不同培养基pH值均调为7.2～7.3，装液量为60ml/300ml。121℃灭菌20min，备用。

将种子培养基培养的种子菌液接种于上述4种培养基，接种量为1.5ml，在31℃条件下，摇菌36h后取5ml发酵完毕的菌液，在12000r/min下离心8分钟，倒掉上清，冷冻干燥沉淀，称取重量。优化发酵条件即每次只改变测定的接种量、温度、转速及发酵时间其中一个发酵条件，其它方法同上。

通过对该菌培养基配方和培养条件的优化选择以及正交试验，初步确定最适宜AR03菌株生长的培养基配方及培养条件如下：0.9％牛肉膏+1.5％蛋白胨+1％葡萄糖+0.5％NaCl；发酵起始pH值为7.3、装液量为60ml/300ml、接种量为8％、温度为31℃、转速为140r/min，发酵时间为36h。这为AR03菌株的发酵罐放大试验提供了理论依据。

2AR03固体发酵：将生防菌AR03接种于装有液体种子培养基的三角瓶中，装液量为60ml/300ml，31℃温控振荡培养，150r·min^-1，至芽孢率90％以上停止，时间为24h左右。将AR03的液体种子培养物以8％的接种量接种于盛有固体发酵培养基的三角瓶中，于31℃恒温培养，间时拍打瓶壁，使发酵物均匀生长。72h后停止发酵，并于65℃烘干、碾碎即得到AR03固态生防菌剂。

活菌计数采用混匀平皿活菌计数法。称取10克AR03固态培养物加入带玻璃珠的盛有90ml无菌水的三角瓶中静置20分钟后在摇床上200r/min充分振荡30min即成母液的菌悬液，得到1∶10浓度。用无菌吸管吸取1ml上述1∶10浓度母液的菌悬液加入盛有9ml无菌水的离心管中，混匀成1∶100的稀释的菌悬液；然后按照十倍稀释法制成不同浓度稀释液，从三种合适的稀释液中分别吸取0.1ml置于无菌培养皿内，每一稀释度重复3次，将融化并冷却至50℃左右的NA培养基倒入培养皿中，每皿约12ml，混匀凝固后，30℃倒置培养48h，进行菌落记数；同时设无菌水为空白对照。活菌量的计算公式如下：

芽孢率：采用芽孢革兰氏染色后显微镜下观察。

采用液体种子接种，当接种量为8％(V/W)时，培养时间72h的固态菌剂的菌体浓度高达3.82×10¹¹cfu/g，芽孢形成率为90％以上，说明试验所选择的固态发酵培养基很适合AR03菌株的生长。

3AR03固体发酵菌剂对烟草青枯病和黑胫病混合发生病害的田间示范：试验地点设在云南文山州广南县珠琳镇白泥塘白泥井(历年青枯病与黑胫病发病较重且均匀)，试验地块为典型红黄壤山地地块，土壤肥力中等，土壤pH为6.10～7.92，移栽苗为漂浮苗，于3月1日播种，5月4日移栽。亩施纯氮7kg(所用复合N∶P∶K＝8∶12∶24)，管理按当地优质烟生产技术进行。各处理的栽培规格、肥水条件一致。试验共设4个处理和1个空白对照，大区试验，不设重复，各处理示范面积为1亩。分别是：

A：生防菌剂AR03颗粒剂2.5kg/亩：穴施于烟根周围，每穴施入2g颗粒剂并用土覆盖。

B：生防菌剂AR03颗粒剂1.25kg/亩与72％甲霜灵.锰锌可湿性粉剂混施，穴施于烟根周围，每穴施入1g颗粒剂并用土覆盖；72％甲霜灵.锰锌可湿性粉剂用量为50g/亩喷淋茎基部。

C：72％甲霜灵.锰锌可湿性粉剂：用量为100克/亩，喷淋茎基部。

D：72％农用链霉素可湿性粉剂：用量为25克/亩，喷淋茎基部。

E：空白对照。

施药方法为团棵期之前施用一次，间隔7d，再施药1次，共2次。防治效果调查：最后一次施药后30天调查病情和田间烟株生物学性状，每示范区5点法取样，每点调查50株，记录病株、病级；严重度分级按全国烟草行业烟草病害调查分级标准Yc/T39-1996进行。病情指数和防治效果按烟草病害药效试验方法Yc/T40-1996计算。

从试验结果可以看出，4个处理中防治效果最好的为B处理，即生防菌剂AR03颗粒剂1.25kg/亩与72％甲霜灵.锰锌混施，其防治效果为66.0％；其次为A处理，即穴施生防菌剂AR03 2.5kg/亩，防治效果为60.7％；单施72％甲霜灵.锰锌和72％农用链霉素的防效分别为54.8％和50.3％；在5％水平下，生防菌A和B处理与化学药剂C和D处理的差异显著(见表4)。

表4不同处理对混合发生黑胫病、青枯病的防治效果

*：5点取样法，每点调查50株，Duncan新复极差法进行方差分析。

综上所述，本发明获得的短小芽孢杆菌菌株AR03菌株具有如下特性：(1)AR03菌体及其含菌发酵液对烟草主要真菌病害病原菌具有很好的抑制作用；(2)具有良好的促生效应，盆栽试验结果表明，对于在灭菌土或非灭菌土中种植的烟苗的促生作用显著，尤其是促进根的干物质积累；(3)提供了适合AR03菌株生长的摇瓶发酵条件及其固体发酵，为该生防菌的推广应用提供基础；(4)AR03与72％甲霜灵锰锌联合使用的防效和促生作用最佳，单独施用AR03效果次之，均好于单独施用化学药剂，这亦初步验证单独施用AR03对混合发生的烟草黑胫病和青枯病的控病效果，并显示出与化学农药协同作用控制烟草根茎病害的优势，发挥了生物农药的持效、安全及化学农药的速效作用从而达到了减量增效的作用，同时也是发展现代烟草农业，提高烟叶安全性所倡导的重要方向。

Claims

1.短小芽孢杆菌在防治赤星病菌及炭疽病菌中的应用，其特征在于：该菌株命名为：短小芽孢杆菌Bacillus pumilus，已于2010年08月23日由中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCC No.4117。