CN103399143B - 快速鉴定烟草炭疽病抗性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明“快速鉴定烟草炭疽病抗性的方法”，属于植物抗病性鉴定技术，其特征在于利用炭疽菌毒素浸叶圆片，通过测量和统计病斑扩展程度，衡量材料抗性，与传统的炭疽病人工接种抗性鉴定方法比较，本发明在人工控制的稳定条件下进行，发病条件一致；操作过程简单，鉴定周期短，接种效率高，可同时分别鉴定同一材料对不同病原菌的抗性，且不影响正常幼苗生长发育和开花结实；达到了简单、高通量、快速准确的鉴定烟草及其种质对炭疽病抗性的目的，在烟草炭疽病抗性筛选上具有很大的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及植物抗病性鉴定技术，特别是一种快速鉴定烟草炭疽病抗性的方法。
背景技术
烟草炭疽病是由毁灭炭疽菌引起(Colletotricum destructivum)，该病原属于真核生物真菌界（Fungi），半知菌亚门（Deuteromycotina），腔孢纲(Coelomycetes)，黑盘孢目(Melanconiales)，炭疽菌属(Colletotricum)。该菌的菌丝体有分枝和隔膜，子座上着生分生孢子盘，分生孢子盘中生有暗褐色有隔膜的刚毛；分生孢子盘上密生分生孢子梗，单胞，棍棒状，上着生分生孢子。分生孢子长筒状，两端钝圆，单胞，无色，两端各有一油球。寄主主要是茄科蔬菜，如马铃薯、番茄、茄子、心叶烟等，同时也可为害黄瓜、西瓜、南瓜、三叶草。
炭疽病是烟草苗床期及大田期烟株中下部叶片的主要病害之一，各产烟省区均普遍发生，叶片感病。苗期发病，其症状特点是叶片上先显现暗绿色水渍状小点，1-2d后可扩大成直径2-5mm的病斑；病斑边缘黄褐色或褐色，中央灰白色，稍凹陷，后期病斑中央破碎、穿孔；病斑较多或较大时，常使叶片折断或幼苗倒折。烟苗十字期，有时在3-4d内侵染整个苗床，造成烟苗生长缓慢，大量萎蔫死亡。成株发病则多从下部叶片开始，逐渐向上蔓延，造成烟叶减产降质。在潮湿条件下，病斑上可产生稀疏的小黑点（分生孢子盘）。病斑密集时，常愈合成大斑块或枯焦似火烧状，所以又被俗称为“热瘟”或“烘斑”。
此病在烟草各生育期皆可发生，但以苗期发生普遍而严重。幼苗叶片病斑密布，严重发病时往往使整片烟苗毁掉，一般发病时虽不至于苗毁，但幼苗生势差，而且移栽大田后仍可继续为害，导致较大损失。近年来，在各烟区采取集约化育苗的过程中，烟草炭疽病的发生较为普遍，且有逐年加重的趋势，影响了育苗的质量。目前对该病害的防治主要依靠化学防治，但农药的大量和长期使用已给人、畜健康、环境和农田生态系统带来不良影响，且有害生物也会逐渐产生抗药性。
选育和利用抗病品种是防治病害最基本、最重要的措施。抗病育种从选育到利用都离不开抗性鉴定，抗性鉴定是抗病育种过程中的一项基础性工作。烟草炭疽病的抗性鉴定一般采用人工接种鉴定（GB/T23224-2008），并且受生育期的约束及环境条件的影响，耗时费工。毒素是病原菌产生的对寄主有毒害作用的次生代谢物；植物病原真菌产生的毒素是一类对寄主植物有毒害作用的代谢产物，是病原真菌与寄主植物互作中的重要致病因子。利用病原菌的毒素液代替产毒菌株进行品种抗病性鉴定，已得到应用（台莲梅等2006；董金皋1997；郭永峰等1995）具有快速、简便、不受季节限制等特点，试验可在短期内重复进行。研究利用该毒素鉴定烟草对炭疽病的抗性，发明一种快速、简便鉴定品种抗性的方法。也必将在生产实践中起到理论上的指导作用。
发明内容
本发明根据上述领域存在的空白和需求，提供一种利用毒素鉴定烟草炭疽病抗性的方法。
1.快速鉴定烟草炭疽病抗性的方法，其步骤如下：
（1）富集烟草炭疽病菌(Colletotrichum destructivum)分泌的无菌体毒素液；
（2）准备培养皿：培养皿底部铺滤纸，在滤纸上加无菌体毒素液使滤纸充分浸湿；
（3）在供试品种的叶片上取形状规则的小叶片，并将所述小叶片分散于无菌体毒素液浸湿的滤纸上，在所述小叶片上再覆盖一层被毒素浸湿的滤纸；
（4）盖好培养皿后置于18℃～35条件下培养2天；
（5）统计小叶片上病斑扩展宽度确定供试品种的抗病性强弱。
2.根据权利要求1所述的方法，富集所述无菌体毒素液的步骤如下：
将烟草炭疽病菌菌株移至马铃薯葡糖糖固体培养基上培养5～10天，用打孔器在菌落边缘打取菌饼，挑取3个菌饼放置于装有马铃薯葡糖糖液体培养基的三角瓶中，于黑暗下、26℃、以120r/min恒温振荡培养15天；
将培养液于10000r/min离心15min，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后的滤液为所述无菌体毒素液，4℃保存备用。
3.根据权利要求1所述的方法，所述形状规则的小叶片指采用打孔直径为5mm的打孔器打取的叶圆片。
4.根据权利要求3所述的方法，每个培养皿中放置8-10个所述叶圆片。
本发明的方法可用于抗病育种的大量初筛工作；与传统人工接种鉴定的检测方法比，本发明具有以下突出的有益效果：
（1）只需少量病菌分泌的毒素液即可满足试验需要，工作量小；
（2）毒素液4℃保存，随时可以利用，无需每次鉴定都重新采集、活化菌种并分离培养；
（3）本发明在可控环境条件下进行，发病条件一致，且接种方法简单，抗性鉴定历期短，不受烟草生长季节的限制。
（4）接种效率高；可对单株进行重复鉴定，适合对材料进行大规模接种鉴定。
本发明中，叶圆片病斑坏死的分级标准：0级（-），无症状（免疫I或高抗HR）；Ⅰ级(+)：仅有狭小的失绿边缘(R)；Ⅱ级（++）：2mm以内叶圆片边缘失绿(MR或耐病)；Ⅲ（+++）：2mm-4mm以内叶圆片失绿（S）；Ⅳ（++++）：4mm以上至叶圆片全部失绿甚至腐烂(HS)。
附图说明
图1供试品种炭疽病人工接种
其中a:N.nudicaulis；b:N.debneyi；c:N.paniculata；d:象耳朵烟；e:K326
图2毒素浸渍叶圆片法抗性鉴定
图3离体毒素浸渍法与人工接种法进行抗性鉴定比较
其中1：中烟100；2：NC89；3：小黄金1025；4：CN9787；5：HC100；6：NC95
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1.烟草炭疽病毒素抗性鉴定
以在田间分别表现为免疫的N.nudicaulis,高抗的N.debneyi,抗病的N.paniculata,中抗的象耳朵烟，感病的K326为供试品种（参照《中国烟草病害》，第8页）
烟草种子由中国农业科学院烟草所品种资源组提供。
供试烟草植株为4～5叶期。
炭疽病菌种菌株名称及其来源：炭疽病菌T1，分离自山东诸城。参考文献：“一株烟草炭疽病病原菌鉴定和生物学特性研究”（《植保科技创新与现代农业建设》中国植物保护学会2012年学术论文集），P：78-83
用于本发明的菌种及烟草品种均为目前均已知，且中国农业科学院烟草研究所有保存，自申请日起20年内可向公众发放用于验证试验。
1.采用离体叶圆片浸渍法鉴定烟草品种的抗性。
具体步骤：
（1）供试烟草叶圆片准备：一个实验人员（该人员准备好叶圆片之后不再参与该实验）将供试的5个品种分别采用阿拉伯数字进行编号，然后用直径为15mm的打孔器分别打取5个供试材料的叶片，得到编号为1～5的叶圆片；以下步骤由另外的人员进行。
（2）利用毒素离体鉴定烟草炭疽病抗性方法，包括以下步骤：（1）毒素制备：将烟草炭疽病菌菌株接种至移至PDA培养基上培养8d后，用直径为5mm的打孔器在菌落边缘打取菌饼，挑取3个菌饼放置于装有250ml的于PDB（马铃薯葡糖糖液体培养基）的三角瓶中，黑暗下26℃摇床恒温振荡（120r/min）培养15d。将培养液于10000r/min离心15min，除去沉淀的上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后所得到的滤液即无菌体的毒素虑液，保存于4℃条件下备用；
（3）吸取8ml制备好的毒素滤液置于装有2层滤纸的培养皿（直径为9mm）内，将供试材料的叶圆片分散于毒素滤纸上，叶圆片上再覆盖一层含毒素滤液的滤纸，每个培养皿放置8-10个叶圆片，每个品种3次重复，盖上皿盖，培养液处理为空白对照，放置于室温条件下（>18℃）处理48h，测量病斑宽度，利用病斑扩展宽度衡量衡量材料抗病性的强弱。
叶圆片病斑坏死的分级标准：0级（-）：无症状（免疫I或高抗HR）；0.5级(+)：仅有狭小的失绿边缘(R)；1级（+）：1-4mm以内叶圆片边缘失绿(MR或耐病)；2级（++）：4mm以上叶圆片失绿（S）；3级（+++）：叶圆片全部失绿甚至腐烂(HS)。结果显示，通过人工接种鉴定，供试品种对炭疽病菌抗感表现分明（表1、图2）；而毒素抗性鉴定试验结果显示，当毒素滤液浸渍叶圆片48h后，供试品种对炭疽病菌毒素伤害的抗性存在显著差异（见表2、图2），其中品种N.nudicaulis和N.debneyi的病斑扩展宽度为0（-），达到免疫和高抗级；品种N.paniculata的病斑宽度为0.6mm（+），达到抗级；品种象耳朵烟的病斑宽度为2.9mm（+），达到中抗或耐级；品种K326的病斑宽度分别为8.1mm（++），达到感级；结果见表1。
表1 毒素浸渍叶圆片处理的病斑扩展宽度
注:*表示三次重复的平均值。
2.采用人工接种孢子悬浮液法进行抗性鉴定（参照GB/T23224-2008）。
孢子悬浮液制备：取菌龄为8d的PDA平板，倒入适量无菌水后，用涂板器轻轻的将培养基表面的孢子刮下，将该孢子悬浮液置于无菌的三角瓶中，瓶中预先放置数粒无菌的玻璃珠，充分振摇后，经双层纱布过滤，即得到分生孢子悬浮液，用血球计数板确定分生孢子液浓度，用无菌水调整孢子悬浮液浓度为1×105个/ml，以6个不同抗感材料为供试寄主，用喉头喷雾器喷洒分生孢子悬浮液，至叶片正、背面完全湿润，每个品种接种3钵苗，同时另取3钵苗喷施无菌水作为空白对照，接种后置于25℃光照保湿（RH>80%）24h后，置于25℃光照培养，间隔2d浇水1次，5d后观察发病情况，以叶片为单位进行分级，计算病情指数，根据抗性分级标准进行抗性评价。病叶分级标准：0级：全叶无病。1级：病斑面积占叶片面积5%以下。3级：病斑面积占叶片面积6-10%以下。5级：病斑面积占叶片面积11-20%。7级：病斑面积占叶片面积21-40%以下。9级：病斑面积占叶片面积40%以上（烟草病虫害分级及调查方法GB/T23222-2008）。品种抗病性标准评价如下：高抗或免疫（I）:病情指数为0；抗病（R）:病情指数为0.1-20；中抗（MR）:病情指数为20.1-40；中感（MS）：病情指数为40.1-60；感病（S）：病情指数为60.1-80；高感（HS）：病情指数为80.1-100（GB/T23224-2008）。结果见表2和图1.
表2 供试品种炭疽病人工接种抗性鉴定结果
| 供试品种 | 病指 | 抗病类型 |
| N.nudicaulis | 0 | 免疫 |
| N.debneyi | 0.08 | 高抗 |
| N.paniculata | 5.76 | 抗 |
| 象耳朵烟 | 29.17 | 中抗 |
| K326 | 67.90 | 感 |
3.核对用于1中的实验的叶圆片编号对应的品种如下：
| 品种 | 叶圆片编号 |
| N.nudicaulis和 | 1 |
| N.debneyi | 2 |
| N.paniculata | 3 |
| 象耳朵烟 | 4 |
| K326 | 5 |
4.采用1和2所述方法对6个烟草品种NC89、中烟100、NC95、小黄金1025、HC100和CN9787（种子由中国农业科学院烟草研究所品种资源平台提供。）进行炭疽病抗性鉴定，结果显示6个供试品种对炭疽病菌毒素毒害的抗性表现差异明显，且离体叶圆片浸渍法与人工接种法鉴定结果一致，结果见表3,4和图3，验证了此方法可用于烟草炭疽病抗性快速鉴定。
表3 毒素浸渍叶圆片处理6个品种的病斑扩展宽度
注:*表示三次重复的平均值。
表4 6个不同品种炭疽病人工接种抗性鉴定结果
| 供试品种 | 病指 | 抗病类型 |
| 中烟100 | 81.34 | HS |
| NC89 | 73.28 | S |
| 小黄金1025 | 72.75 | S |
| NC95 | 67.50 | S |
| HC100 | 35.69 | MR |
| CN9787 | 13.69 | R |
可以看出，本发明的方法鉴定统计结果与文献记载的品种抗性，以及目前常用的人工接种方法鉴定结果一致。但是，本发明的方法具有经济简单，易于操作和控制，高效等优点。
综上，本发明可以在较为简单的试验条件下有效鉴定烟草品种对炭疽病的抗性，具有操作简单、接种效率高、周期短的特点，尤其适合对育种材料做高通量、快速的初步筛选，具有广阔的应用前景。
Claims (3)
1. 快速鉴定烟草炭疽病抗性的方法，其步骤如下：
（1）富集烟草炭疽病菌 (Colletotrichum destructivum)分泌的无菌体毒素液；
（2）准备培养皿：培养皿底部铺滤纸，在滤纸上加无菌体毒素液使滤纸充分浸湿；
（3）在供试品种的叶片上取形状规则的小叶片，并将所述小叶片分散于无菌体毒素液浸湿的滤纸上，在所述小叶片上再覆盖一层被毒素浸湿的滤纸；
（4）盖好培养皿后置于18℃~35条件下培养2天；
（5）统计小叶片上病斑扩展宽度确定供试品种的抗病性强弱；
所述富集所述无菌体毒素液的步骤如下：
将烟草炭疽病菌菌株移至马铃薯葡萄糖固体培养基上培养5~10天，用打孔器在菌落边缘打取菌饼， 挑取3个菌饼放置于装有马铃薯葡萄糖液体培养基的三角瓶中，于黑暗下、26℃、以120r/min恒温振荡培养15天；
将培养液于10000r/min离心15min，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后的滤液为所述无菌体毒素液， 4℃保存备用。
2.根据权利要求1所述的方法，所述形状规则的小叶片指采用打孔直径为15mm的打孔器打取的叶圆片。
3.根据权利要求2所述的方法，每个培养皿中放置8-10个所述叶圆片。
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