CN105967910A - 一种防治青枯病的微生物有机肥、制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种防治青枯病的微生物有机肥、制备方法及其应用，以黑根霉和解淀粉芽孢杆菌有机发酵液为主要原料，与现有技术相比，本发明提供的防治青枯病的微生物有机肥，可以抑制病原微生物的生长，有效防治青枯病，对青枯病病原菌的抑制率较高，调节土壤理化生及生化性状，提供农作物生长所必需的营养物质，提高作物产量和品质，增强作物的抗逆性，并且不会对环境产生污染，是一种绿色高效的复合型生物肥料。

Description

一种防治青枯病的微生物有机肥、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物防治领域，具体涉及一种防治青枯病的微生物有机肥、制备方法及其应用。
背景技术
作物细菌性青枯病素有植物“癌症”之称，是由茄科劳尔氏菌(BAlstonia solanacearum)引发的一种世界性的重要植物土传病害。其发病主要集中在温暖、潮湿、雨水充沛的热带和亚热带地区的50多个国家和地区，一旦发生则难以控制，往往造成作物大面积死亡甚至绝收，危害严重。
R.solanacearum的寄主非常广泛，包括农作物、果树、蔬菜、林木、花卉、药材、牧草和杂草等50多科300多种植物；由该病菌引起的症状是，发病初期，病株主茎顶梢第一、二片叶白天呈现失水性凋萎，早晚尚可恢复，之后随着病情的发展则不再恢复，病株叶片自上而下逐渐萎蔫，叶色暗淡，呈青绿色，最后病株枯死。
根据对不同寄主植物的致病性，可将茄科劳尔氏菌分为5个小种：1号小种寄主范围较广，侵染番茄、烟草等茄科作物及姜、甘薯等其他植物；2号小种侵染香蕉、赫蕉、大蕉、海里康；3号小种侵染马铃薯、番茄，对其他植物致病力弱；4号小种侵染生姜，对其他植物侵染力弱或不侵染；5号小种侵染桑树，不侵染其他植物。
植物青枯病的防治一直是个世界性的难题。目前防治青枯病的主要方法包括化学防治，农业防治和生物防治三种方法。
化学防治因其生产简便、价格便宜、特别是见效快等优点，在青枯病的防治中一直占有主要地位，而被广泛应用。早期对已经大面积发病的植物，化学防治几乎是唯一的选择。化学防治目前还没有研制出高效、低毒和无环境污染的化学药剂用于防治番茄青枯病的发生，现常见的化学药剂主要是百菌清、链霉素、施宝灵、强氯精、多菌灵、双效灵、DT粉刺和可杀得等，主要是一些广谱杀菌剂，防治效果均不理想，加之青枯菌对化学农药易产生抗药性，而且大量使用化学农药会造成环境污染和生产成本的上升，后期防效差而不能最终控制青枯病的发生。
化学防治的现状令人担忧，农产品的农药残留和剧毒农药直接对人类生存环境造成严重污染，危及人类和其他生物的生命。随着可持续农业和可持续植保观念的不断深入与发展，生物防治越来越受到人们的重视。而且，早期国内外专家们在抗病品种选育、化学防治、农业防治等方面进行了大量的研究，但由于抗病品种抗性低且抗性容易丧失，化学药剂的后期防效差且病菌易产生抗药性而不能最终控制青枯病的发生，农业措施如水旱轮作受地域条件限制而难于大面积推广，迄今尚未研究出十分理想、有效的防治技术。
农业防治在减少青枯病的发生上也起到一定的作用，在农业防治方面，以轮作、改良土壤(撤石灰)、培育壮苗、拔除病株、合理施肥等措施为主。农业措施如水旱轮作受地域条件限制而难子大面积推广，嫁接由于青枯菌的变异，砧木很快丧失抗病性，该方法难以在田间使用。迄今为止尚未研究出十分理想、有效的防治技术。
生物防治是近年来才发展起来的新兴学科，它具有无污染、不杀伤天敌、不会产生抗药性、有利于人畜安全及环境保护、兼防兼治，且符合发展有机农业的要求的优点，生物防治作为防治青枯病较为理想的途径，目前已初见成效。
随着环境保护问题的提出，生物防治成为取代化学农药的新一代杀菌制利，将有十分广阔的发展和应用前景。
但是目前，现有的生物防治技术存在着防效不稳定，使用起来不如化学农药简捷方便，见效慢，不容易大批量生产等不利因素。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种防治青枯病的微生物有机肥，以黑根霉和解淀粉芽孢杆菌为中心，并且将两种菌进行混合发酵，发酵液接种于有机肥，所得发酵料与黄腐酸钾、甲壳素、常量元素、微量元素等混合制得。
本发明还提供了一种防治青枯病的微生物有机肥的制备方法，通过发酵制备得到的防治青枯病的微生物有机肥能有效防治青枯病，调节土壤理化生及生化性状，提供农作物生长所必需的营养物质。
本发明还提供了一种防治青枯病的微生物有机肥的应用，用于防治植物青枯病。
本发明提供的一种防治青枯病的微生物有机肥，含有以下重量份的原料：
所述解淀粉芽孢杆菌和黑根霉的有机肥发酵料的制备方法为：
a、将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA-2进行培养，制得淀粉芽孢杆菌液体培养液；
b、将黑根霉(Rhizopus nigricans)RN-9进行培养，制得黑根霉液体培养液；
c、将淀粉芽孢杆菌液体培养液和黑根霉液体培养液混合后接种于麸皮葡萄糖培养基中，经发酵培养，制得菌种发酵液；
d、将农家肥原料的干料粉碎后，加水，混合均匀，接种步骤c制得的菌种发酵液，混合均匀，堆料发酵，得发酵料。
步骤a中所述黑根霉(Rhizopus nigricans)RN-9于2013年11月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号CGMCC NO.8436，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；
步骤a中所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA-2购自山东君德生物科技有限公司。
步骤a具体为：将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA-2接种于LB平板培养基上进行平板培养，然后，转接至LB液体培养基中，进行摇瓶培养，制得淀粉芽孢杆菌液体培养液；
步骤b具体为：将黑根霉(Rhizopus nigricans)RN-9接种于PDA平板培养基上进行平板培养，然后将黑根霉(Rhizopus nigricans)RN-9菌丝块转接至PDB培养基中，进行摇瓶培养，制得黑根霉液体培养液；所述菌丝块用内径为5mm的打孔器在菌落边缘打孔后，用接种环挑取获得。
步骤a中所述平板培养的条件为35℃～37℃培养24h～36h。
步骤a中摇瓶培养条件为：35℃～37℃、120～140rpm条件下，培养4～8天。
步骤b中所述平板培养的条件为25℃～30℃培养36h～50h。
步骤b中摇瓶培养条件为：25℃～30℃、120～140rpm条件下，培养8～15天。
所述LB培养基、PDA培养基、PDB培养基为本领域常用培养基；
所述PDA培养基的制备方法可以为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂18g，蒸馏水定容至1000mL。
所述PDB培养基的制备方法可以为：马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水定容至1000mL。
步骤c中黑根霉液体培养液和淀粉芽孢杆菌液体培养液按体积比为1:1～3接种于麸皮葡萄糖培养基中。
步骤c中所述麸皮葡萄糖培养基制备方法为：麸皮60～80克，葡萄糖20克，水定容至1L。
步骤c所述发酵培养条件为：在25℃～30℃、120～140rpm条件下，培养3～5天；优选的，发酵培养条件为在28℃、120rpm条件下，培养4天。
步骤d具体为：将农家肥原料的干料粉碎后，按干重的40～50wt％加水，混合均匀，然后按农家肥原料干料的干重的2～5wt％接种步骤c制得的菌种发酵液，混合均匀，堆料发酵，制得解淀粉芽孢杆菌BA-2和黑根霉RN-9的孢子数之和不小于0.5亿/克的发酵料；
所述农家肥原料选自作物秸秆、树叶、杂草；粉碎至长度1～3cm。
步骤d中所述堆料发酵为：将堆料堆成截面为宽1.5～2.5m、高0.8～1.2m的条形堆，每天翻堆3～4次；发酵时间为5～8天，发酵温度30～40℃，发酵湿度保持在55-65％。
本发明提供的一种防治青枯病的微生物有机肥的制备方法，包括以下步骤：
(1)将100重量份发酵料质量、0.02～0.05重量份甲壳素、7.0～8.0重量份尿素、0.5～1.5重量份硫酸钙、5.0～12.0重量份三水合磷酸氢二钾和凹凸棒土5份，混合均匀；
(2)然后加入1～5重量份的甲基纤维素、1～5重量份羧甲基纤维素钠、1～5重量份乙基纤维素，5重量份酵母粉，搅拌混合均匀；
(3)烘干，即得。
步骤(3)中烘干为：远红外烘干65～75℃，20～25min，即得。
进一步的，将烘干后产品压缩成型，可为棒状，尺寸直径为60—80mm，长度为180—250mm，单棒重0.5—O.8Kg。
进一步的，制备方法还包括，将压制成型后产品热缩膜包装、装箱。
生产工艺流程按上述原料配比，并测定每样原料的固有含量，混合搅拌、远红外烘干使含水量达到标准、液压机压制成型、热缩膜密封包装即为成品。
本发明提供的一种防治青枯病的微生物有机肥的应用，对茄科劳尔氏菌的抑制作用。可用于防治植物青枯病，尤其是番茄青枯病病，马铃薯青枯病的防治。
具体使用方法为：根据土传病害的发病严重程度及易发病的时间施用该有机肥，施用量为100-200公斤/亩、每月施肥1-2次。
解淀粉芽孢杆菌BA-2解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BA-2购自山东君德生物科技有限公司。
黑根霉RN-9的获取方法：
从山东潍坊、寿光、烟台等作物土传病害发病严重的地区采集发病植株根际土壤样品，土壤采集方法为三点取样法，即每个取样点取三个子样，每个子样间距离10m，取样深度为5-10cm，采样完毕后，去除杂草，放入无菌自封袋中，低温保存。
制备土壤稀释液：称取土壤10g，放入90mL无菌水的三角瓶中，振荡，并用玻璃珠打碎，静置30min，配成土壤悬液。在超净工作台上用移液管从三角瓶中吸取1ml，加入另一盛有9ml无菌水的离心管中，混合均匀，以此类推分别制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5不同稀释倍数的土壤溶液。移取0.2ml稀释液至平板培养基上，并充分混匀铺平。其中，LB培养基所接梯度为0、10-2、10-5；PDA培养基所接梯度为0、10-3。每种各接3板，进行标记。LB培养基倒置于37℃下恒温培养36～50h；PDA培养基置于28℃培养72h。
分离纯化：从平板中挑取颜色形态等不同的单个菌落用四区划线法分离纯化，用同种培养基培养48h，获取单菌落。
体外初筛：
平板对峙法：
对于获得的真菌采用平板对峙的方法进行筛选，以猝倒病病原菌瓜果腐霉菌、黄萎病病原菌大丽轮枝菌和枯萎病病原菌尖镰孢菌为指示菌。
在超净工作台上将病原微生物用灭菌后的接种器(Φ5mm)接种到PDA培养基的一侧，同时将生防微生物接种到PDA培养基的另一侧，28℃恒温培养，每个处理设三个平行，观察记录抑制效果，用十字交叉法测量病原微生物的菌落半径，以只接种病原微生物的平板作对照。第5天时，计算五株生防微生物对病原微生物的抑菌率，计算方法如下：
抑菌率(％)＝【(对照组菌落半径-实验组菌落半径)/对照组菌落半径】×100
得到具有显著抑菌效果的菌种从形态学特征和分子生物学(同源性分析)方面对筛选的生防菌进行分类鉴定。
所购BA-2在LB平板上生长，白色，半透明，光滑湿润菌落，稍隆起，圆形齐整菌落；革兰氏染色菌体紫色，为革兰氏阳性菌，杆状；根据《伯杰氏细菌鉴定手册》确定BA-2与解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)形态学特征一致。
分子方面采用16s rDNA鉴定，对其序列进行DNA测序，通过将测序得到的16s rDNA序列与已知细菌16s rDNA序列比较，从而获得未知真菌种属信息。通过16s rDNA鉴定，该菌种与解淀粉芽孢杆菌的16s rDNA序列的相似度达到99％。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》，结合形态学特征和分子生物学两方面可以确定BA-2为解淀粉芽孢杆菌。
解淀粉芽孢杆菌测序结果
分离得到RN-9在PDA培养基上生长快速，3天即长满整个培养皿，起先白色，后变灰白色，成熟后呈黑褐色。匍匐茎起先白色，后变褐色。假根分枝多，发育良好。孢子囊柄直立，不分枝，起初白色，后变褐色，1-5枝丛生成一簇，长在假根对侧，900－2700微米(μm)长，直径22－32微米，无分隔，细胞壁平滑。孢子囊圆形，直径173-235微米，未成熟时白色，成熟后黑色，孢子囊壁平滑，成熟时溶解。中轴圆形，直径153-163微米，当孢子散出后，中轴多数下陷成半圆形。孢子多数橄榄型或有稜角，表面有沟纹，灰色，7.5-9.6×4.3-7.5微米。ITS DNA测序分析发现，该菌种与黑根霉的ITS序列的相似度达到99％。根据《真菌鉴定手册》，结合形态学特征和分子生物学两方面可以确定该真菌为黑根霉(Rhizopus nigrican)。
黑根霉测序结果
解淀粉芽孢杆菌用以预防植物病害,活化土壤养分,降解农药、化肥残留,可以解决农业种植中的重茬问题，作为混合发酵的主菌，是该生物有机肥有效杀菌成分的主要来源；黑根霉作为挑战菌进行接种，其生长速度较快，一方面刺激解淀粉芽孢杆菌，使其产生更多有效的次级代谢产物，另一方面竞争营养物质抑制病原菌生长。
发明提供的防治青枯病的微生物有机肥，在种子培养阶段，通过控制发酵时间、温度、转速等措施，将两种生防菌按照一定的比例进行混合发酵，使发酵液中的孢子含量达到最高，且孢子活力较高。在混合发酵过程中，两种生防菌相互作用，使发酵液中的次生代谢物质的种类及含量增加。在防治青枯病方面，这种生产方式可以达到协同的效果。
在有机肥料中发酵一方面可以提供两种菌必须的营养物质，另一方面通过两种微生物分解活化有机质，为作物的生长提供更多更易被吸收利用的养料，使作物获得更多养料，抗逆性增强。
甲壳素是一类天然的土壤结构改良剂，也是国外研究应用较广阔的一种改良剂。甲壳素中几丁质和壳聚糖属于氨基多糖，含有丰富的C、N元素，能被微生物降解利用，作为植物生长的养分。几丁质和壳聚糖具有胶结土粒，促进形成团聚体的能力。它们的分子上含有大量羟基，羟基与粘粒矿物晶体表面上的氢原子形成氢键，能将分散的土粒胶结在一起形成团聚体，疏水基覆盖在粘粒表面，改变了粘粒的水合性，使形成的团聚体具有水稳性。另外，几丁质和壳聚糖能改变土壤、根际和植物根组织微生物区系，促进有益微生物的生长，抑制植物病原菌。甲壳素与可溶性蛋白合成的液体土壤改良剂，具有较好的稳定性和可降解性，能改善土壤的团粒结构，降解后还能成为优良的有机肥料。在复合肥料中，添加脱乙酰基壳聚糖溶液，可以成倍提高颗粒率，改善复合肥质量。
尿素是目前含氮量最高的氮肥。作为一种中性肥料，尿素适用于各种土壤和植物。它易保存，使用方便，对土壤的破坏作用小，是目前使用量较大的一种化学氮肥。
硫酸钙(石膏)是优良的肥料和土壤改良剂.简述硫酸钙作为钙肥、硫肥的效用.硫酸钙可保存其他肥料中的氮,并清除脱氮细菌.。
磷酸二氢钾在农业上用作高效磷钾复合肥；磷酸二氢钾产品广泛适用于各类型经济作物、粮食、瓜果、蔬菜等几乎全部类型的作物，磷酸二氢钾具有显著增产增收、改量优化品质、抗倒伏、抗病虫害、防治早衰等许多优良作用，并且具有克服作物生长后期根系老化吸收能力下降而导致的营养不足的作用。
甲壳素、尿素、硫酸钙、三水合磷酸氢二钾作为速效肥料，可以在短时间内为作物提供养分，而生物肥可作为长效肥，为作物长期提供养分。
将其充分混匀后加入甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素，酵母粉作粘合剂，保证各成分在产品中的比例一致，多种组分的粘合剂可适应不同理化性状的土壤，可形成高粘度的胶体、溶液、有粘着、增稠、流动、乳化分散、赋形、保水、保护胶体、薄膜成型、耐酸、耐盐、悬浊等特性,且生理无害。
凹凸棒土施入土壤后能提高土壤肥力，增加作物产量，减少农田灌溉用水量。主要是由于凹凸棒土具有较好的阳离子代换性、吸附性、保水性、黏结性等特点，可以改良土壤的物化性状,，改善土壤的水热条件。阳离子交换量是土壤保肥供肥的一个重要指标。凹凸棒土有较高的吸水率和较好的黏结性，这些性能对协调土壤的水肥气热,，提高土壤肥力具有良好的效果。同时，凹凸棒土含有较高的矿质营养元素，可以增加土壤的肥力，提供微量元素。凹凸棒土还可以吸附土壤中的有害元素，减轻土壤的污染。在肥料生产中，加入适量的凹凸棒土，不仅可以提高肥料成粒率，提高造粒速度，而且颗粒强度高，不结块，不返潮，颗粒均匀，表面光滑，色泽度好，可提高复混肥产量，降低成本，减少环境污染；还可提供植物生长必须的微量元素。硝酸钠、硝酸铵、尿素等化肥都可以用凹凸棒土作为调节剂改善肥料的物理性状。
与现有技术相比，本发明提供的防治青枯病的微生物有机肥集速效、长效、增效为一体，可以抑制病原微生物的生长，有效防治青枯病，对青枯病病原菌的抑制率较高，调节土壤理化生及生化性状，提供农作物生长所必需的营养物质，提高作物产量和品质，增强作物的抗逆性，并且不会对环境产生污染，是一种绿色高效的复合型生物肥料。
附图说明
图1为本发明制备流程示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
培养基：
平板PDA培养基组分如下：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂18g，蒸馏水定容至1000mL。
PDB培养基组分如下：马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水定容至1000mL。
LB固体培养基组分如下：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂18g，蒸馏水定容至1000mL。
LB液体培养基组分如下：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，蒸馏水定容至1000mL。
实施例1
一种防治青枯病的微生物有机肥的制备方法，包括以下步骤：
(1)将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA-2接种于LB平板培养基上，在37℃进行平板培养36h；黑根霉(Rhizopusnigricans)RN-9接种于PDA平板培养基上，在28℃进行平板培养48h；
(2)将步骤(1)平板培养后的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BA-2用接种环转接至LB液体培养基中，在37℃、120rpm条件下，进行PDB液体培养8天；黑根霉(Rhizopus nigricans)RN-9用内径为5mm的打孔器在菌落边缘打孔后，用接种环挑取菌丝块转接至PDB培养基中，在28℃、120rpm条件下，进行PDB液体培养10天，制得液体培养液；
(3)将步骤(2)制得的液体培养液是将淀粉芽孢杆菌液体培养液和黑根霉液体培养液按体积比1:1混合后，接种于麸皮葡萄糖培养基中，在25℃、100rpm条件下，发酵培养5天，制得发酵液；
上述麸皮葡萄糖培养基每升组分如下：
麸皮70克，葡萄糖20克，水定容至1L；
(4)将小麦秸秆干料粉碎至长度1～3cm后，按干重的40wt％加水，混合均匀，然后按小麦秸秆干重的2wt％接种步骤(3)制得的发酵液，混合均匀，将堆料堆成截面为宽2m、高1m的条形堆，每天翻堆3～4次，经堆料发酵5天，发酵温度30～40℃，发酵湿度保持在60％左右，制得发酵料；经检测，淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BA-2和黑根霉(Rhizopus nigricans)RN-9的孢子数之和＞0.65亿/克；
(5)按步骤(4)制得的发酵料质量的0.05％加入甲壳素、7.0％加入尿素、1.5％加入硫酸钙(CaSO4)、5.0％加入三水合磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)、5.0％加入凹凸棒土，混合均匀，然后按步骤(4)制得的发酵料质量的5％加入甲基纤维素、1％加入羧甲基纤维素钠、5％加入乙基纤维素，加入5％酵母粉作粘合剂，搅拌混合均匀、远红外烘干75℃，25min、压制成型、热缩膜包装、装箱，该棒肥尺寸直径为60—80mm，长度为180—250mm，单棒重0.5—O.8Kg。生产工艺流程按上述原料配比，并测定每样原料的固有含量，混合搅拌、远红外烘干使含水量达到标准、液压机压制成型、热缩膜密封包装即为成品。
实施例2
一种防治青枯病的微生物有机肥的制备方法，包括以下步骤：
(1)将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA-2接种于LB平板培养基上，在37℃进行平板培养36h；黑根霉(Rhizopusnigricans)RN-9接种于PDA平板培养基上，在25℃进行平板培养50h；
(2)将步骤(1)平板培养后的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BA-2用接种环转接至LB液体培养基中，在37℃、120rpm条件下，进行PDB液体培养8天；黑根霉(Rhizopus nigricans)RN-9用内径为5mm的打孔器在菌落边缘打孔后，用接种环挑取菌丝块转接至PDB培养基中，在25℃、140rpm条件下，进行PDB液体培养15天，制得液体培养液；
(3)将步骤(2)制得的液体培养液是将淀粉芽孢杆菌液体培养液和黑根霉液体培养液体积比1:2混合，接种于麸皮葡萄糖培养基中，在30℃、150rpm条件下，发酵培养3天，制得发酵液；
上述麸皮葡萄糖培养基每升组分如下：
麸皮50克，葡萄糖20克，水定容至1L；
(4)将杂草干料粉碎至长度1～3cm后，按干重的30wt％加水，混合均匀，然后按小麦秸秆干重的5wt％接种步骤(3)制得的发酵液，混合均匀，将堆料堆成截面为宽2m、高1m的条形堆，每天翻堆3～4次，经堆料发酵3天，发酵温度30～40℃，发酵湿度保持在60％左右，制得发酵料；经检测，淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA-2和黑根霉(Rhizopus nigricans)RN-9的孢子数之和＞0.55亿/克；
(5)按步骤(4)制得的发酵料质量的0.02％加入甲壳素、8.0％加入尿素、0.5％加入硫酸钙(CaSO4)、12.0％加入三水合磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)、5％加入凹凸棒土，混合均匀，然后按步骤(4)制得的发酵料质量的1％加入甲基纤维素、5％加入羧甲基纤维素钠、1％加入乙基纤维素，加入5％酵母粉作粘合剂，搅拌混合均匀、远红外烘干、75℃，25min压制成型、热缩膜包装、装箱，该棒肥尺寸直径为60—80mm，长度为180—250mm，单棒重0.5—O.8Kg。生产工艺流程按上述原料配比，并测定每样原料的固有含量，混合搅拌、远红外烘干使含水量达到标准、液压机压制成型、热缩膜密封包装即为成品。
实施例3
一种防治青枯病的微生物有机肥的制备方法，包括以下步骤：
(1)将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA-2接种于LB平板培养基上，在37℃进行平板培养36h；黑根霉(Rhizopusnigricans)RN-9接种于PDA平板培养基上，在30℃进行平板培养36h；
(2)将步骤(1)平板培养后的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BA-2用接种环转接至LB液体培养基中，在37℃、120rpm条件下，进行PDB液体培养8天；黑根霉(Rhizopus nigricans)RN-9用内径为5mm的打孔器在菌落边缘打孔后，用接种环挑取菌丝块转接至PDB培养基中，在30℃、100rpm条件下，进行PDB液体培养8天，制得液体培养液；
(3)将步骤(2)制得的液体培养液是将淀粉芽孢杆菌液体培养液和黑根霉液体培养液按体积比1:3混合，混合后接种于麸皮葡萄糖培养基中，在28℃、120rpm条件下，发酵培养4天，制得发酵液；
上述麸皮葡萄糖培养基每升组分如下：
麸皮50克，葡萄糖20克，水定容至1L；
(4)将玉米秸秆干料粉碎至长度1～3cm后，按干重的50wt％加水，混合均匀，然后按小麦秸秆干重的2.5wt％接种步骤(3)制得的发酵液，混合均匀，将堆料堆成截面为宽2m、高1m的条形堆，每天翻堆3～4次，经堆料发酵5天，发酵温度30～40℃，发酵湿度保持在60％左右，制得发酵料；经检测，淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BA-2和黑根霉(Rhizopus nigricans)RN-9的孢子数之和＞0.6亿/克；
(5)按步骤(4)制得的发酵料质量的0.04％加入甲壳素、7.5％加入尿素、1.0％加入硫酸钙(CaSO4)、10.0％加入三水合磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)、5％加入凹凸棒土，混合均匀，然后按步骤(4)制得的发酵料质量的3％加入甲基纤维素、3％加入羧甲基纤维素钠、3％加入乙基纤维素，加入5％酵母粉作粘合剂，搅拌混合均匀、远红外烘干75℃，25min、压制成型、热缩膜包装、装箱，该棒肥尺寸直径为60—80mm，长度为180—250mm，单棒重0.5—O.8Kg。生产工艺流程按上述原料配比，并测定每样原料的固有含量，混合搅拌、远红外烘干使含水量达到标准、液压机压制成型、热缩膜密封包装即为成品。
试验例1
对峙培养测定生防菌和病原菌之间的拮抗活性
黑根霉(Rhizopus nigricans)RN-9，以下简称RN；保藏编号CGMCC NO.8436；
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA-2以下简称BA，菌种保藏编号CGMCC 1.936。
试验方法：在盛有混合培养基的培养皿两侧，分别接种直径为5mm的生防真菌菌丝块和病原菌菌丝块，28℃培养108h，并且每12h记录菌丝生长长度。混合培养基配方如下：
马铃薯200g，胰蛋白胨5g，酵母提取物2g，蔗糖15g，NaCl 2g，琼脂18g，蒸馏水定容至1000mL。
实验结果如表1-1、1-2所示：
表1-1 生防菌对茄科劳尔氏菌1号小种的抑制效果
表1-2 生防菌对茄科劳尔氏菌3号小种的抑制效果
试验例2
抑制真菌菌丝生长速率法测定生防菌发酵液对病原菌菌丝的抑制活性
试验方法：将具有遗传稳定性状的RN接种于平板PDA培养基上，28℃培养48h；BA接种于平板LB培养基上，37℃培养48h，然后用内径为5mm的打孔器在菌落边缘打孔，再用接种环挑取菌块(按照RN：BA＝1:0，0:1，1:1，1:2，1:3，1:4，1:5，分别标记为：RN、BA、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)于盛有500ml液体混合培养基中，28℃，120rpm，时间为10天，然后用4层纱布过滤出去菌丝，得发酵液。然后将发酵液浓缩10倍，将发酵液和PDA培养基按照体积比为1:1的比例倒入培养皿中，然后将内径为5mm的茄科劳尔氏菌1号小种和茄科劳尔氏菌3号小种接种到以上培养皿中，分别标记为RN、BA、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，28℃培养5天，并且每天记录菌丝长度。
液体混合培养基配方如下：
马铃薯200g，胰蛋白胨5g，酵母提取物2g，蔗糖15g，NaCl 2g，蒸馏水定容至1000mL。
如表2-1、2-2所示：RN、BA单独发酵比混合发酵的发酵液对病原菌的抑制作用较弱；其中，RN发酵液的抑制作用最弱，II号发酵液对病原菌的抑制作用最强，I号发酵液次之。但是这两种发酵液相对于BA发酵液的抑制作用较强。
表2-1 生防菌发酵液对茄科劳尔氏菌1号小种的抑制效果
表2-2 生防菌发酵液对茄科劳尔氏菌3号小种的抑制效果
试验例3
盆栽试验测定生防菌对病原菌的防治效果
试验方法：本实验使用“粉红寿丰一号”番茄种子，以灭菌沙壤土为基质，番茄种子用体积百分比75％的酒精消毒，置30℃恒温箱催芽移栽入盆，每盆3株，每处理4盆，一片真叶期灌根接种，首先每棵番茄植株接种5ml发酵液，12h后接种茄科劳尔氏菌，接种时用一硬板片插入植株四周的土中数次，以达到伤根的目的，然后每株灌2ml培养一周的浓度为1×107cfu/ml的孢子悬浮液，试验设4个处理：
(1)只接种茄科劳尔氏菌；(2)接种RN发酵液和茄科劳尔氏菌孢子悬浮液；(3)接种BA发酵液和茄科劳尔氏菌孢子悬浮液；(4)接种RN和BA混合发酵液(混合比例为1：1)和茄科劳尔氏菌孢子悬浮液；温室保持25～28℃，接种9d后调查病情，计算病情指数和相对防效。以FOC(107cfu/ml)按上述方法处理，接种后每隔3d调查一次各处理的发病情况，计算病情指数和相对防效。
实验结果如表3-1所示：单独用RN发酵液和BA发酵液防治的病情指数均低于混合菌株发酵液的病情指数，且达到显著性差异；BA防治效果好于RN，而两种菌等比例混合发酵液处理的病情指数在同等病原菌压力下均低于用单一菌防治的病情指数。说明接种混合菌对防治青枯病具有叠加效应。
表3-1 生防菌对番茄青枯病病指的防治效果(15d)
试验例4
混合微生物生防有机肥对铃薯青枯病的防治效果
试验方法：试验组和对照组为15m2马铃薯试验田，在播种前，对试验田的土壤进行处理，分别施用实施例1-3制备的混合微生物生防有机肥，即为实验组Ⅰ、实验组Ⅱ、实验组Ⅲ，施用混合微生物生防有机肥施用量均为150公斤/亩，然后翻土；对照组不做处理，做三个平行组，分别在6月、7月、8月，调查马铃薯病指。
病情指数＝{∑(各级病株数×各级严重度)/(调查总数×最高级别严重度)}×100％
相对防效＝{(对照组病情指数-实验组病情指数)/对照组病情指数}×100％
实验结果如表4-1、4-2所示，混合微生物生防有机肥对马铃薯青枯病的相对防效达到了65.2％，有效的改善土壤的理、化、生性状，马铃薯产量增加约36.93％。
表4-1 混合微生物生防有机肥对马铃薯青枯病的田间防治效果
表4-2 混合微生物生防有机肥对马铃薯青枯病的田间防治效果
注：R0,25表示大于0.25mm水稳性团聚体总量。
试验例5混合微生物生防有机肥对番茄青枯病的防治效果
试验组和对照组为15m2番茄试验田，在播种前，对试验田的土壤进行处理，分别施用实施例1-3制备的混合微生物生防有机肥，施用量均为150公斤/亩，然后翻土，即为实验组Ⅰ、实验组Ⅱ、实验组Ⅲ。对照组不作处理，做三个平行组。
病情指数＝{∑(各级病株数×各级严重度)/(调查总数×最高级别严重度)}×100％
相对防效＝{(对照组病情指数-实验组病情指数)/对照组病情指数}×100％
实验结果如表5-1和5-2所示，使用混合微生物生防有机肥后，混合微生物生防有机肥对番茄青枯病的相对防效达到66.67％，有效的改善土壤的理、化、生性状，番茄产量增加约40.78％。
表5-1 混合微生物生防有机肥对番茄青枯病的防治效果
表5-2 混合微生物生防有机肥对番茄青枯病的防治效果
注：R0,25表示大于0.25mm水稳性团聚体总量。

Claims (10)

1.一种防治青枯病的微生物有机肥，其特征在于，所述防治青枯病的微生物有机肥含有以下重量份的原料：
2.根据权利要求1所述的防治青枯病的微生物有机肥，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌和黑根霉的有机肥发酵料的制备方法为：
a、将解淀粉芽孢杆菌BA-2进行培养，制得淀粉芽孢杆菌液体培养液；
b、将黑根霉RN-9进行培养，制得黑根霉液体培养液；
c、将淀粉芽孢杆菌液体培养液和黑根霉液体培养液混合后接种于麸皮葡萄糖培养基中，经发酵培养，制得菌种发酵液；
d、将农家肥原料的干料粉碎后，加水，混合均匀，接种步骤c制得的菌种发酵液，混合均匀，堆料发酵，得发酵料。
3.根据权利要求2所述的防治青枯病的微生物有机肥，其特征在于，步骤a具体为：将解淀粉芽孢杆菌BA-2接种于LB平板培养基上进行平板培养，然后，转接至LB液体培养基中，进行摇瓶培养，制得淀粉芽孢杆菌液体培养液；所述平板培养的条件为35℃～37℃培养24h～36h；所述摇瓶培养条件为：35℃～37℃、120～140rpm条件下，培养4～8天。
4.根据权利要求2所述的防治青枯病的微生物有机肥，其特征在于，步骤b具体为：将黑根霉RN-9接种于PDA平板培养基上进行平板培养，然后将黑根霉RN-9菌丝块转接至PDB培养基中，进行摇瓶培养，制得黑根霉液体培养液；所述菌丝块用内径为5mm的打孔器在菌落边缘打孔后，用接种环挑取获得；所述平板培养的条件为25℃～30℃培养36h～50h；所述摇瓶培养条件为：25℃～30℃、120～140rpm条件下，培养8～15天。
5.根据权利要求2所述的防治青枯病的微生物有机肥，其特征在于，步骤c所述发酵培养条件为：在25℃～30℃、120～140rpm条件下，培养3～5天。
6.根据权利要求2或3所述的防治青枯病的微生物有机肥，其特征在于，步骤d具体为：将农家肥原料的干料粉碎后，按干重的40～50wt％加水，混合均匀，然后按农家肥原料干料的干重的2～5wt％接种步骤c制得的菌种发酵液，混合均匀，堆料发酵，制得解淀粉芽孢杆菌BA-2和黑根霉RN-9的孢子数之和不小于0.5亿/克的发酵料。
7.根据权利要求2或3所述的防治青枯病的微生物有机肥，其特征在于，步骤d中所述堆料发酵为：将堆料堆成截面为宽1.5～2.5m、高0.8～1.2m的条形堆，每天翻堆3～4次。
8.一种权利要求1-7任一项所述的防治青枯病的微生物有机肥的制备方法，包括以下步骤：
(1)将100重量份发酵料质量、0.02～0.05重量份甲壳素、7.0～8.0重量份尿素、0.5～1.5重量份硫酸钙、5.0～12.0重量份三水合磷酸氢二钾和凹凸棒土5份，混合均匀；
(2)然后加入1～5重量份的甲基纤维素、1～5重量份羧甲基纤维素钠、1～5重量份乙基纤维素，5重量份酵母粉，搅拌混合均匀；
(3)烘干，即得。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中烘干为：远红外烘干65～75℃，20～25min。
10.一种防治青枯病的微生物有机肥的应用，其特征在于，对茄科劳尔氏菌的抑制作用。
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