CN102864100A - 一株解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
一株解淀粉芽孢杆菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌及其应用。本发明提供的解淀粉芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.5043，其发酵液及制得的菌剂可以用于防治植物病害，同时具有安全高效，无药残，无毒副作用，能减少抗生素药物的使用，增强免疫力的优点。
Description
技术领域
本发明属于微生物应用领域。具体而言，本发明涉及一种解淀粉芽孢杆菌菌株及其用途。
背景技术
种植业每年因病虫害造成巨大的损失。病虫害的防治有多种方法，其中化学防治在植物病虫害的防治中发挥了巨大作用，为农业的增产、稳产和提高品质做出了重要贡献。但是，过量施用和滥用农药导致地力衰退和环境污染。尤其是近几年来，农药残留超标的问题严重影响了人们的生活质量。
目前，在蔬菜、水果等农作物的无公害栽培中，微生物农药越来越受到重视。原因在于，它们不仅防治病虫害的效果好，而且对环境友好、对农作物无污染，病虫对其不易产生抗药性。因此，在生物农药中，微生物农药用途多、应用前景最为广阔。
芽孢杆菌属细菌已较为广泛地用于制备微生物农药。芽孢杆菌属细菌为好氧或兼性厌氧的杆菌，广泛分布在水、空气和土壤中；在孢子状态下稳定性好，能耐氧化；耐挤压；耐高温，能长期耐60°C高温，在120°C温度下能存活20分钟。目前芽孢杆菌属用于防止病虫害主要有：枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、腊状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌等。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于高效防治植物病害的新的芽孢杆菌属菌株——解淀粉芽孢杆菌。本发明的解淀粉芽孢杆菌菌株可以用作生物肥料以及生物农药，具有良好的应用前景。
本发明的另一个目的是提供一种采用该新的解淀粉芽孢杆菌制备的发酵液和菌剂。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌，所述解淀粉芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.5043。
本发明所提供的菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LLM-002，是从山东省寿光市蔬菜大棚采用土壤稀释分离法分离获得的，已于2011年07月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.5043。其具有以下微生物学特性：菌体杆状，革兰氏阳性菌，周生鞭毛，兼性厌氧。NA培养基培养菌落圆形，白色，平展，表面粗糙，中间有圆环形突起，边缘整齐。液体培养形成菌膜，液体颜色棕黄色，浑浊，有沉淀。
该菌株的16S rRNA基因序列测定结果如下：
CGGCGGCTGGCTCATAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGT
GTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGT
CGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCT
TTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCT
TCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCG
CTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCC
CCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTC
GAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTA
CTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCA
TCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTT
ACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAAT
TCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCAC
ATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATT
ACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCGCCCTATTTGAAC
GGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGT
CAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCA
GTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTA
ATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTCTGAACCATGCGGTTCAAACAAC
CATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCC
GTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTTGCATGTATTAGGC
该菌株的atpA基因序列测定结果如下：
GTTGGCCGGTGAACTTGTTGAGTTTTCAAACGGCGTTTTGGGTATGGCTCAAAACCTTGAAGAATCCAACGT
AGGTATCGTTATCTTAGGACCTTACAGAGATATCCGTGAAGGTGATGAGGTCAAAAGAACGGGCCGCATCAT
GGAAGTTCCTGTAGGTGAAGAATTAATCGGACGTATCGTCAACCCGCTCGGACAGCCGGTAGACGGACTGGG
TCCGATTCTGACAAGCAAAACACGTCCGATCGAAAGCCAGGCTCCAGGCGTAATGGACCGTAAATCGGTACA
TGAGCCGCTGCAAACGGGTATCAAAGCGATCGACGCGTTAATTCCGATCGGCCGCGGACAGCGTGAGCTGAT
TATCGGTGACCGTCAGACAGGTAAAACATCTGTTGCGATTGATACAATCTTAAACCAAAAAGATCAAGACAT
GATCTGTGTGTACGTAGCGATCGGCCAGAAAGAATCTACAGTGCGCGGCGTAGTGGAAACACTTCGTAAGCA
TGGCGCGCTTGATTACACGATTGTCGTGACGGCGTCCGCTTCACAGCCGGCTCCGCTTCTGTACCTTGCACC
GTATGCAGGGGTGACAATGGGTGAAGAATTCATGTACAACGGCAAGCACGTTCTCGTCGTATATGATGATTT
ATCCAAACAAGCGGCCGCTTACCGTGAGCTGTCATTGCTTCTTCGCCGTCCGCCGGGCCGTGAAGCATTCCC
TGGGGATGTATTCTATCTTCACTCCCGTCTGCTTGAGCGCGCAGCCAAGCTGAGTGACGCAAAAGGTGCAGG
ATCAATTACGGCGCTGCCGTTCGTCGAAACACAAGCAGGAGATATCTCCGCTTATATCCCGACAAACGTCAT
TTCCATTACTGACGGACAGATTTTCCTTCAATCTGACCTATTCTTCTCAGGCGTGCGTCCTGCGATAAATGC
CGGATTATCCGTTTCCCGTGTCGGCGGATCAGCCCAAATCAAAGCGATGAAAAAGGTAGCGGGAACATTGCG
TCTTGACCTGGCTTCATACCGTGAACTTGAAGCGTTCGCCCAATTCGATC
该菌株的分离方法为：
（1）土样采集：从土壤表层到15cm处取样200g，一个地点采几个样本，混合过粗筛，取25g作分离用；
（2）培养基平板制备：将NA培养基（营养琼脂培养基）和PDA（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）培养基融化，分别倒入灭菌培养皿，冷却，制成NA和PDA平板；
（3）称取1g土样于灭菌试管中，加100mL无菌水，振荡，制成10-2土壤悬浮液，静置5min，按10倍梯度稀释到10-7；
（4）取上述土壤悬浮液0.5mL，加到培养基平板上，用弯玻棒涂匀。置于培养箱26℃恒温培养5-7d；
（5）将单个菌落在NA培养基上划线，得到单菌落，转移至NA试管斜面培养基中，至26℃恒温培养；
（6）以黄瓜立枯病菌为靶标菌，采用平板对峙培养法，筛选到一株对黄瓜立枯病菌具有较强抑制活性的菌株，编号LLM-002。
所述NA培养基配方为蛋白胨10g、牛肉膏3g、NaCl5g、琼脂15g，蒸馏水1000mL；所述PDA培养基配方为马铃薯(去皮切块)300g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。
本发明解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）(LLM-002)CGMCC No.5043培养方法或繁殖方法：
普通培养采用NA培养基保存。实验室液体培养采用NYBD液体培养基。NYBD配方：牛肉浸膏8g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.3。大量发酵培养配方（重量百分含量）：豆粉1.8%，玉米粉1.6%，淀粉和碳酸钙各0.44%，鱼粉0.47%，硫酸镁0.01%，磷酸二氢钾0.03%，其余为水，pH7.5。培养条件：培养温度26℃，培养时间72h，通风1：0.8。采用此培养基发酵培养，发酵液菌数可达45亿个/ml。
另一方面，本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌(CGMCC No.5043)的发酵液，所述发酵液包含45亿个/ml或以上的解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.5043。
所述发酵液通过包括以下步骤的方法制得：
将解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.5043在NB液体培养基培养得到种子液，然后将所述种子液接种到大量发酵培养基中发酵培养。
其中所述NB液体培养基包含：以重量百分含量计，豆粉1.5%，玉米 粉1.6%，淀粉和碳酸钙各0.44%，硫酸铵0.1％，硫酸镁0.01％，磷酸二氢钾0.03%，其余为水，pH7.5。所述大量发酵培养基包含：以重量百分含量计，豆粉1.8%，玉米粉1.6%，淀粉和碳酸钙各0.44%，鱼粉0.47%，硫酸镁0.01%，磷酸二氢钾0.03%，其余为水，pH7.5。
具体而言，所述方法包括以下步骤：
（1）将解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.5043接种至NA培养基试管斜面中，在26℃-28℃下恒温培养2-3天；
（2）在无菌条件下，将培养好的解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.5043试管斜面菌种用无菌水稀释，吸取稀释菌液1mL，接种于高压蒸汽灭菌后的NB液体培养基中，装量200ml/500ml三角瓶，28℃下恒温摇床振荡培养1~2天，从而得到种子液；
（3）按0.5%的接种比例（体积比）将种子液接种到大量发酵培养基中，26℃—28℃下培养72小时，通风1：0.8。发酵完成后，发酵液菌数可达45亿个/g或以上。
并且，本发明还提供一种解淀粉芽孢杆菌的菌剂，所述菌剂包含上述解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.5043发酵液；上述解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.5043发酵液作为活性成分，使得该菌剂具有广谱杀菌活性。
优选地，所述菌剂还包含辅助基质，所述辅助基质选自微粉碳酸钙和膨润土中的一种或两种。
所述菌剂的制备方法包括将本发明提供的解淀粉芽孢杆菌CGMCCNo.5043的发酵液与辅助基质混合。根据发酵液的有效活菌数的数量与基质均匀混合，得到复合行业标准的微生物菌剂产品。
该微生物菌剂可以用作生物肥料以及生物农药，作为生物农药可以防治植物多种病害。并且解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.5043通过叶面施用能够防治作物、蔬菜、水果、林木等多种植物的根腐病、青霉病、霜霉病、疫病、立枯病、灰霉病、炭疽病等。直接施用于土壤或者拌种可以预防黄瓜、豆类和花生等由大丽轮枝孢Verticilium daliae、镰刀菌Fusarium spp、曲霉属Aspergillus spp、链格孢属Alternaria spp和丝核菌属Rhizoctonia spp所引起的根部和种子的真菌病害。解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）CGMCC No.5043还可以通过产生类似细胞分裂素、植物生长激素等物质，促进植物生长，抵抗病原菌的侵染。
因此，又一方面，本发明提供解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.5043或者 其发酵液或者本发明的菌剂在制备生物肥料或用于防治植物病害的生物农药中的用途。
本发明还提供一种用于防治植物病害的方法，所述方法包括向具有病害的植物施用解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.5043或者其发酵液或者根据本发明的菌剂。
针对上述用途和用于防治植物病害的方法，所述植物病害选自真菌病害，优选根腐病、青霉病、霜霉病、疫病、立枯病、灰霉病、炭疽病等真菌病害中的一种或多种，进一步优选立枯病。
本发明还提供一种用于促进植物生长的方法，所述方法包括向植物施用解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.5043或者其发酵液或者本发明的菌剂。
实验表明，本发明的解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.5043发酵液防治保护黄瓜立枯病效果显著，防治效果达到72.99%，且黄瓜生长健壮，无药害产生。同时具有安全高效，无药残，无毒副作用，能减少抗生素药物的使用，增强免疫力的优点，因而在生物防止病虫害中有重要应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）LLM-002（CGMCC No.5043）的分离与鉴定
1.分离：
本发明的解淀粉芽孢杆菌是从山东省寿光市蔬菜大棚采用土壤稀释分离法分离获得的，分离方法为：
（1）土样采集：从土壤表层到15cm处取样200g，一个地点采几个样本，混合过粗筛，取25g作分离用；
（2）培养基平板制备：将NA培养基（营养琼脂培养基）和PDA（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）培养基融化，分别倒入灭菌培养皿，冷却，制成NA和PDA平板；
（3）称取1g土样于灭菌试管中，加100mL无菌水，振荡，制成10-2土壤悬浮液，静置5min，按10倍梯度稀释到10-7；
（4）取上述土壤悬浮液0.5mL，加到培养基平板上，用弯玻棒涂匀。置于培养箱26℃恒温培养5-7d；
（5）将单个菌落在NA培养基上划线，得到单菌落，转移至NA试管斜面培养基中，至26℃恒温培养；
（6）以黄瓜立枯病菌为靶标菌，采用对峙培养法，筛选到一株对黄瓜立枯病菌具有较强抑制活性的菌株，编号LLM-002。
所述NA培养基配方为蛋白胨10g、牛肉膏3g、NaCl5g、琼脂15g，蒸馏水1000mL；所述PDA培养基配方为马铃薯(去皮切块)300g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。
2.菌株鉴定
（1）微生物学特性：菌体杆状，革兰氏阳性菌，周生鞭毛，兼性厌氧。NA培养基培养菌落圆形，白色，平展，表面粗糙，中间有圆环形突起，边缘整齐。液体培养形成菌膜，液体颜色棕黄色，浑浊，有沉淀。其它特性见下表1：
表1
（2）分子生物学特性：
16S rRNA基因序列测定结果如下：
CGGCGGCTGGCTCATAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGT
GTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGT
CGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCT
TTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCT
TCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCG
CTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCC
CCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTC
GAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTA
CTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCA
TCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTT
ACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAAT
TCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCAC
ATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATT
ACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCGCCCTATTTGAAC
GGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGT
CAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCA
GTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTA
ATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTCTGAACCATGCGGTTCAAACAAC
CATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCC
GTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTTGCATGTATTAGGC
atpA基因序列测定结果如下：
GTTGGCCGGTGAACTTGTTGAGTTTTCAAACGGCGTTTTGGGTATGGCTCAAAACCTTGAAGAATCCAACGT
AGGTATCGTTATCTTAGGACCTTACAGAGATATCCGTGAAGGTGATGAGGTCAAAAGAACGGGCCGCATCAT
GGAAGTTCCTGTAGGTGAAGAATTAATCGGACGTATCGTCAACCCGCTCGGACAGCCGGTAGACGGACTGGG
TCCGATTCTGACAAGCAAAACACGTCCGATCGAAAGCCAGGCTCCAGGCGTAATGGACCGTAAATCGGTACA
TGAGCCGCTGCAAACGGGTATCAAAGCGATCGACGCGTTAATTCCGATCGGCCGCGGACAGCGTGAGCTGAT
TATCGGTGACCGTCAGACAGGTAAAACATCTGTTGCGATTGATACAATCTTAAACCAAAAAGATCAAGACAT
GATCTGTGTGTACGTAGCGATCGGCCAGAAAGAATCTACAGTGCGCGGCGTAGTGGAAACACTTCGTAAGCA
TGGCGCGCTTGATTACACGATTGTCGTGACGGCGTCCGCTTCACAGCCGGCTCCGCTTCTGTACCTTGCACC
GTATGCAGGGGTGACAATGGGTGAAGAATTCATGTACAACGGCAAGCACGTTCTCGTCGTATATGATGATTT
ATCCAAACAAGCGGCCGCTTACCGTGAGCTGTCATTGCTTCTTCGCCGTCCGCCGGGCCGTGAAGCATTCCC
TGGGGATGTATTCTATCTTCACTCCCGTCTGCTTGAGCGCGCAGCCAAGCTGAGTGACGCAAAAGGTGCAGG
ATCAATTACGGCGCTGCCGTTCGTCGAAACACAAGCAGGAGATATCTCCGCTTATATCCCGACAAACGTCAT
TTCCATTACTGACGGACAGATTTTCCTTCAATCTGACCTATTCTTCTCAGGCGTGCGTCCTGCGATAAATGC
CGGATTATCCGTTTCCCGTGTCGGCGGATCAGCCCAAATCAAAGCGATGAAAAAGGTAGCGGGAACATTGCG
TCTTGACCTGGCTTCATACCGTGAACTTGAAGCGTTCGCCCAATTCGATC
此菌株已于2011年07月08日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏号为CGMCC No.5043。
实施例2解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.5043发酵液的制备
（1）将保存的解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.5043转移至NA培养基试管斜面中，置于培养箱26℃恒温培养2-3天。
（2）在无菌条件下，将培养好的解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.5043用无菌水稀释，吸取1mL，接种于高压蒸汽灭菌后的NB液体培养基（以重量百分含量计，豆粉1.5%，玉米粉1.6%，淀粉和碳酸钙各0.44%，硫酸铵0.1％，硫酸镁0.01％，磷酸二氢钾0.03％，其余为水，pH7.5。）中， 装量200ml/500ml三角瓶，28℃恒温摇床振荡培养1~2d得到种子液；
（3）按0.5%比例（体积比）将种子液接种到大量发酵培养基（以重量百分含量计，豆粉1.8%，玉米粉1.6%，淀粉和碳酸钙各0.44%，鱼粉0.47%，硫酸镁0.01％，磷酸二氢钾0.03%，其余为水，pH7.5）中，培养温度26℃，培养时间72小时，通风1：0.8。发酵完成后，发酵液菌数可达45亿个/g或以上。
实施例3解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.5043的作用验证
本实施例提供了解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.5043（以下简称为解淀粉芽孢杆菌LLM-002）发酵液针对黄瓜立枯病的相关实验。
1.1供试药剂
本发明实施例2制备的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）(LLM-002)CGMCC No.5043发酵液；96%恶霉灵可湿性粉剂（市售）。
1.2供试作物与防治对象：
供试作物为黄瓜，品种为密刺；
防治对象：立枯病
1.3试验地情况
试验地设在山东省寿光市蔬菜大棚，该大棚黄瓜立枯病近几年发生严重，且防治困难，试验在900平方米大棚内，土质为轻壤土，有机质含量为1.01%，pH值为7.7，所有试验小区栽培条件及管理措施一致，施药时黄瓜立枯病处于发病初期。
1.4试验设计及安排
本试验设计了解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）(LLM-002)CGMCC No.5043发酵液10倍，96%恶霉灵可湿性粉剂3000倍液及不施药清水作对照共3个处理，重复4次，共12个小区，各小区随机排列，小区面积为33.4平方米。于2011年7月12日、7月19日和26日各灌根一次，亩用药液500千克，喷药器械为工农-16型喷雾器，将喷头取下喷灌。
1.5试验调查及计算方法
1.5.1气象条件
第1次施药（7月12日）当日少云，风力3级，最高气温为32℃，最低气温为26℃，相对湿度为70%。第2次施药（7月19日），当日多云，风力4级，最高气温为31℃，最低气温为24℃，相对湿度为75%；第3次施 药（7月26日）当日晴，风力3级，最高气温为29℃，最低气温为25℃，相对湿度为85%。
1.5.2药效及安全性调查
药效调查：第1次施药后第7d和最后一次施药后14d进行调查。每小区采用4点取样法，每点查2株，调查全部叶片，调查发病率，记录病情级数并计算病情指数。
安全性调查：于第一次施药后7d和14d观察黄瓜的安全性，如有药害发生，详细描述药害症状并按药害程度分级标准确定药害程度。
分级方法（以叶片为单位）：
0级：健康苗
1级：茎基或根部稍现病斑或稍变色；
2级：1/3或1/2茎基或根部出现病斑或者变色腐烂；
3级：全茎或根部被病斑环绕、变色、腐烂；
4级：黄瓜苗萎蔫枯死；
1.5.3调查时间和次数
施药前调查病情基数，下次施药前及末次施药后10d调查防治结果。
1.5.4药效计算方法
药效按式（1）、（2）计算：
式中：CK0——空白对照区施药前病情指数；
CK1——空白对照区施药后病情指数；
PT0——药剂处理后施药前病情指数；
PT1——药剂处理后施药后病情指数；
1.5.5对作物的直接影响
观察药剂对作物有无药害，记录药害的类型和程度。此外，也要记录对作物的其他有益影响（例如促进成熟、刺激生长等）。
用下列方式记录药害：
（a）如果药害能被测量或计算，要用绝对值表示，例如株高、结实率。
（b）在其他情况下，可以按下列两种方法估计药害程度和频率：
（1）按照药害分级方法记录每小区的药害程度，以—、＋、＋＋、＋＋＋、＋＋＋＋表示。
药害分级方法：
—：无药害；
＋：轻度药害，不影响作物生长；
＋＋：中度药害，可复原，不会造成作物减产；
＋＋＋：中度药害，影响作物正常生长，对作产量和质量造成一定程度的损失；
＋＋＋＋：严重药害，作物生长受阻，产量和质量损失严重。
（2）将药剂处理区与空白对照区比较，评价其药害百分率。
同时，要准确描述作物的药害症状（矮化、褪绿、畸形等）
2.结果
2.1供试药剂对黄瓜立枯病的防治效果
表2结果显示，解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）(LLM-002)CGMCC No.5043发酵液及96%恶霉灵可湿性粉剂对黄瓜立枯病有较好的防治效果，一次用药7d防治效果均达到60%以上，其中解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）(LLM-002)CGMCC No.5043防治效果最好。
从黄瓜立枯病田间试验的病情指数来看（表2），一次用药7d，解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）(LLM-002)CGMCC No.5043防治效果为79.22%，明显高于96%恶霉灵可湿性粉剂的防治效果。
表2各处理防治黄瓜立枯病试验效果调查原始数据
注：表中数据后不同的小写字母表示经Duncan多重比较后差异显著（P<0.05），不同大写字母表示经Duncan多重比较后差异极显著（P<0.01）。
2.2黄瓜安全性调查：经施药7d和14d观察，各药剂处理区与对照区相比，黄瓜生长正常，无药害产生，说明解淀粉芽孢杆菌发酵液在供试浓度对黄瓜安全。
2.3解淀粉芽孢杆菌发酵液对黄瓜增产效果
表3解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）(LLM-002)CGMCC No.5043发酵液黄瓜试验结果分析表
注：小区面积33.4m2；处理1为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）(LLM-002)CGMCC No.5043发酵液，处理2为对照组药剂（96%恶霉灵可湿性粉剂）；表中数据后不同的小写字母表示经Duncan多重比较后差异显著（P<0.05）；不同大写字母表示经Duncan多重比较后差异极显著（P<0.01）。
由以上结果可知，在黄瓜上喷灌解淀粉芽孢杆菌发酵液（Bacillus amyloliquefaciens）(LLM-002)CGMCC No.5043，处理区比对照区每亩增产黄瓜1085.83公斤，增产率为16.71%；效果十分明显。在P<0.01水平上具有显著性差异，说明解淀粉芽孢杆菌发酵液的促生增产作用非常明显。
3.小结
3.1从病情指数和防治效果来看，解淀粉芽孢杆菌解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）(LLM-002)CGMCC No.5043对黄瓜立枯病具有较好的防治效果，在一次施药后7d可达79.22%，明显好于对照药剂，差异显著。
3.2从黄瓜增产效果看，解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）(LLM-002)CGMCC No.5043对黄瓜具有明显的促生增产效果，一次施药后增产率为16.71%。
Claims (10)
1.一种解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.5043。
2.一种解淀粉芽孢杆菌的发酵液，其特征在于，所述发酵液每毫升发包含45亿个/ml或以上的根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌CGMCCNo.5043；
所述发酵液通过包括以下步骤的方法制得：
将根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.5043在NB液体培养基培养得到种子液，然后将所述种子液接种到大量发酵培养基中发酵培养；其中所述NB液体培养基包含：以重量百分含量计，豆粉1.5%，玉米粉1.6％，淀粉和碳酸钙各0.44%，硫酸铵0.1％，硫酸镁0.01％，磷酸二氢钾0.03%，其余为水，pH7.5；所述大量发酵培养基包含：以重量百分含量计，豆粉1.8%，玉米粉1.6%，淀粉和碳酸钙各0.44%，鱼粉0.47%，硫酸镁0.01％，磷酸二氢钾0.03%，其余为水，pH7.5；
进一步优选地，所述发酵液通过包括以下步骤的方法制得：
（1）将根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.5043接种至NA培养基试管斜面中，在26℃-28℃下恒温培养2-3天；
（2）在无菌条件下，将培养好的解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.5043试管斜面菌种用无菌水稀释，吸取稀释菌液1mL，接种于高压蒸汽灭菌后的NB液体培养基中，装量200ml/500ml三角瓶，28℃下恒温摇床振荡培养1~2d，从而得到种子液；
（3）按0.5%的接种比例将种子液接种到大量发酵培养基中，26℃—28℃下培养72小时，通风1：0.8。
3.根据权利要求2所述的发酵液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
将根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.5043在NB液体培养基培养得到种子液，然后将所述种子液接种到大量发酵培养基中发酵培养；
其中所述NB液体培养基包含：以重量百分含量计，豆粉1.5%，玉米粉1.6%，淀粉和碳酸钙各0.44%，硫酸铵0.1％，硫酸镁0.01％，磷酸二氢钾0.03%，其余为水，pH7.5；所述大量发酵培养基包含：以重量百分含量计，豆粉1.8%，玉米粉1.6%，淀粉和碳酸钙各0.44%，鱼粉0.47%，硫酸镁0.01%，磷酸二氢钾0.03%，其余为水，pH7.5。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
（1）将根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.5043接种至NA培养基试管斜面中，在26℃-28℃下恒温培养2-3天；
（2）在无菌条件下，将培养好的解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.5043试管斜面菌种用无菌水稀释，吸取稀释菌液1mL，接种于高压蒸汽灭菌后的NB液体培养基中，装量200ml/500ml三角瓶，28℃下振荡培养1~2天，从而得到种子液；
（3）按0.5%的接种比例将种子液接种到大量发酵培养基中，26℃—28℃下培养72小时，通风1：0.8。
5.一种解淀粉芽孢杆菌的菌剂，其特征在于，所述菌剂包含根据权利要求2所述的发酵液；
优选地，所述菌剂还包含辅助基质，所述辅助基质选自微粉碳酸钙和膨润土中的一种或两种。
6.根据权利要求5所述的菌剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将根据权利要求2所述的发酵液与辅助基质混合的步骤。
7.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌或者根据权利要求2所述的发酵液或者根据权利要求5所述的菌剂在制备生物肥料和/或用于防治植物病害的生物农药中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述植物病害选自真菌病害；
优选地，所述植物病害选自根腐病、青霉病、霜霉病、疫病、立枯病、灰霉病和炭疽病中的一种或多种，优选立枯病。
9.一种用于防治植物病害的方法，其特征在于，所述方法包括向具有病害的植物施用根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌或者根据权利要求2所述的解淀粉芽孢杆菌发酵液或者根据权利要求4所述的解淀粉芽孢杆菌菌剂；
优选地，所述植物病害选自真菌病害，进一步优选根腐病、青霉病、霜霉病、疫病、立枯病、灰霉病和炭疽病中的一种或多种，更优选立枯病。
10.一种用于促进植物生长的方法，其特征在于，所述方法包括向植物施用根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌或者根据权利要求2所述的发酵液或者根据权利要求4所述的菌剂。
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