CN104726383A

CN104726383A - 解淀粉芽孢杆菌jk6及生物肥和应用

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Publication number: CN104726383A
Application number: CN201510179403.1A
Authority: CN
Inventors: 蔡燕飞; 熊汉琴; 李永涛; 郭真真; 张娅娅; 江亚雄
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2015-04-15
Filing date: 2015-04-15
Publication date: 2015-06-24
Anticipated expiration: 2035-04-15
Also published as: CN104726383B

Abstract

本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌JK6及生物肥和应用，该菌株保藏编号为CGMCC No.10658，于2015年03月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；本发明的解淀粉芽孢杆菌JK6主要用于番茄青枯病的生物防治；该解淀粉芽孢杆菌具备产铁载体、生物膜、蛋白酶、过氧化氢酶、纤维素酶和IAA特性，可有效抑制香蕉枯萎病原菌、荔枝炭疽病原菌、荔枝霜疫霉病原菌、水稻稻瘟病原菌、黄瓜枯萎病原菌等多种真菌病原菌，显著促进生菜植株的生长；K6菌株能够在土壤中成功定殖，并在土壤中表达防病功能基因yndJ、srfAB、fenD和ituC；该菌种繁殖速度快，生产工艺简单，抗逆能力强，易保存，利于工业化生产，利用该菌株制备生物肥，既可以防治土传病害又能促进植物生长，应用前景广阔。

Description

解淀粉芽孢杆菌JK6及生物肥和应用

技术领域

本发明涉及一种微生物及其应用，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌JK6(Bacillusamyloliquefaciens)及应用。

背景技术

番茄青枯病是由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种毁灭性土传病害，重病田发病率可高达80％以上，甚至造成绝收。目前，农业上对番茄青枯病主要依靠化学农药防治，效果均不理想，长期大量、不合理地施用化肥和化学农药，容易导致病原菌的耐药性、果蔬有毒化学物质残留量增加等问题。随着绿色农业的发展，逐渐转向以生物防治为主的综合防治，筛选高效拮抗菌株是生物防治的核心。研究表明能产生多种抗生素、具有广谱抑菌能力的解淀粉芽孢杆菌成为生物防治的重要研究对象。

全基因组测序快速发展以及对防病功能基因表达调控的研究，为探明生防菌株田间生防潜力提供了有力的技术方法。Okubara报道生防菌抗菌活性物质的合成与功能基因有关。B.amyloliquefaciens FZB42、FMB38、AS43.3的全基因组测序发现其均含有srfA、B、C、D，ituA、B、C、D，fenA、B、C、D，yndj，qk等多对防病功能基因，其发酵产物中也检测到多种抗生素，例如B.amyloliquefaciens FZB42能产surfactin、fengycin等抗生素，对尖孢镰刀菌、水稻纹枯病、灰霉病等有抑制作用；Christopher报道的B.amyloliquefaciens AS 43.3能产iturinA、bacillibactin等抗生素，可以有效防治赤霉病。Abdulwareth研究了Bacillus strain Am1、D16单独培养以及和青枯雷尔氏菌混合培养中ituC、srfAA、bacA、fenD等四个功能基因表达量的差异，结果表明：Bacillus strain D16和青枯雷尔氏菌混合培养液中，四个功能基因的表达量都增高；而Bacillus strain Am1和青枯雷尔氏菌混合培养液中，fenD的表达量下降，其余三个功能基因的表达量均增高；该结果表明Bacillus strain Am1、D16抑制青枯雷尔氏菌的效果与功能基因的表达情况密切相关。

虽然较多生防菌株已经报道含有多种防病功能基因，但在复杂的土壤环境因子中菌株能否成功定殖并大量表达还没有深入研究，土壤中功能基因表达量的定量检测方法尚待研究。本发明中的B.amyloliquefaciens JK6基因组中含有srfAB，ituA、B、C、D，fenD，yndJ等多种防病功能基因，并建立了利用RT-PCR技术研究菌株在土壤中功能基因表达的制备方法，结果证明施加了JK6菌剂的盆栽土中yndJ、srfAB、fenD、ituC等功能基因的拷贝数显著高于对照组，表明JK6菌株能够在土壤中大量定殖、繁殖，并成功表达多种功能基因，这些结果进一步确证菌株在土壤中生防潜力发挥。

发明内容

本发明的目的之一在于根据现有技术中上述问题，提供一种兼具防病与促生功能的解淀粉芽孢杆菌JK6。

本发明的第二个目的在于提供上述解淀粉芽孢杆菌JK6基因组为模板进行PCR扩增得到合成脂肽类抗生素的功能基因。

本发明的第三个目的在于提供上述解淀粉芽孢杆菌JK6的功能基因在土壤中表达的制备方法。

本发明的第四个目的在于提供上述解淀粉芽孢杆菌JK6的发酵液。

本发明的第五个目的在于提供上述解淀粉芽孢杆菌JK6发酵液的生物肥。

本发明的最后一个目的在于提供上述解淀粉芽孢杆菌JK6及生物肥的应用。

本发明的第一个目的是通过以下技术方案实现上述目的：

一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JK6，简称JK6菌。该菌株于2015年03月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号CGMCC No.10658，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

该JK6菌是在广州华南农业大学蔬菜基地的赤红壤中分离、纯化所得，目前已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101，其保藏编号为：CGMCC No.10658，保藏日期为2015年03月23日。

菌株的生理生化性质如下：属革兰氏阳性菌，有芽孢；菌体为杆状，有运动性，好氧；在牛肉膏蛋白胨培养基上培养24h后形成的菌落为圆形或不规则状，48h后菌落全部为圆形，乳白色，直径约为1～2mm，边缘不整齐，扁平湿润，表面形成生物膜，接触酶反应、蛋白酶反应为阳性；利用碳水化合物产酸试验：淀粉水解、水解明胶为阳性，柠檬酸盐利用和甲基红试验为阴性。

菌株具有较强的抑制细菌和真菌病原菌的能力，经过生理生化和分子鉴定为解淀粉芽孢杆菌，其拉丁名为：Bacillus amyloliquefaciens，菌株的16S rRNA基因序列测定结果如SEQ IDNO:1所示。

JK6菌的保藏方法，其保藏培养基的成分为牛肉膏3.0g，蛋白胨5.0g，氯化钠5.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL，或按照此比例配制成的培养基，pH值为7.0～7.2。按常规菌种保藏温度保藏。

本发明的第二个目的是通过下述技术方案实现的：

以上述的解淀粉芽孢杆菌JK6基因组为模板进行PCR扩增得到合成脂肽类抗生素的功能基因；

所述的功能基因如下：

1)yndJ，其基因序列如SEQ ID NO.4；

2)fenD，其基因序列如SEQ ID NO.5；

3)ituC，其基因序列如SEQID NO.6；

4)ituD，其基因序列如SEQID NO.7；

5)ituB，其基因序列如SEQID NO.8；

6)ituA，其基因序列如SEQID NO.9；

7)srfAB，其基因序列如SEQID NO.10。

上述功能基因，其PCR反应体系和条件如下：

(1)PCR反应体系：10×Taq buffer 5μL，dNTP 4μL，5’端引物(25pmol/L)2μL，3’端引物(25pmol/L)2μL，模板DNA 2μL，Taq DNA聚合酶(5U)0.25μL，H₂O 34.75μL，总体积50μL。

(2)PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃补充延伸10min。

本发明的第三个目的是通过下述技术方案实现的：

上述解淀粉芽孢杆菌JK6的功能基因在土壤中表达的制备方法：

(1)以分别含有功能基因(yndJ、srfAB、fenD、ituC)的重组质粒载体为模板，测定其DNA浓度并换算成拷贝数，绘制标准曲线；用Power soil试剂盒提取番茄盆栽不同处理土壤的总DNA；将供试土壤总DNA和获得的重组质粒DNA为模板，进行RT-PCR分析；

(2)其RT-PCR扩增体系为20μL：DNA模板1μL；上、下引物各1μL；SYBR Premix Ex-Taq(DBI)10μL，水7μL；

(3)其RT-PCR扩增条件如下：

Cycle1：95℃2min；

Cycle2×40(Real time)：step1:95℃15s，step2:60℃20s；

Cycle3(Melt Curve)：95℃1min，60℃1min，95℃20s；

(4)其RT-PCR扩增的引物为：ituC：ITUC-F：GCCTCCTGCTCATTGTCCTT，ITUC-R：GACGGCGTATCGTGGAGAAT，其它功能基因RT-PCR采用的引物同菌株DNA功能基因普通PCR引物一致，如表7所示。

本发明的第四个目的是通过下述技术方案实现的：

一种含解淀粉芽孢杆菌JK6的发酵液。

进一步的，上述的含解淀粉芽孢杆菌JK6的发酵液，所述的发酵液中含有脂肽类抗生素surfactin，其含量为64.24mg/L。

该发酵液的制备方法如下：

在超净工作台中把保存在斜面上的菌株接种到平板上活化培养，培养温度28～30℃，培养18-36h；种子液培养：从平板上挑活化的菌落接入种子培养液中，30℃摇床培养1d，转速150r/min，得到种子液；按5％接种量，将获得的种子液接入发酵培养基中，30℃摇床培养2～4d，转速150r/min，得到解淀粉芽孢杆菌JK6的发酵液。

抑菌活性物质的提取方法如下：

取5mL发酵液在10000r/min下离心10min，除去菌体、取上清液，重复该步骤一次得到无细胞上清液，加入活化的C18萃取柱中，用5mL高纯水洗涤2遍，再分别用1mL的60％～100％的甲醇溶液萃取，再过0.22μm的滤膜，既得抑菌活性物质surfactin的萃取液。

用HPLC仪器测定surfactin含量的方法如下：

从sigma公司购买surfactin标准品，用甲醇分别配制成100、250、500、1000ppm的标准品，用HPLC测定标品和JK6样品，其HPLC的检测条件：色谱柱为Agilent C18柱，4.6mm×250mm×0.5μm；进样量20μL；柱温33-35℃；检测波长210nm；流速0.8-1.0ml/min；检测时间20min。溶剂：A为水加0.1％TFA，B为100％乙腈；梯度变化条件如表1所示。

表1surfactin检测时的流动相

本发明的第五个目的是通过下述技术方案实现的：

一种含上述的解淀粉芽孢杆菌JK6发酵液的生物肥，其中，所述的解淀粉芽孢杆菌JK6含量为2×10⁸～2×10¹⁰cfu/mL。

该生物肥的制备方法如下：

1)在超净工作台中把保存在斜面上的菌株接种到平板上活化培养，培养温度28～30℃，培养18-36h；

2)种子液培养：从平板上挑活化的菌落接入种子培养液中，30℃摇床培养1d，转速150r/min，得到种子液；

3)发酵培养：按5％-10％接种量，将获得的种子液接入发酵培养基中，30℃摇床培养1d，转速150r/min，得到解淀粉芽孢杆菌JK6的发酵液。

其中：

种子培养时所用的培养基成分：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，琼脂15～20g/L，pH 6.8～7.2；

发酵培养时所用的培养基成分：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH7.0～7.2。

本发明的最后一个技术方案是提供该解淀粉芽孢杆菌JK6的应用，具体如下：

上述的解淀粉芽孢杆菌JK6或者生物肥在产铁载体、生物膜、蛋白酶、过氧化氢酶、纤维素酶以及IAA方面的应用。

上述的解淀粉芽孢杆菌JK6或者生物肥在抑制植物真菌病原菌方面的应用，所述的植物真菌病原菌为香蕉枯萎病原菌、荔枝炭疽病原菌、荔枝霜疫霉病原菌、水稻稻瘟病原菌、黄瓜枯萎病原菌。

上述的解淀粉芽孢杆菌JK6或者生物肥在防治番茄青枯病方面的应用。

所述番茄青枯病的病原菌为青枯假单胞菌(Ralstonia Solanacearum)。所述香蕉枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)。所述荔枝炭疽病的病原菌为(Colletotrichum gloeosporioides)。所述荔枝霜疫霉的病原菌为(Peronophythora litchii)。所述水稻稻瘟病的病原菌为(Magnaporthe oryzae)。所述黄瓜枯萎病的病原菌为(F.oxysporumf.sp.cucumerinum)。

上述的解淀粉芽孢杆菌JK6或者生物肥在促进植物生长中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明从广州华南地区的赤红壤中分离得到解淀粉芽孢杆菌JK6，在室内试验中验证了其具备产铁载体、生物膜、过氧化氢酶、蛋白酶、纤维素酶和IAA等多种拮抗和促生特性，并从其发酵液中分离得到主要抗菌物质脂肽类抗生素surfactin。本研究分别从多方面综合探究生防菌株的防病机制，将为其防病促生潜力稳定高效发挥提供理论依据，对生防菌剂的大面积推广应用有重要的实践意义，具体表现如下：

(1)本发明提供的解淀粉芽孢杆菌JK6，对番茄青枯病具有高效生物防治能力，盆栽试验结果表明，在含有青枯病菌的土壤中施加该菌剂后，番茄青枯病的生物防治率达52.2％。

(2)该菌株能产吲哚乙酸，能促进植物的生长，生菜大田试验结果表明：施加了该菌剂处理的生菜干物质量比对照增加了64.2％，显著增加生菜植物的产量。

(3)该菌株对香蕉枯萎病原菌、荔枝炭疽病原菌、荔枝霜疫霉病原菌、水稻稻瘟病原菌、黄瓜枯萎病原菌等多种真菌病原菌具有广谱抑菌能力。

(4)该菌株发酵液的抑菌物质中分离得到脂肽类抗生素surfactin，其产量高达64.24mg/L，属于天然农用抗生素，对生物防治的重要作用在国内外均有报道。

(5)对土壤DNA中的防病功能基因采用RT-PCR技术进行定量分析，结果表明施加了JK6菌剂的土样中功能基因(yndJ、srfAB、fenD、ituC)的拷贝数显著高于没有施加JK6菌剂的对照处理，进一步确证了生防菌株在土壤中产生实际的生防效果，并建立了菌株功能基因在土壤中表达的制备方法。

(6)该菌株繁殖速度快，生产工艺简单，抗逆能力强，易保存，利于工业化生产；能防治多种土传真菌和细菌病害，显著促进植物生长，可以减少农民使用化肥和化学农药的用量，既能节省开支，又利于蔬菜无公害生产，利于农产品出口，同时可为农民增加收入。

(7)本发明将为研究功能菌株的高效生物防治潜力发挥提供理论依据，同时为生物防治提供高效菌株资源。

图1.JK6菌革兰氏染色显微照片，菌体被染成紫色；

图2.JK6菌芽孢染色显微照片，其中蓝色部分为芽孢；

图3.JK6菌系统发育树图；

图4.JK6菌产过氧化氢酶试验照片，其中HL-1为阳性对照；

图5.JK6菌解淀粉试验照片，其中HL-1为阳性对照；

图6.JK6菌产生物膜试验照片；

图7.JK6菌产铁载体试验照片；

图8.JK6菌为产蛋白酶试验；

图9.JK6菌产纤维素酶试验；

图10.JK6菌对番茄青枯病原菌的拮抗效果图；

其平板是含番茄青枯病原菌的培养基，用灭菌打孔器打孔，用移液枪移20μLJK6发酵液于孔中，对峙培养2d后观察含菌平板上形成的抑菌圈；

图11.JK6菌对真菌病原菌的拮抗效果图；

其中A：香蕉枯萎病原菌；B：荔枝炭疽病原菌；C：荔枝霜疫霉病原菌；D：水稻稻瘟病原菌；E：黄瓜枯萎病原菌。

图12.JK6菌防治番茄青枯病的盆栽试验照片；

图13.JK6菌抗菌物质合成相关功能基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；

其中左右的泳道分别为DL 2000DNA maker、yndJ、fenD、ituC、srfAB、ituA、ituD、ituB。

图14.JK6菌发酵液中m/z([M-H]^-)分别为992.7、1006.6、1020.6、1034.6的surfactin类组分的质谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权力要求范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。

以下实施例中除特别说明外，均为本领域内的常规实验方法和操作步骤。

实施例1 菌株的分离、纯化

(1)分离

牛肉膏蛋白胨培养基：细菌学蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH调为7.0～7.2。

含青枯菌平板的制备：将青枯病菌制成菌悬液，用移液枪吸取5mL青枯病菌(RalstoniaSolanacearum)菌悬液加入盛有加热融化后温度降至50℃左右的100mL的牛肉膏蛋白胨培养基中，摇匀，倒板，自然晾干，制成含青枯菌的平板备用。

以广州华南农业大学农场番茄种植基地的赤红壤为筛选土样，用平板涂布法准确称取筛选土样10g，放入装有90mL无菌水的250mL三角瓶中(加玻璃珠)，摇床振荡30min，使细菌充分分散，静置20～30s，取上清液进行10倍递减稀释，采用10³～10⁵稀释度，用移液枪分别移取稀释液0.l mL，涂布在含菌平板上，28℃倒置培养2d，逐日观察透明圈，记录拮抗圈直径(D)。筛选出有拮抗圈的细菌菌株编号为JK6、F7和Y-2，其中JK6的拮抗效果最强，D/d值为5.04。

(2)纯化

将初步筛选出的拮抗菌在牛肉膏蛋白胨培养基上划线纯化后，挑单菌落于LB液体培养基中过夜培养，菌液保存在-80℃的甘油管中。

实施例2 特性鉴定

(1)菌体形态特性

革兰氏阳性菌，有芽孢。菌体为杆状，有运动性，好氧。菌体革兰氏染色显微照片见图1，芽孢染色照片见图2。

(2)菌落形态特性

在牛肉膏蛋白胨培养基上培养24h后形成的菌落为圆形或不规则状，48h后菌落全部为圆形，乳白色，直径约为1～2mm，边缘不整齐，扁平湿润，表面形成生物膜。

(3)生长特性

在酵母提取粉5g，细菌学蛋白胨10g，氯化钠10g，水1000mL的液体培养基中，转速150rpm/min，温度30℃，起始pH值为7.0的条件下，培养18h，测得活菌数为(3.95±0.60)×10⁸cfu/mL。

(4)生理、生化特性

参考《伯杰氏细菌鉴定手册》的常规实验方法，对此菌株进行一些生理生化试验，实验结果见表2。

表2 菌株JK6生理生化试验

试验名称	结果	试验名称	结果
				过氧化氢酶	+	解淀粉试验	+
铁载体试验	+	明胶液化试验	+
				纤维素降解	+	产IAA试验	+
产生物膜	+	蛋白酶降解	+
				产氨试验	+	甲基红试验	－

注：+表示为阳性；－表示为阴性

(5)分子生物学特性

采用试剂盒法提取JK6菌总DNA。采用细菌16S rDNA通用引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,SEQ ID NO:2)和1492R(ACGGCTACCTTGTTACGACTT,SEQ ID NO:3)，PCR扩增细菌的16S rRNA，在1400bp附近出现明显的条带，将PCR扩增产物回收后进行序列测定，将获得的DNA序列输入GenBank，以Blast程序对数据库中的所有序列进行比较分析，结果发现本发明所述菌株的16S rRNA序列(SEQ ID NO:1)和与GenBank中解淀粉芽孢杆菌模式菌株Bacillus amyloliquefaciens FZB42具有较高的同源性，其相似度为99％。结合上述的平板菌落特征、生理生化特性、16S rRNA序列建系统发育树的结果，初步鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，命名为Bacillusamyloliquefaciens JK6(系统发育树见图3)。

该JK6菌是在广东省广州市华南农业大学番茄种植基地的赤红壤中分离、纯化所得，目前已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101，其保藏编号为：CGMCC No.10658，保藏日期为2015年03月23日。

实施例3 JK6菌产过氧化氢酶试验

将JK6菌在牛肉膏蛋白胨培养基上活化24h后，挑适量供试菌株于载玻片上，滴加3％过氧化氢于供试菌株上，立即观察，有大量气泡产生，即为阳性，反之为阴性。以HL-1为阳性对照，试验结果如图4所示，表明JK6菌的过氧化氢酶试验为阳性。

实施例4 JK6菌解淀粉试验

将JK6菌点接在淀粉培养基平板上，30℃恒温培养箱中培养48h，形成明显的菌落后，在平板上滴加碘液，平板呈蓝黑色，菌落周围如有不变色透明圈，表示淀粉水解阳性；仍是蓝黑色为阴性。以HL-1为阳性对照，试验结果如图5所示，表明JK6菌的解淀粉试验为阳性。

实施例5 JK6菌产生物膜试验

将50μL过夜培养的新鲜待测菌液接种于装有500μL的LB液体培养基的微离心管中(1.5mL),30℃静置过夜培养(24h)，弃菌液，用无菌水轻柔地洗一遍后，加入l mL l％的结晶紫染色15min，用无菌水将染液洗净，若在管内壁的空气与培养基的接触面上形成一道清楚的紫色环痕，即产生物膜，试验结果如图6所示，说明该菌株产生物膜。

实施例6 JK6菌产铁载体试验

(1)铬天青(CAS)检测液的配制：

溶液A：将0.07g铬天青粉末溶于50mL去离子水中，再加入10mL 1mmolL^-1的氯化铁溶液(配制：称取0.027g氯化铁溶解，加入0.833mL 12molL^-1的氯化氢，定容至100mL)。

溶液B：将0.06g的HDTMA溶于40mL去离子水中。

溶液C：将A溶液沿烧杯壁缓缓加入到B溶液中，轻轻晃动，使得溶液A与B混合均匀，既得溶液C：CAS检测液。

(2)蓝色检测板的制备：

蔗糖-天冬酰胺(MSA)培养基(gL^-1)：蔗糖20g，天冬酰胺2.0g，硫酸氢二钾1.0g，七水硫酸镁0.5g，pH7.0。

在MSA培养基中加入1.8％琼脂成为固体培养基，121℃灭菌15min。

将CAS蓝色液在55℃水浴30min以上，培养基冷却至55-60℃左右，在无菌环境下以每100mL固体MSA培养基加20mL CAS检测液，沿三角瓶壁缓缓加入，注意轻晃，避免气泡。待平板冷却备用。

(3)接种

将菌株点接于MSA平板上，置于30℃培养3d，观察菌落外围黄色晕圈的大小，由于嗜铁素竞争培养基中的EDTA螯合的铁离子，使培养基由蓝色变为黄色，由此判断是否产铁载体。试验结果如图7所示，该菌株的周围出现明显的黄色晕圈，说明该菌株产铁载体。

实施例7 JK6菌产蛋白酶试验

蛋白酶检测培养基(g_.L^-1)：蛋白胨10g，氯化钠5g，氯化钙0.1g，脱脂奶粉10g，琼脂18g，115℃灭菌30min，pH 7.2-7.4。

将菌株接种到蛋白酶检测培养基上，30℃培养2d，观察菌落周围的透明圈大小来判断菌株的蛋白质水解能力，结果如图8所示，与对照相比，菌株平板上的蛋白质几乎都被利用完全，说明该菌株利用蛋白质的能力很强。

实施例8 JK6菌产纤维素酶试验

CMC培养基配方(g_.L^-1)：羧甲基纤维素钠20g，磷酸氢二钠1.5g，磷酸二氢钠2.5g，琼脂20g，水1000ml，PH：7.0-7.2。

将JK6菌从斜面上点接到CMC平板上，30℃培养2d，用千分之一的刚果红溶液(1g/L)染色30min，再用1mol/L的氯化钠溶液固定30min，最后用流动的水冲洗，根据菌落周围是否出现透明圈来判断菌株产纤维素酶的能力，结果如图9所示，菌落周围出现透明圈，说明该菌株能够产纤维素酶。

实施例9 JK6菌产IAA试验

将JK6菌接种于含有100mg/L的L-色氨酸的LB液体培养基中，30℃，180r/min，摇床培养1d，将菌悬液在8000rpm下离心10min，取4mL上清液加入4mL S2比色液，混匀，黑暗中静置30min，在530nm下测吸光度，同时用无菌培养基做相同处理作为对照，用0、10、20、30、50(ug/mL)的IAA作标准曲线。结果显示JK6菌的IAA产量为4μg/mL。

实施例10 JK6菌株对青枯病菌的平板拮抗效果试验

采用打孔对峙法。用移液枪吸取5mL青枯病菌菌悬液加入盛有加热融化后温度降至50℃左右的100mL的牛肉膏蛋白胨培养基中，摇匀，倒板，自然晾干，制成含青枯菌的平板备用。用直径为5mm的灭菌打孔器在含菌平板中央打孔，用灭菌的牙签把菌饼移除。用移液枪吸取20μL的JK6菌悬液于含菌平板中央的孔中，30℃培养2～4d，观察孔的周围有无抑菌圈，测量抑菌圈半径。结果表明(图10)：JK6菌拮抗番茄青枯病菌效果显著，抑菌圈直径为25.2mm。

实施例11 JK6菌对真菌病原菌的平板拮抗效果试验

PDA培养基：取去皮的马铃薯200.0g，切成小块。加水煮沸30min，滤去马铃薯块将滤液加水补足至1000mL，加葡萄糖20.0g，琼脂粉18g，熔化后分装，121℃灭菌20min。

采用平板对峙法。分别将已培养3d的真菌病原菌菌饼(φ5mm)移至PDA平板中央，然后用接种环将供试JK6菌接种于病原菌菌饼的两侧，28℃培养，5d后观察抑菌圈。以不接种供试细菌的平板作对照。结果见图11，其中A：香蕉枯萎病原菌Fusarium oxysporum f.sp.cubense；B：荔枝炭疽病原菌Colletotrichum gloeosporioides；C：荔枝霜疫霉病原菌Peronophythoralitchii；D：水稻稻瘟病原菌Magnaporthe oryzae；E：黄瓜枯萎病原菌F.oxysporum f.sp.cucumerinum。该结果表明JK6菌能够显著抑制香蕉枯萎病原菌、荔枝炭疽病原菌、荔枝霜疫霉病原菌、水稻稻瘟病病原菌、黄瓜枯萎病原菌的生长。

表3 JK6菌对植物真菌病原菌的抑制效果

注：数据为4次重复的平均值±标准误，表中同列不同字母者，表示在0.05水平差异显著(DMR法)，下表相同。

实施例12 JK6菌防治番茄青枯病及促进植物生长盆栽效果试验

盆栽试验：采用JK6菌和空白对照进行效果对比试验，共分2个处理组(第1组加入JK6菌菌体重悬液70mL，用JK6表示，第2组加入无菌水70mL作为空白对照，用CK表示)，每个重复2盆，每盆4棵苗，每个处理3个重复。各处理组含土1.5kg，具体试验设计见表4。番茄种子水洗催芽，用滤纸沁润保存水分，放置在30℃培养箱内，两天后露出芽播种至苗床中。当苗约10cm高，移苗至盆中。每天浇水适量，每盆的水量相同，均匀，注意不要使水流出盆底以免肥料损失而误差。2014年4月26日测量番茄株高和复叶片数。结果表明(表5及图12)：加入JK6菌能够有效降低青枯病的发病率及显著促进植物的生长。

表4 番茄盆栽试验设计

实施例13 JK6菌促进植物生长田间效果试验

采用JK6菌和空白对照进行效果对比试验，共分2个处理组(第1组加入JK6菌发酵液，用JK6表示；第2组加入相同量的未接菌株的培养基，用CK表示)。每个处理组3个小区，每个小区面积2.43×1.4m²，种植密度15×8＝120株苗(除去边际效应保护行，实际株数13×6＝78株)。生菜种子水洗催芽，用滤纸沁润保存水分，两天后露出芽播种至苗床中。当苗长出两心一叶时，移入大田，每小区136棵苗。每个小区定量浇水，均匀一致。2014年4月18日收苗，并测量生菜株高、叶面积、相对叶绿素含量、根干重、叶干重等。结果表明(表6)：加入JK6菌能够促进生菜的生长。

表6 JK6菌对生菜植株的田间促生效果对比表

实施例14 JK6菌抗生素合成功能基因的检测

为了明确解淀粉芽孢杆菌JK6能否产生脂肽类抗生素，首先采用PCR方法对菌株JK6基因组中脂肽抗生素合成相关功能基因进行检测，对可能产生的脂肽类物质进行预判断。本研究采用的引物是参照文献报道，引物序列见表7。PCR反应体系为：10×Taq buffer 5μL，dNTP 4μL，5’端引物(25pmol/L)2μL，3’端引物(25pmol/L)2μL，模板DNA 2μL，TaqDNA聚合酶(5U)0.25μL，H₂O 34.75μL，总体积50μL。PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃补充延伸10min。PCR产物切胶回收后，连接到载体pMD18-T上，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆测序。测序由华大科技公司(广州)完成。DNA测序后的产物序列利用NCBI数据库的BLASTN程序进行同源性检索，与GenBank数据进行对比分析。

表7 扩增基因及引物序列

以菌株JK6基因组DNA为模板，扩增抗菌物质合成的相关功能基因，其PCR产物的大小与理论值相吻合。结果如图13所示，左右的泳道分别为DL 2000DNA maker、yndJ、fenD、ituC、srfAB、ituA、ituD、ituB。

将扩增的各基因片段送测序，测序结果如：yndJ：SEQ ID NO:4；fenD：SEQ ID NO:5；ituC：SEQ ID NO:6；ituD：SEQ ID NO:7；ituB：SEQ ID NO:8；ituA：SEQ ID NO:9；srfAB：SEQID NO:10；将其序列在NCBI上进行BLAST同源性分析，结果如下表8所示：

表8 PCR产物测序比对结果以及具有最高相似度的菌株信息

因此鉴定菌株JK6基因组上含有脂肽类抗生素surfactin，fengycin，iturin的合成功能基因以及yndj假定蛋白基因。

实施例15 JK6菌功能基因在番茄盆栽土壤中表达的制备方法及拷贝数

1)以分别含有功能基因(yndJ、srfAB、fenD、ituC)的重组质粒载体为模板，测定其DNA浓度并换算成拷贝数，绘制标准曲线；用Power soil试剂盒提取番茄盆栽不同处理土壤的总DNA；将供试土壤总DNA和获得的重组质粒DNA为模板，进行RT-PCR分析；

2)其RT-PCR扩增体系为20μL：DNA模板1μL；上、下引物各1μL；SYBR Premix Ex-Taq(DBI)10μL，水7μL。

3)其RT-PCR扩增条件如下：

Cycle1：95℃，2min；

Cycle2×40(Real time)：step1:95℃15s，step2:60℃20s；

Cycle3(Melt Curve)：95℃1min，60℃1min，95℃20s。

4)其RT-PCR扩增的引物为：ituC为：ITUC-F：GCCTCCTGCTCATTGTCCTT，ITUC-R：GACGGCGTATCGTGGAGAAT，其它功能基因RT-PCR采用的引物同菌株DNA功能基因普通PCR的引物一致，如表7所示。

5)盆栽土壤中功能基因绝对定量的拷贝数结果，如表9：

表9 番茄盆栽土壤功能基因的拷贝数

结果表明施加了JK6菌株处理的土壤中，功能基因yndJ、srfAB、fenD、ituC的拷贝数均显著高于对照组，有助于确证生防菌株JK6在土壤中产生实际的生防效果并揭示其生防机制。

实施例16 含解淀粉芽孢杆菌JK6发酵液的制备方法

该发酵液的制备方法如下：

实施例17 JK6菌发酵液粗提物中脂肽类抗生素的分离鉴定及定量

取5mL发酵液在10000r/min下离心10min，除去菌体、取上清液，重复该步骤一次得到无细胞上清液，加入活化的C18萃取柱中，用5mL高纯水洗涤2遍，再分别用1mL的60％～100％的甲醇溶液萃取，再过0.22μm的滤膜，收集粗提物，送去中山大学测试中心测样，经HPLC-ESI-MS系统分析鉴定其成分并进行定量分析。将surfactin标品与JK6样品一起经HPLC分析得：JK6发酵液中surfactin产量为：64.24mg/L；其MS阴离子流图分析可知(图14)，JK6样品中检测到m/z([M-H]^-)为992.7、1006.6、1020.6、1034.6的质谱峰，与脂肽物质surfactin同系物的分子量相吻合，再结合JK6菌DNA的功能基因扩增结果，鉴定JK6菌发酵液的抗菌物质中含有脂肽类抗生素surfactin，其产量为64.24mg/L。

实施例18 含解淀粉芽孢杆菌JK6发酵液

该发酵液中含解淀粉芽孢杆菌JK6为2×10⁸～2×10¹⁰cfu/mL。

其制备方法如下：

1)在超净工作台中把保存在斜面上的菌株接种到平板上活化培(培养基)养，培养温度28～30℃，培养18-36h；

2)种子培养：从平板上挑活化的菌落接入种子培养液中，30℃摇床培养1d，转速150r/min，得到种子液；

其中：

本发明解淀粉芽孢杆菌JK6，从广州华南地区赤红壤中分离得到，还具有多种有益特性，譬如其发酵液的主要成分surfactin，产量高达64.24mg/L，是目前认为较好的生物表面活性剂，具有很强的乳化和发泡作用，可以破坏细胞膜，具有抗病毒、溶血、抗支原体和抗细菌的作用，可以协助其他脂肽抗生素如iturin、fengycin等拮抗真菌，能在植物根部形成一层生物膜(Biofilm)保护植物根部免受病原菌的入侵，对芽孢杆菌的繁殖和定殖起到重要作用。此外，JK6菌还产生其他抗菌和促生物质，如铁载体、生物膜、蛋白酶、过氧化氢酶、纤维素酶和IAA等。综合而言，JK6显示了其巨大的生防和促生潜力。

Claims

1.一株解淀粉芽孢杆菌JK6，保藏编号CGMCC No.10658，于2015年03月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌JK6，其特征在于，其16S rRNA核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示。

3.以权利要求1或2所述的解淀粉芽孢杆菌JK6基因组为模板进行PCR扩增得到合成脂肽类抗生素的功能基因；

所述的功能基因如下：

1)yndJ，其基因序列如SEQ ID NO.4；

2)fenD，其基因序列如SEQ ID NO.5；

3)ituC，其基因序列如SEQID NO.6；

4)ituD，其基因序列如SEQID NO.7；

5)ituB，其基因序列如SEQID NO.8；

6)ituA，其基因序列如SEQID NO.9；

7)srfAB，其基因序列如SEQID NO.10；

4.根据权利要求3所述的解淀粉芽孢杆菌JK6基因组为模板进行PCR扩增得到合成脂肽类抗生素的功能基因，其特征在于，所述的功能基因能够在土壤中成功的表达，其在土壤中表达的制备方法如下：

1)以含有功能基因的重组质粒载体为模板，测定其浓度和换算成拷贝数，绘制标准曲线；用Power soil试剂盒提取供试土壤的DNA；将供试土壤DNA和获得的重组质粒DNA为模板，进行实时荧光定量PCR分析；

2)其RT-PCR扩增体系为20μL：DNA模板1μL；上、下引物各1μL；SYBR PremixEx-Taq10μL，水7μL。

3)其RT-PCR扩增条件如下：

Cycle1：95℃2min；

Cycle2×40：step1：95℃15s，step2：60℃20s；

Cycle3：95℃1min，60℃1min，95℃20s。

5.一种含解淀粉芽孢杆菌JK6的发酵液，其特征在于，所述的发酵液中含有脂肽类抗生素surfactin，其含量为64.24mg/L。

6.一种含权利要求5所述的解淀粉芽孢杆菌JK6发酵液的生物肥，其中，所述的解淀粉芽孢杆菌JK6含量为2×10⁸～2×10¹⁰cfu/mL。

7.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌JK6在产铁载体、产生物膜、产蛋白酶、产过氧化氢酶、产纤维素酶以及产IAA方面的应用。

8.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌JK6在抑制植物真菌病原菌方面的应用，所述的植物真菌病原菌为香蕉枯萎病原菌、荔枝炭疽病原菌、荔枝霜疫霉病原菌、水稻稻瘟病原菌、黄瓜枯萎病原菌。

9.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌JK6在防治番茄青枯病方面的应用。

10.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌JK6或权利要求6所述的生物肥在促进植物生长中的应用。