CN109517758A - 一株防治荔枝霜疫病的生防菌株ewn23及其应用 - Google Patents

一株防治荔枝霜疫病的生防菌株ewn23及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株防治荔枝霜疫病的生防菌株EWN23及其应用。一株防治荔枝霜疫病的生防菌株EWN23，于2016年11月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为GDMCC No.60111。生防菌株EWN23在防治荔枝霜疫霉病和荔枝保鲜中的应用。本发明得到的解淀粉芽孢杆菌来源于荔枝内生细菌，能很好地在荔枝果实表面定殖；将其用于荔枝病害的防治，仅仅表现为特定种群间某种微生物数量的增长或消减，并未改变荔枝上微生物种群的类别从而影响种群的稳定性，另外由于其与荔枝长期共存，互惠共生，形成了一系列与其相似的生存机制，将其喷施到荔枝表面用于病害的防治，对荔枝的食用及其加工产品来说更加安全可靠。

Description

一株防治荔枝霜疫病的生防菌株EWN23及其应用
技术领域
本发明属于植物保护技术领域，涉及一株防治荔枝霜疫病的生防菌株EWN23及其应用。
背景技术
荔枝(Litchi chinensis Sonn)是南方地区重要的亚热带经济作物，素有“中华之珍果”的美称，其经济价值高，是我国在国际市场上最具竞争力的果品之一。在荔枝采后常温或低温冷藏中，果实易变褐腐烂，而引发果实腐烂变质的主要病害有荔枝炭疽病、酸腐病、霜疫病等，其中以霜疫霉(Peronophythora litchii Chen ex Ko et al.)引起的霜疫病危害最严重(Kao et al., 1980；戚佩坤等，1984)。该菌喜高湿，可侵染嫩叶、花穗、幼果、枝条、果柄，导致落花落果；更喜侵染近成熟果实。运输过程只要有果实携带病菌便可全部发病，腐烂变质，带来较大经济损失(Xu et al.,2013；蔡永春，2008；梁改进等，2001；杨德东，2015)。湿度较高时，果实表面出现白霉，即孢子囊与孢囊梗(蔡学清，2010)。目前几大热区均有发生，但云南省发病率相对较低(张荣，2012)。目前，对荔枝霜疫病害控制的有效措施主要以化学防治为主，但是由于化学农药的大量使用可能诱发环境污染和病原物抗药性问题日显突出，因而研究和开发低毒、无残留的生物源农药用于荔枝病害的防治，对于控制农残量、确保食用安全性和提高产品国际竞争力具有十分重要的意义。
芽孢杆菌属(Bacillus)是一种广谱性的颉颃细菌，有多个芽孢杆菌亚群在植物病害生物防治中具有重要的地位。201510884654.X中公开了一种对植物病原真菌具有较宽的抑菌谱的解淀粉芽孢杆菌，能够有效抑制为立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、胶孢炭疽菌、拟盘多毛孢菌、美澳型核果褐腐病菌、富克葡萄孢盘菌、葡萄座腔菌、茄病镰孢菌、芸薹链格孢菌。201510054680.X 中公开了一株解淀粉芽孢杆菌能显著抑制羽衣草单囊壳菌、葡萄孢菌、尖孢镰刀菌和立枯丝核菌等病原菌的生长繁殖，有效防治草莓白粉病、黄瓜灰霉病等植物病害。201510653843.6中公开了一株解淀粉芽孢杆菌对尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、烟草疫霉菌、青枯雷尔氏菌具有强抑制作用，与绿色木霉H06配合具有良好协同颉颃病原菌作用。在荔枝霜疫病生防研究中，BS-2 (B.subtilis)、TB2(B.amyloliquefaciens)和TL2(B.subtilis)对荔枝采后病原菌抑制作用较好，同时延缓荔枝果皮褐变速度(蔡学清，2010)；Jiang等测定6种颉颃菌对荔枝霜疫霉抑制效果，结果表明以B.subtilis最佳(Jianget al，2001)。Korsten等(1993)从荔枝树上分离得3株生防细菌(B.stearothermophilus、B.megaterium和B.licheniformis)均能有效抑制Phomopsis sp.、Pestalotia sp.、Alternaria alternata、Penicillium sp.等荔枝采后病原菌；Shi等 (2010)发现从番木瓜上分离的内生细菌MGP1对荔枝霜疫霉也具有抑制作用；Xing等(2018) 报道用生防链霉菌BWL-H1对荔枝霜疫霉菌丝具100％抑制效果；多粘类芽孢杆菌CP7 (Paenibacilluspolymyxa)分泌的抗菌物质对荔枝霜疫霉等真菌具有很强抑杀作用(陈海英等， 2010)；从油梨(Persea americana)上分离B.subtilis对减少荔枝采后果实腐烂有效(Kors et al.,1993)。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供了一株防治荔枝霜疫病的生防菌株 EWN23。
本发明的另一目的是提供该菌株的应用。
本发明的又一目的是提供含有该菌株的菌剂及其制备方法。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一株防治荔枝霜疫病的生防菌株EWN23，为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，于2016年11月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为GDMCC No.60111。
本发明所述的保藏号为GDMCC No.60111的生防菌株EWN23在制备防治荔枝霜疫病的药物中的应用。
一种防治荔枝霜疫病的生防菌剂，以所述的保藏号为GDMCC No.60111的解淀粉芽孢杆菌EWN23为有效成分，其中所述的解淀粉芽孢杆菌EWN23的活菌浓度为1×108～109CFU/mL。
本发明所述的生防菌剂的制备方法，由解淀粉芽孢杆菌EWN23经液体发酵制备得到，具体包含以下步骤：将解淀粉芽孢杆菌EWN23接种至LB培养液中培养，即可获得所述的生防菌剂。
其中，所述LB培养液的pH值优选7.0-7.2。
所述的培养优选28～30℃，摇床震荡速率为180～200rpm下培养24h。
本发明所述的保藏号为GDMCC No.60111的生防菌株EWN23在防治荔枝霜疫病中的应用。
本发明所述的生防菌剂在防治荔枝霜疫病中的应用。
所述的生防菌剂在防治荔枝霜疫病时可在田间荔枝65-75％成熟喷雾使用，或者采后室温贮藏过程喷雾使用。
本发明所述的保藏号为GDMCC No.60111的生防菌株EWN23在荔枝保鲜中的应用。
本发明所述的生防菌剂在荔枝保鲜中的应用。
本发明的有益效果：
本发明得到的解淀粉芽孢杆菌分离自揭阳惠来某荔枝园“园糯”果皮的外生菌，能在荔枝果实表面定殖，在室内常温条件下喷雾预处理(LT,in the small greenhousetrial)能改善荔枝菌群多样性；将其用于荔枝病害防治，表现为特定种群间某种微生物数量的增长或消减，并未改变荔枝上微生物种群的类别从而影响种群的稳定性，另外由于其在荔枝果实表面分离获得，可预见其能与荔枝长期共存，互惠共生，形成一系列与其相似的生存机制，将其喷施到荔枝表面用于病害防治，对荔枝的食用及其加工产品来说安全可靠。
本发明的解淀粉芽孢杆菌对荔枝霜疫霉菌具有抑菌作用，还可产生纤维素水解酶，在田间 -室内(FLT,field plus lab trial)及LT中都表现优秀的生防和保鲜能力，具有优异的防治荔枝霜疫病的生防作用，而且本发明是专门针对荔枝霜疫病开发的生防制剂。由于是生物制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于荔枝的无公害生产，农民可以不用或减少其他化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且有利于水果的出口。同时，该菌剂不改变荔枝果实营养品质，可安全食用果实。
本发明得到的解淀粉芽孢杆菌，培养条件要求容易获得，商业化比较有潜力，具有很好的开发应用前景。
生物样品保藏信息
生防菌株EWN23，分类名为Bacillus amyloliquefaciens，于2016年11月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，地址为菌种保藏号为GDMCC No.60111。
附图说明
图1生防菌对荔枝霜疫病的防病/保鲜作用图。
注：对“淮枝”叶片(A)和果实的防效(B)(48hpi，2016)图；对“妃子笑”果实防效(48hpi，2017)(C)和保鲜效果(6dpt,2017)图(D)。左边均为EWN23，右边为对照。
具体实施方式
实施例1
菌株来源：EWN23由广东省揭阳市惠来某荔枝果园“园糯”果皮外分离得到。
2015年7月在广东省某荔枝林采集样品。采用五点采样法，每点间隔至少10m。每点三株健康植株的根围土收集。采集后的样品迅速装入写好编号的塑料袋中带回实验室进行分离。方法为，剪取果皮3g加入到27mL灭菌水中(含灭菌玻璃珠)，180rmp摇床振荡0.5h，静置5min，得到10-1稀释液，吸取上清液0.1mL依次稀释，分别取10-4、10-5、10-6三个梯度0.1mL涂LB平板，28℃培养48h，选取菌落数在50-300之间的平板，计数且挑取所有菌落，纯化，-70℃，40％甘油保存备用(Berg et al.,2000)。
平板颉颃活性测定采用对峙培养法，将保存于20℃中的霜疫霉菌接种到胡萝卜(CA) 平板上活化，待真菌长满平板后用灭菌的打孔器从菌落外边缘均匀的打成直径为5mm的圆形菌块。将菌丝块接种在1:1体积混合的CA-PDA培养基中心，在其四周距中心约27mm处接种一株细菌，四个重复。25℃培养5d，待对照菌丝长满平板后，记录抑菌带大小。
菌株水解酶和代谢产物活性测定蛋白酶(Yang et al.,2008)、几丁质酶(Robertsand Selitrennikoff，1988)，β-1,3-葡聚糖酶(Yang 2011)、纤维素酶(Ghose T.K 1987)、嗜铁素活性(Shin et al.,2001)、吲哚乙酸活性(Sawar and Kremer 1992)测定参考以上相关文献方法完成。
结果显示，该菌株可产生纤维素酶，对霜疫霉菌具有平板颉颃活性(表1)。
表1：菌株水解酶特性
细菌EWN23在培养平板上，菌落乳白色，圆形，中部龙骑，边缘整齐。菌体杆状。芽孢椭圆形，中生或近端生，孢囊不膨大。接触酶，V-P反应阳性；水解明胶，淀粉，但不水解酪氨酸；能利用柠檬酸盐，D-葡萄糖和D-木糖；生长温度范围5-50℃。
利用细菌基因组试剂盒(Shanghai SBS Genetech Co.Ltd)提取细菌基因DNA后进行 BOX-PCR扩增，用16Sr RNA通用引物U8-27(F)5’-AGA GTT TGA TC(AC)TGG CTC AG-3’；L1494-1514(R)5’-CTA CGG(AG)TA CCT TGT TAC GAC-3’从基因组DNA中扩增出16S rRNA基因片段，纯化后连接到pMD19-T载体，转化于Escherichia coli DH5α，提取阳性克隆质粒，委托TaKaRa公司测序，在NCBI(National Center for Biotechnology Information)进行比对，获得鉴定信息。
通过16S r DNA基因片段序列测序鉴定该细菌为Bacillus amyloliquefaciens(表2)。
表2：测序比对结果
实施例2菌剂制备
(1)种子菌液的培养：将EWN23(GDMCC No.60111)接种到LB培养液中，在28℃200rpm振荡培养24h培养，16h后在超净工作台中每隔3h取样测600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零，直到种子菌液OD值均在0.5～0.8之间时结束培养，获得种子菌液；
(2)湿菌制备：将种子菌液以1：500体积比发酵培养，28℃200rpm振荡培养24小时，获得生防菌剂，活菌浓度为1×108～109CFU/mL。
实施例3生防菌EWN23对荔枝果实/叶片的室内(LT,laboratory trial)防病效果评价
将田间采摘的健康果实/叶片进行如下处理：A.生防菌原液稀释成终浓度5*107CFU/mL 喷雾果实/稀释成终浓度1*107CFU/mL喷雾叶片；B.同等稀释倍数的LB溶液。每处理设3个重复，每个重复30个果实/5个枝条，果实/枝条放在保鲜盒(盒底铺上灭菌滤纸，直径18cm，灭菌水润湿，保鲜盒规格为323*220*100mm，厂家为佛山市禅城区华隆塑料厂)。菌液和对照组每个处理(3个重复)喷施300mL。24hpt(hours post treatment)喷雾接种病原菌P.litchii (5*104个孢子囊/mL)。36hpi(hours post inoculation)开始调查病情指数，计算生防效果。
病害调查方法(蔡学清，2010)：0级：无病症；1级：接种点有轻微病斑，坏死面积5％以下；3级：坏死面积5％-10％；5级：坏死面积10％-25％；7级：坏死面积25％-50％；9级：坏死面积超过50％或全部白霉(果实)或褐变(叶片)。病情指数和生防效果统计计算方法：病情指数(％)＝[∑(病级数×该病级果数)/(最高病级×总果数)]×100；生防效果(％)＝[(对照病情指数-处理组病情指数)/对照病情指数]×100。
本实验防效分析测定内容包括：LT2016-1，材料来自广州花都某果园的健康“淮枝”果实，成熟度约为85％，采摘到实验室进行EWN23喷雾处理24h后病原菌喷雾接种观察防效； LT2016-2，材料来自广州花都某果园的染病“淮枝”果实，成熟度约为85％，采摘到实验室进行EWN23喷雾处理24h后病原菌喷雾接种观察防效；LT2016-3A/3B，材料来自广州花都某果园的健康叶片“桂味”和“淮枝”，采到实验室进行EWN23喷雾处理24h后病原菌喷雾接种观察防效；LT2017-1，材料来自海南儋州某果园的健康“妃子笑”果实，成熟度约为80％，采摘到实验室进行EWN23喷雾处理24h后病原菌喷雾接种观察防效；LT2017-2，材料来自广州花都某果园的健康“妃子笑”果实，成熟度约为85％，采摘到实验室进行EWN23喷雾处理 24h后病原菌喷雾接种观察防效。
实验数据显示，EWN23在两年实验测试中，对荔枝果实均表现较好防效，在LT2016-1、 LT2017-1/2中平均防效分别为72.73％(图1B)、40.94％(图1C)和42.92％(表3)，和对照组相比，病情指数和对照组达到显著差异的时间点分别为4、4、5个(表3)。
表3生防菌EWN23对荔枝霜疫病(LDB)室内果实防效分析(LT 2016-1,LT2017-1,LT2017-2)
y LT(laboratory trial),室内实验；FLT(field plus lab trial),田间-室内实验；FT,(field trial)，田间试验；hpi(hours post inoculation)，接种病原菌后小时数.
x1生防菌发酵稀释液(5×107CFU/mL)喷雾预处理荔枝果实“淮枝”(85％成熟度，田间采摘到实验室保鲜盒)，室温培养(25℃).24hpt(hours post treatment)喷雾接种病原菌P.litchii(5×104孢子囊/mL)。
x2生防菌发酵稀释液(5×107CFU/mL)喷雾预处理荔枝果实“妃子笑”(80％成熟度,海南儋州)as fruit sprays(FS)室温培养(25℃)，24hpt(hours post treatment)喷雾接种病原菌P.litchii(5×104孢子囊/mL)。x3生防菌发酵稀释液(5×107CFU/mL)喷雾预处理荔枝果实(85％成熟度,广东广州)，室温培养(25℃)， 24hpt(hours post treatment)喷雾接种病原菌P.litchii(5×104孢子囊/mL)。
Z AE,average efficacy，表示平均防效。
数据为三次重复的平均值，数据后的英文字母表示处理间95％水平上的显著差异性(Duncan’test)。
在LT2016-2实验中，数据显示，EWN23对荔枝果实依然表现防效，平均防效为10.79％ (表4)，和对照组相比，病情指数和对照组达到显著差异的时间点分别为1个(表4)。
表4生防菌EWN23对自然侵染P.litchii的果实防效分析(naturally LDB,LT2016-2)
x自然条件下被病原菌P.litchii侵染荔枝果实，采摘到实验室后在12-24hpt果面发现白色霉层；生防菌液稀释液(5×107 CFU/mL)喷雾预处理果实“淮枝”(85％成熟度)。数据为三次重复的平均值，数据后的英文字母表示处理间95％水平上的显著差异性(Duncan’test)。
Z AE,表示平均防效。
在LT2016-3A/3B实验中，EWN23对荔枝叶片“桂味”和“淮枝”平均防效分别为18.41％和 39.91％(表5，图1A)，和对照组相比，病情指数和对照组达到显著差异的时间点分别为0 和2个(表5)。
表5菌株EWN23对荔枝叶片LDB的防效分析(LT2016-3)
x生防菌液稀释液(1×107 CFU/mL)喷雾预处理室内保鲜盒中荔枝叶片；24 hpt喷雾接种病原菌P.litchii(5×104孢子囊/mL). 数据为三次重复的平均值，数据后的英文字母表示处理间95％水平上的显著差异性(Duncan’test)。
Z AE,表示平均防效。
实施例4田间-室内(FLT)条件下生防菌对荔枝果实防效测定
实验设计为：2016年广州，生防菌喷雾预处理田间75％成熟度果实“糯米糍”3 d后采摘到实验室摆放到保鲜盒，24 h接种病原菌P.litchii。2017年，生防菌喷雾预处理田间65％成熟度果实“糯米糍”7 d后采摘到实验室摆放到保鲜盒，24 h接种病原菌P.litchii.每个处理3个重复，每重复30个果实。36 hpi开始观察病害严重度。
本实验测试实验内容为：FLT2016，材料来自广州花都某果园的健康“糯米糍”果实(成熟度约为75％)喷雾预处理果实，3 d后采摘(约85％成熟度)到实验室进行病原菌喷雾接种观察防效；FLT2017-1，材料来自海南儋州某果园的健康“妃子笑”果实(成熟度约65％)喷雾预处理果实，7 d后采摘(成熟度约85％)到实验室进行病原菌喷雾接种观察防效。
在FLT2016和FLT2017-1实验中，EWN23对荔枝果实平均防效分别为46.95％和71.69％ (表6)，和对照组相比，病情指数和对照组达到显著差异的时间点分别为2和2个(表6)。
表6菌株EWN23对荔枝果实LDB防效分析(FLT2016 and FLT-2017-1)
x1生防菌液稀释液(5×107 CFU/mL)喷雾预处理田间荔枝果实“糯米糍”(75％成熟度,广东广州)；3 dpt采摘荔枝果实到实验室放在保鲜盒(大约85％成熟度)；24h后喷雾接种病原菌P.litchii(5×104孢子囊/mL).
X2生防菌液稀释液(5×107CFU/mL)喷雾预处理田间荔枝果实“妃子笑”(65％成熟度,海南儋州)；7dpt,采摘荔枝果实到实验室放在保鲜盒(大约85％成熟度),24h后喷雾接种病原菌P.litchii(5×104孢子囊/mL).
Z AE,average efficacy，表示平均防效。数据为三次重复的平均值，数据后的英文字母表示处理间95％水平上的显著差异性 (Duncan’test)。
实施例5生防菌对荔枝果实的保鲜效果评价
将田间采摘的健康果实进行如下处理：A.生防菌原液稀释成终浓度5*107CFU/mL喷雾果实；B.同等稀释倍数的LB溶液。每处理设3个重复，每个重复30个果实，果实放在保鲜盒(盒底铺上灭菌滤纸，直径18cm，灭菌水润湿，保鲜盒规格为323*220*100mm，厂家为佛山市禅城区华隆塑料厂)。菌液和对照组每个处理(3个重复)喷施300mL。
果实采摘批次同实施案例3(LT2017-3/4)和实施案例4(FLT2017-2)，采摘到实验室进行相应处理，但不接种病原菌。观察果实褐变情况。褐变指数的测定参照蒋跃明等(2000)方法，褐变级数的确定：l级果：全红，3级果：果皮轻微褐变，5级果：5％≤果皮褐变面积＜25％， 7级果：25％≤果皮褐变面积＜50％，9级果：果皮褐变面积大于50％。褐变指数＝∑(褐变级数×果数)/(最高级×总果数)；保鲜效果(％)＝[(对照褐变指数-处理组褐变指数)/对照褐变指数]×100。
本实施案例测定以下三个内容：LT2017-3，材料来自海南儋州某果园的健康“妃子笑”果实(成熟度约为80％)，采摘到实验室进行保鲜效果观察；LT2017-4，材料来自广州花都某果园的健康“妃子笑”果实(成熟度约为85％)，采摘到实验室进行保鲜效果观察；FLT2017-2，材料来自海南儋州某果园的健康“妃子笑”果实(成熟度约为65％)喷雾预处理果实，7d后采摘(约成熟度85％)到实验室进行保鲜观察。
实验数据显示，EWN23在两年实验测试中，对荔枝果实均表现保鲜作用，在LT2017-3、 LT2017-4和FLT2017-2中平均防效分别为30.13％，60.63％和12.54％(表7)，和对照组相比，褐变指数和对照组达到显著差异的时间点分别为2，3，0个(表7)。
表7：菌株对荔枝果实保鲜效果分析(LT2017-3,LT2017-4,and FLT2017-2)
x1生防菌液稀释液(5×107CFU/mL)室内喷雾预处理荔枝果实“妃子笑”(约80％成熟度，海南儋州)；但不接种病原菌P. litchii.
x2生防菌液稀释液(5×107CFU/mL)室内喷雾预处理荔枝果实“妃子笑”(约85％成熟度，广东广州)；但不接种病原菌P. litchii.
X3生防菌液稀释液(5×107CFU/mL)田间预处理荔枝果实“妃子笑”(约65％成熟度，海南儋州)；7dpt,果实(约85％成熟度)采摘到实验室放在保鲜盒中,不接种病原菌P.litchii.
Z AE，表示平均防效.数据为三次重复的平均值，数据后的英文字母表示处理间95％水平上的显著差异性(Duncan’test)。
实施例6生防菌EWN23对果实品质效果分析
EWN23喷雾预处理田间荔枝果实(海南妃子笑和广州淮枝，65％成熟度)，18d采摘荔枝果实(约90％成熟度)到实验室，进行下列项目的检测：可溶性蛋白Pr(μg/g)、可溶性糖含量(μg/g)、游离氨基酸(mg/g)、维C(μg/g)。荔枝果实在各处理组中随机取样，每组三个重复，每个重复5个果实；依据和韩雅珊(1992)的方法测定。
分析数据表明，EWN23处理对儋州“妃子笑”果实品质表现分别为，游离氨基酸含量(11.63 mg/g)高于对照(5.46mg/g)，可溶性蛋白含量(25.43μg/g)高于对照(5.98μg/g)；维生素c含量含量(18.02μg/g)高于对照(16.35μg/g)(表8)。广州“淮枝”果实品质呈现相似规律，EWN23处理的果实其可溶性蛋白含量(15.83μg/g)高于对照(28.01μg/g)，维生素c 含量(9.99μg/g)高于对照(8.58μg/g)(表8)，但都和对照组无显著差异。可见EWN23 处理荔枝果实18d，对果实品质并无影响，说明EWN23喷雾预处理果实安全可靠。表8：生防菌EWN23对荔枝果实品质测定

Claims (10)

1.一株防治荔枝霜疫霉病的生防菌株EWN23，为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，于2016年11月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为GDMCC No.60111。
2.权利要求1所述的保藏号为GDMCC No.60111的生防菌株EWN23在制备防治荔枝霜疫霉病的药物中的应用。
3.一种防治荔枝霜疫霉病的生防菌剂，其特征在于：以所述的保藏号为GDMCCNo.60111的解淀粉芽孢杆菌EWN23为有效成分，其中所述的解淀粉芽孢杆菌EWN23的活菌浓度为1×108～109CFU/mL。
4.权利要求3所述的生防菌剂的制备方法，其特征在于：由解淀粉芽孢杆菌EWN23经液体发酵制备得到，具体包含以下步骤：将解淀粉芽孢杆菌EWN23接种至LB培养液中培养，即可获得所述的生防菌剂。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述LB培养液的pH值为7.0-7.2。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述的培养指在28～30℃，摇床震荡速率为180～200rpm下培养24h。
7.权利要求1所述的保藏号为GDMCC No.60111的生防菌株EWN23在防治荔枝霜疫霉病中的应用。
8.权利要求3所述的生防菌剂在防治荔枝霜疫霉病中的应用。
9.权利要求1所述的保藏号为GDMCC No.60111的生防菌株EWN23在荔枝保鲜中的应用。
10.权利要求3所述的生防菌剂在荔枝保鲜中的应用。
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