CN101555458B - 一种吡咯伯克霍尔德氏菌及其在防治杨树溃疡病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007，其分类命名为吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，其保藏编号是：M 209028，保藏日期：2009年2月18日。本发明还公开了上述吡咯伯克霍尔德氏菌在防治杨树溃疡病中的应用和在促进杨树生长中的应用。本发明还提供了一种防治杨树溃疡病杀菌剂，即将JK-SH007接种于培养基中发酵培养所得。本发明的JK-SH007为植物内生菌，对杨树溃疡病菌抑制作用强，对多种病原真菌具有拮抗作用，且培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。

Description

一种吡咯伯克霍尔德氏菌及其在防治杨树溃疡病中的应用

技术领域

本发明属于植物保护领域，尤其涉及一种吡咯伯克霍尔德氏菌及其在防治杨树溃疡病中的应用。

背景技术

杨树是重要的速生用材树种，具有颇高的经济价值和生态效益。然而，杨树在生长过程中不断受到病虫害的威胁。

杨树溃疡病是一类危害严重的杨树枝干病害，病原种类繁多，症状多种多样，严重影响树木生长甚至导致寄主死亡。通常的名称有溃疡病、腐烂病、烂皮病、枝枯病等，该病大多数由真菌引起。杨树溃疡病的发病规律病害发生与树木生长势关系密切，当寄主受到环境影响而生长势衰弱时极易发生，因此新造幼林以及干旱瘠薄、水分供应不足的林地容易发病。

目前对杨树溃疡病的防治尚无理想的药剂及抗病品种，一些栽培管理措施只能起到局部的控制作用，寻找一种经济、安全、有效的防治措施是当务之急，生物防治不失为重要的辅助手段，其中拮抗细菌在植物病害生物防治中起到非常重要的作用，其主要优势在于：

(1)种类和数量众多，在植物体内外大量存在；

(2)对病原菌的作用方式多样化，包括竞争、拮抗、寄生、诱导植物抗性产生等；

(3)繁殖速度快；

(4)许多大多细菌在植物体内外定殖力强

(5)能够人工培养，易于操作，便于生产应用；

(6)有些细菌菌株不仅能够防治病害而且可以促进植物的生长，增加作物的产量。

利用植物外部环境中的拮抗细菌防治植物病害已有许多研究报道，但由于这些生防菌易受外界环境条件的影响，防病效果不理想。近年来研究表明，植物体内存在大量的对植物病害具有较好防治作用的内生细菌，尤其是对化学药剂难以发挥作用的植物土传病害、维管束病害和系统性病害的防治更显示其独特的优势。这些内生细菌定殖于植物体内，不易受外界环境的影响，可长期持续作用，而且许多内生细菌具有固氮、促生、抗旱等生物功能，具有良好开发利用前景。目前已从水稻、棉花、玉米、马铃薯等植物体内筛选出多种对植物病害有较好防治效果的内生细菌，但对杨树的内生细菌的研究相对较少。

吡咯伯克霍尔德氏菌在目前的分类地位上隶属于洋葱伯克霍尔德氏菌。洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia，简称Bc)是一种广泛存在于农业环境和医院的革兰氏阴性细菌，是一组基因型不同表型相近的复合物(Burkholderia cepacia complex，简称Bcc)，现被国际上划分为9个基因型，合称洋葱伯克氏菌群(Bcc)。由于该菌最初是是作为洋葱腐烂病的病原菌发现的，所以被称为洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)，1993年被归到伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)。目前，Bcc的9个基因型，除基因型I保留原名以外，基因型II一IX都重新命名，它们分别为：B.multivorans、B.cenocepacia、B.stabilis、B.vietnamiensis、B.dolosa、B.ambifaria、B.anthina、B.pyrrocinia(Vandamme et al.，1997、2002、2003；Coenye et al.，2001、2001)。Bcc的某些基因型是引起囊性纤维化(CF)的重要条件致病菌，也是医院感染的重要病原菌之一；基因型II、III类菌最具传染性；Butler等研究发现，引起CF患者死亡的Bcc与环境中分离的Bc无一基因型相同，同时Pegues等也发现存在于环境和CF患者的Bc非同一流行株。Bcc的九种基因型中，只有基因型IX(B.pyrrocinia)是唯一只在野外分布的基因型，该基因型未在医院和病人身上分离到。研究还表明，B.cepacia的一些基因型具有防治植物病害和促进植物生长的作用。作为生防菌，Bc被制成生物杀虫剂和生物杀菌剂，能代替部分农业生产中常用的化学农药，它在农业生产和环境保护方面起着重要的作用。目前有不少国家在生产和使用以Bc为原料制成的生物农药。但以Bc为材料来防治杨树溃疡病未见报道。

由于农业生产中微生物农药使用的增多以及在已经登记的微生物农药中发现一些种类是条件致病菌后，微生物农药的风险评估日益成为全球关注的问题。目前已有一些比较成熟的动物、植物模型用于生物农药菌株的生物学分析，来评估这些生防菌对人类是否存在潜在风险。

苜蓿是一般用于医院呼吸道感染细菌致病性测定的模式植物。2002年Laura用一种在CF病人体内常检测到的病原菌Psudomnoas aeruginosa对苜蓿和老鼠分别接种，比较研究结果发现，苜蓿可以代替老鼠作为模式植物测定该菌对哺乳动物的毒性，甚至苜蓿模型表现出了比老鼠模型更高的灵敏度(Laura et al.，2002)。随后，Steve对Bcc做了同样的比较测试，发现Bcc在苜蓿上的发病率与在老鼠上的结果呈正相关，可以代替老鼠作为测定Bcc对动物毒性的模式植物(Steve et al.，2003)。用苜蓿模型可简单快捷的检测出Bcc菌株对哺乳动物是否具有致病性，这为我们在农业和环保中安全利用Bc奠定了坚实的基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高效防治杨树溃疡病的吡咯伯克霍尔德氏菌。

本发明还要解决的一个技术问题是提供上述吡咯伯克霍尔德氏菌的用途。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

高效防治杨树溃疡病的吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)JK-SH007，是一种从杨树干部筛选获得的对杨树溃疡病菌具有拮抗作用且具有内生性的生防细菌菌株，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏号M 209028。

吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)JK-SH007在牛肉膏蛋白胨培养基平板上菌落较小，黄色，直径一般2～3mm，圆形，边缘整齐，中间具乳状突起，光滑湿润，产黄色色素，菌体直杆状，大小为0.8×(1～2)μm，极生一根或三根鞭毛。革兰氏染色表现为阴性；葡萄糖氧化发酵反应(O/F反应)结果为氧化产酸、好氧；氧化酶反应为弱阳性；过氧化氢酶反应为延迟反应。recA基因特异引物鉴定为基因型XI：Burkholderia pyrrocinia。测得16SrDNA大部分序列1312bp，具体如SEQ ID No：1所示。将所测16SrDNA序列通过BLAST比对，能在GenBank中找到同源性非常高的相近菌株序列。与JK-SH007菌株相似性最高的是Burkholderia cepacia和Burkholderiapyrrocinia，同源性都达到99％。构建进化树发现，JK-SH007与Burkholderia pyrrocinia同属一个遗传分枝，亲缘关系十分接近。

BIOLOG细菌自动鉴定系统以每种细菌形成各自特有的“代谢指纹”图谱为鉴定依据，选用四唑紫作为细菌能否利用供试碳源的指示剂，通过细菌对95种不同碳源的代谢情况鉴定菌种。与传统方法相比，该系统采用标准化程序，操作简便，自动化程度高，鉴定快速，且菌种数据库大，鉴定范围广，包括约2000种微生物，适合于环境、食品、工业、临床和动植物病原菌各类微生物的鉴定分析。通过BIOLOG系统对JK-SH007进行鉴定，该菌株在鉴定板培养16～24h时的读数相似值(SIM值)为0.661，大于0.50，符合BIOLOG系统关于理想结果的要求，而且鉴定结果的相似性(PROB)都为99％，因此该菌株利用BIOLOG系统，准确鉴定到了种，为吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderiapyrrocinia)。

通过recA基因引物(BCR1/BCR2)PCR对JK-SH007菌株的检测结果表明，在1000bp左右出现一条清晰的条带，进一步确定该菌株属于Bcc。对该菌株的基因型鉴定通过Bcc各基因型recA特异引物(缺少基因型IX引物)扩增法进行，各引物对只能识别对应的基因型。结果表明，所有引物的扩增反应均无特异性条带出现。据此鉴定JK-SH007菌株的基因型为IX：Burkholderia pyrrocinia。

上述吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007及其代谢产物对杨树溃疡病原金黄壳囊孢菌(Cytospora chrysosperma)、拟茎点霉(Phmnopsis sp.)和七叶树壳梭孢菌(Botryosphaeriadothidea)都具有一定的抑菌作用，因此能够高效防治杨树溃疡病。

并且上述吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007对杨树还具有促生长的作用。

上述吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007对稻瘟病菌、小麦赤霉菌、肉桂炭疽病菌、辣椒疫霉菌、瓜果疫霉菌、大豆疫霉菌、苹果轮纹菌、水稻纹枯病菌、棉花立枯病原真菌具有拮抗作用。可应用于防治稻瘟病、小麦赤霉病、肉桂炭疽病、辣椒疫霉病、瓜果疫霉病、大豆疫霉病、苹果轮纹病、水稻纹枯病和花立枯病。

上述吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007产生抑菌物质最多的最佳发酵条件如下：

培养基：每1000mL蒸馏水，含牛肉膏2～5g，蛋白胨2～5g，氯化钠5g，，pH6～7。

工艺条件为：pH6～7，通气量1∶1，28℃～30℃，摇床转速180～200转/分，48～60小时。

通过上述发酵工艺得到的发酵液即为一种微生物杀菌剂。该发酵液直接施加到土壤中对植物进行灌根处理即可发挥其杀菌作用。

有益效果：

(1)吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007为植物内生菌，对杨树溃疡病菌抑制作用强，对多种病原真菌具有拮抗作用，具有拮抗细菌在植物病害生物防治中所起到的非常重要的作用，例如种类和数量众多，在植物体内外大量存在；对病原菌的作用方式多样化；繁殖速度快；在植物体内外定殖力强；能够人工培养，易于操作，便于生产应用；促进植物的生长等优点，尤其是对杨树溃疡病的防治具有重要意义。

(2)吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。

附图说明

吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)JK-SH007，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏号M 209028，保藏日2009年2月18日。

图1吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007对杨树的促生长作用照片。

图2吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007对杨树溃疡病温室防治照片。

具体实施方式：

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007对杨树溃疡病原金黄壳囊孢菌(Cytosporachrysosperma)、拟茎点霉(Phmnopsis sp.)、七叶树壳梭孢菌(Fusicoccum aesculi)平板抑菌作用。

将用NA斜面活化的吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007菌株划线接种于PDA平板两侧，再将杨树溃疡病病原菌PDA平板培养物用直径5mm的打孔器打取同质同量的菌块，点接于平板中间。28℃培养4天观察抑菌带的有无，并记录其宽度(表1)。试验结果表明，JK-SH007对三种病原菌均有强拮抗作用。

表1JK-SH007对3种杨树溃疡病病原菌的抑制

实施例2：吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007的代谢产物对3种杨树溃疡病原菌(包括拟茎点霉(Phmnopsis sp.)、金黄壳囊孢菌(Cytospora chrysosperma)、七叶树壳梭孢菌(Fusicoccum aesculi))的平板抑菌作用。

在PDA平板上铺上无菌玻璃纸，涂布接种吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007，30℃培养48小时，揭去玻璃纸，再分别在平板中央接种病原菌，28℃培养。以不接生防菌对照，待对照菌丝长满平板后，观察拮抗活性，并统计抑菌率(表2)。试验结果表明，JK-SH007代谢产物对三种病原菌均有强拮抗作用。

表2JK-SH007的代谢产物对3种病原菌的抑制

实施例3：吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007对美洲黑杨实生苗150天的促生长情况。

将吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007接种于NB培养基发酵48小时，用该菌株48小时发酵液浸泡美洲黑杨种子3小时，无菌水冲净后，进行播种。以无菌水浸泡种子为对照。苗高15cm定苗，每盆4株，150天后测量苗高、地径。与对照相比，接种JK-SH007发酵液能够显著的促进实生苗的生长(表3)。与对照(CK)相比，接种JK-SH007的处理在地茎和苗高上差异显著，促生效果明显，见图1。

表3JK-SH007对杨树实生苗生长的影响

注：P＜0.05

实施例4：吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007内生性试验。

将用利福平(300微克/毫升)标记过的吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007接种于NB培养基发酵48小时，用该菌株48小时发酵液浸泡美洲黑杨种子3小时，无菌水冲净后，进行播种。以无菌水浸泡种子为对照。苗高15cm定苗，每盆4株，30天后分别采集杨树苗的叶子和干部0.5克，将其表面消毒后，加2mL无菌水研磨，分别涂布于利福平(300微克/毫升)的NA平板。30℃培养4天，观察平板是否有吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007菌落长出。结果表明，叶子和干部均能回收到吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007。这说明JK-SH007能在杨树体内较长时期存在，其具有内生性。

实施例5：吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007对温室盆栽苗杨树溃疡病的防治情况。

用打孔器分别在金黄壳囊孢菌(Cytospora chrysosperma)、拟茎点霉(Phmnopsissp.)、七叶树壳梭孢菌(Fusicoccum aesculi)菌落边缘处均匀打孔，获得大小、生长速度一致的菌丝块。接种的杨树苗用单面的手术刀片分别在苗干离地面1米处和离地面1.5～2米处做烫伤处理，然后在烫伤处斜切一小伤口，用镊子分别将3种病原菌菌丝块轻轻放在切好的伤口部位，用封口膜将菌丝块固定在树皮下的伤口内，并放上一小块带有无菌水的棉球保湿。病原菌接种后用JK-SH007液体杀菌剂(10⁹cfu/mL)进行杨树苗土壤灌根处理，每株50mL。共设3个处理(T1：接种金黄壳囊孢菌及JK-SH007、T2：接种拟茎点霉及JK-SH007、T3：接种七叶树壳梭孢菌及JK-SH007)，每处理30个重复，以无菌水灌根为对照(CK1：接种金黄壳囊孢菌、CK2：接种拟茎点霉、CK3：接种七叶树壳梭孢菌)，另外设一个不接病原菌，以无菌水土壤灌根对照(CK)，以校正发病率，每对照同样30个重复。

上述JK-SH007液体杀菌剂按如下方法制得：培养基：牛肉膏5g，蛋白胨5g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH6～7。工艺条件为：pH6，通气量1∶1，28℃，摇床转速200转/分，60小时。

1个月后调查发病情况，结果如表4所示。大部分用JK-SH007液体杀菌剂处理过的苗木接种口愈合，对照病原菌大部分接种口及周围产生黑色子实体及金黄色分生孢子角，个别严重者整株死亡。说明接种吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007能很好的防治杨树溃疡病的发生。对金黄色壳囊孢菌引起的杨树溃疡病的防治效果见图2(A、示对照的发病情况：子实体B、示对照的发病情况：金黄色的分生孢子角C、示接种JK-SH007后没发病的健康组织)。

表4室内杨树溃疡病防治效果

实施例6：吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007对洋葱致病性测定。

致病性测定参照Sijam等(2005)的方法，用注射器取吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007菌悬液(1×10⁷～10⁸cfu/mL)在洋葱鳞茎上两点对称注射(深度为1～2cm)，每点注射量为1mL。以灭菌水处理为对照。所有处理均重复3次，置于26℃培养，4～5天后检查结果。洋葱鳞茎接种试验表明，注射接种JK-SH007不引起洋葱鳞茎的腐烂，只是在接种处稍有干瘪凹陷。以上说明吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007不是植物病原细菌，对植物具有安全性。

实施例7：吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007对稻瘟病菌、小麦赤霉菌、肉桂炭疽病菌、辣椒疫霉菌、瓜果疫霉菌、大豆疫霉菌、苹果轮纹菌、水稻纹枯病菌、棉花立枯病菌平板抑菌作用。

表5JK-SH007对部分病原菌的抑制

将用NA斜面活化的吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007细菌菌株划线接种于PDA平板两侧，再将稻瘟病菌、小麦赤霉菌、肉桂炭疽病菌、辣椒疫霉菌、瓜果疫霉菌、大豆疫霉菌、苹果轮纹菌、水稻纹枯病菌、棉花立枯病菌的PDA平板培养物用直径5mm的打孔器打取同质同量的菌块，分别点接于平板中间。28℃培养4天观察抑菌带的有无，并记录其宽度(表5)。试验结果表明，JK-SH007对9种病原菌均有较强拮抗作用，抑菌斑均在15mm以上。

实施例8：吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007对苜蓿的接种试验。

将JK-SH007接种到NB培养基中，30℃下震荡(150mrp)培养24h，用无菌水调节菌悬液浓度到10⁹左右用于接种。用Laura的方法来准备要接种的苜蓿种子(Laura et al.，2002)。将紫花苜蓿种子用98％浓硫酸浸泡20分钟(约10ml浸300颗种子)，用500mL灭菌水清洗4次，然后泡在60mL灭菌水中，32℃下震荡(150prm)浸种6～8小时，再清洗2次，换水后同样条件培养过夜。次日再用灭菌水清洗2次后(每次60mL水)，用无菌镊子摆放到1％的水琼脂平板上等待接种，每皿摆放20颗种子。将水琼脂平板上的苜蓿种子用接种针在子叶上刺一个小孔，取20mL准备好的菌悬液点在伤口处，每菌株接种3个重复，每重复20颗种子，设2种CK处理，其中1个不作任何处理，另1个针刺接种无菌水。接种后的种子在37℃、70％相对湿度、定时光照(12h光照，12h黑暗)条件的人工气候箱中培养，7天后检查发病率。

苜蓿接种结果显示，无论是CK还是接种处理，均无发病症状(接种点附近坏死、黄化和根畸)出现。苜蓿是代替老鼠作为测定Bcc对动物毒性的模式植物(Steve et al.，2003)，用苜蓿模型可简单快捷的检测出Bcc菌株对哺乳动物是否具有致病性。上述试验结果说明吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007对哺乳动物没有毒害性。

SEQUENCE LISTING

<110>南京林业大学

<120>一种吡咯伯克霍尔德氏菌及其在防治杨树溃疡病中的应用

<130>njfu090222

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1312

<212>DNA

<213>吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)

<400>1

ttacacatgc aagtcgaacg gcagcacggg tgcttgcacc tggtggcgag tggcgaacgg  60

gtgagtaata catcggaaca tgtcctgtag tgggggatag cccggcgaaa gccggattaa  120

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gccaacccgc gagggggagc taatcccaga aaaccgatcg tagtccggat tgcactctgc    1260

aactcgagtg catgaagctg gaatcgctag taatcgcgga tcagcatgcc gc            1312

Claims (5)

1.一种吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007，其分类命名为吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，其保藏编号是：M 209028，保藏日期：2009年2月18日。

2.权利要求1所述的吡咯伯克霍尔德氏菌在防治杨树溃疡病中的应用。

3.权利要求1所述的吡咯伯克霍尔德氏菌在促进杨树生长中的应用。

4.一种防治杨树溃疡病杀菌剂，其特征在于该杀菌剂按如下方法制备：将吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)JK-SH007接种于培养基中，pH6～7，通气量1∶1，28℃～30℃，摇床转速180～200转/分，48～60小时，得到的发酵液即为防治杨树溃疡病杀菌剂；其中，所述的培养基各物质含量如下：每1000mL蒸馏水，含牛肉膏5g，蛋白胨5g，氯化钠5g，pH6～7。

5.权利要求1所述的吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007在防治稻瘟病菌、小麦赤霉病菌、肉桂炭疽病菌、辣椒疫霉病菌、瓜果疫霉病菌、大豆疫霉病菌、苹果轮纹病菌、水稻纹枯病菌、棉花立枯病中的应用。

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