CN103695356A

CN103695356A - 一种解淀粉芽孢杆菌和微生物菌剂及其应用

Info

Publication number: CN103695356A
Application number: CN201310718332.9A
Authority: CN
Inventors: 黄亚丽; 马宏; 刘昆昂; 贾振华; 宋聪; 赵芊; 黄媛媛; 宋水山; 李书生
Original assignee: Institute of Biology of Hebei Academy of Sciences
Current assignee: Institute of Biology of Hebei Academy of Sciences
Priority date: 2013-12-24
Filing date: 2013-12-24
Publication date: 2014-04-02
Anticipated expiration: 2033-12-24
Also published as: CN103695356B

Abstract

本发明涉及用于防治花生叶斑病的拮抗菌及其微生物制剂，属于农作物病害生物防治领域。本发明提供了一株保藏号为CGMCCNo.8341的解淀粉芽孢杆菌BA-KA1(Bacillusamyloliquefaciens)，以及含有此解淀粉芽孢杆菌的微生物菌剂，还提供了所述解淀粉芽孢杆菌或微生物菌剂在防治花生叶斑病中的应用。本发明提供的保藏号为CGMCCNo.8341的解淀粉芽孢杆菌BA-KA1及其微生物菌剂对花生叶斑病菌有显著拮抗作用，能够防治花生叶斑病的发生，防治效率在70%以上。该菌株及其微生物制剂的使用，可以降低花生生产过程中化学农药的施用，具有良好的生态和社会效益。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌和微生物菌剂及其应用

技术领域

本发明涉及一种对花生叶斑病有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌BA-KA1菌株和能够防治花生叶斑病的微生物菌剂，属于生物技术领域。

背景技术

花生叶斑病是叶部黑斑病、褐斑病的总称，该病主要发生在叶片上，叶柄、托叶，茎也受其害，一般情况下先在下部叶片上开始发病，逐步向上部叶片蔓延，发病严重时在茎秆、叶柄、果针等部位均能形成病斑，叶片正面的叶斑周围有清晰地黄色晕轮，叶片黄褐色至暗褐色。

目前，农民对花生叶斑病的认识不足，认为花生生育后期的叶斑病基本不影响产量，所以很少防治。然而，花生叶斑病的发生会引起植株叶片坏死或落叶，从而导致花生生育后期光合作用不足，严重影响了花生的产量，发病严重时产量损失达30%以上，因此急需进行有效防治。一些化学杀菌剂如甲基托布津、多菌灵等具有一定的防治花生叶斑病的效果，但是这些农药长期使用，一方面会引起病原菌抗性，另一方面化学药剂的使用还会造成环境污染。

利用拮抗微生物防治农作物病害由于具有低污染、低残留、不引起病害抗性等优点，该防治方式的关键是进行对病原微生物有拮抗作用、且抑菌谱广的拮抗微生物的筛选和制备制剂。目前在花生叶斑病生物防治方面的研究还很少，本发明的目的在于筛选出一种能够高效拮抗花生叶斑病病原菌的微生物菌株，并形成微生物菌剂，通过生物防治的方式降低花生叶斑病给花生生产带来的危害。

发明内容

本发明的目的在于克服目前利用化学农药防治花生叶斑病带来的环境危害，提供一种能够高效拮抗花生叶斑病的解淀粉芽孢杆菌菌株及微生物制剂，该制剂喷施于花生叶片上，可以有效防治花生叶斑病，从而减少花生生产中化学农药的使用，降低环境污染，提高花生的产量。

本发明的技术方案如下：

本发明的解淀粉芽孢杆菌菌株BA-KA1于2013年10月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为CGMCCNo.8341。

本发明所述的解淀粉芽孢杆菌BA-KA1拮抗花生叶斑病病菌。

本发明所述的解淀粉芽孢杆菌BA-KA1对群结腐霉、小麦赤霉病菌、灰霉病菌、丝核菌、烟草赤星病菌、辣椒炭疽病菌、辣椒疫霉病菌、棉花枯萎病或番茄早疫病菌具有拮抗作用。

本发明的微生物菌剂含有解淀粉芽孢杆菌菌株BA-KA1，其中所述的解淀粉芽孢杆菌BA-KA1于2013年10月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为CGMCCNo.8341。

本发明的微生物菌剂在防治花生叶斑病中的应用。

本发明所述微生物菌剂中的总活菌数不低于5×10⁹个/g。

本发明微生物菌剂的制备方法包括以下步骤：

步骤一：按体积比5.0% 的比例将培养好的种子液接种到大量发酵培养基中， 28℃，培养36h，得到发酵液；

步骤二：将步骤一的发酵液与基质等量混合均匀并干燥，得到微生物菌剂。

本发明的微生物菌剂的制备方法步骤一中所述的大量发酵培养基包含葡萄糖2.5%（m/V）、蛋白胨0.8%（m/V）、酵母膏0.58%（m/V）、磷酸二氢钾0.35%（m/V）和碳酸钙0.25%（m/V），pH值7.2 。

本发明的微生物菌剂的制备方法步骤一所述种子液通过下述方法获得：将保存的解淀粉芽孢杆菌菌株BA-KA1划线转接到PB平板中，置于培养箱28℃恒温培养2天；将获得的解淀粉芽孢杆菌菌株BA-KA1 的菌苔接种到PB 液体培养基中，28℃摇床振荡培养18h 得到种子液。

本发明的微生物菌剂的制备方法步骤二中所述的基质选自微粉碳酸钙和/或沸石。

本发明通过大量筛选工作，筛选到了一株对花生叶斑病病菌有较强拮抗作用的拮抗菌BA-KA1，通过生理生化方法和16SrDNA方法将该菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。该菌株已于2013年10月15日进行保藏，保藏编号为CGMCC No.8341；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，邮编100101。

用上述能够拮抗花生叶斑病菌的BA-KA1菌株所生产的微生物制剂中含有5×10⁹个/g以上的解淀粉芽孢杆菌BA-KA1、相应培养基和助剂。其生产方法包括：

（1）将保存的解淀粉芽孢杆菌菌株BA-KA1划线转接到PB平板中，置于培养箱28℃恒温培养2天；

（2）将步骤（1）培养好的解淀粉芽孢杆菌菌株BA-KA1 的菌苔用接种环刮取接种到PB 液体培养基中，28℃摇床振荡培养18h 得到种子液；

（3）将步骤（2）培养好的种子液按5.0% 的比例（体积比）将种子液接种到大量发酵培养基中，配方为葡萄糖2.5%、蛋白胨0.8%、酵母膏0.58%、磷酸二氢钾0.35%、碳酸钙0.25%，pH值7.2，培养温度28℃，培养时间36h，发酵完成后得到发酵液；

（4）将步骤（3）将发酵液与基质（选自微粉碳酸钙、沸石中的一种或多种）等量混合均匀并干燥，得到微生物菌剂。

上述微生物菌剂可用于防治花生叶斑病。

3．有益效果

本发明涉及能防治花生叶斑病的拮抗微生物菌株及其微生物菌剂，该产品具有如下优点：

1）具有良好的防病作用：该菌剂中含有能够高效拮抗花生叶斑病菌生长的解淀粉芽孢杆菌BA-KA1，菌剂中该菌株的达到5×10⁹个/g以上，该菌株喷洒于花生叶片上能够有效抑制花生叶斑病的发生。

2）具有良好的促生作用：该菌剂施用后能够有效抑制花生叶斑病的发生，增加花生的光合面积，从而促进花生营养生产和生殖生长，提高花生产量。

3）无毒无污染无残留：该微生物菌剂是由解淀粉芽孢杆菌、部分培养基和基质（选自微粉碳酸钙、沸石中的一种或多种）组成，无任何有毒有害成份，在花生生产中使用具有无毒、无污染、无残留的优点，符合我国生产绿色食品的要求。

生物样品保藏信息

解淀粉芽孢杆菌BA-KA1，分类命名为Bacillus amyloliquefaciens，已于2013年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，菌种保藏号为CGMCC No. 8341。

附图说明

图1显示了花生叶斑病的发病症状。

图2显示了花生叶斑病的病原菌菌落形态。

图3显示了本发明筛选的保藏号为CGMCC No.8341的解淀粉芽孢杆菌菌株在固体PB培养基上培养48小时的菌落形态。

图4显示了本发明筛选的保藏号为CGMCC No.8341的解淀粉芽孢杆菌的菌体形态照片。

具体实施方式

本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌BA-KA1，其中该解淀粉芽孢杆菌的保藏号为CGMCC No.8341。

本发明还提供了一种能够防治花生叶斑病的微生物制剂，其中该制剂以解淀粉芽孢杆菌作为活性成分，以PB培养基和基质（选自微粉碳酸钙、沸石中的一种或多种）为载体，其中，该解淀粉芽孢杆菌的保藏号为CGMCC No. 8341，该制剂中解淀粉芽孢杆菌BA-KA1的活菌数达到 5×10⁹个/g。

以下结合优选实施例对本发明的技术方案进行详细地阐述。以下实施例仅仅用于说明和解释本发明，而不构成对本发明技术方案的限制。

实施例1 对花生叶斑病菌具有拮抗作用的细菌的分离、筛选

采集不同生态环境的土壤样品并于实验室中进行细菌分离，在PB培养基上进行多次分离纯化，得到纯培养菌落后，以花生叶斑病球座尾孢菌为指示菌（如图2所示），采用对峙试验方法进行拮抗性能高的菌株的筛选。

具体步骤：上述土壤样品经梯度稀释后涂布于PB培养基中，于28℃恒温培养箱培养。上述培养基根据“微生物培养基手册”的记载制备得到，培养基配方为：牛肉膏5g ，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g，自来水1000ml，pH7.2~7.4，121℃灭菌20min后使用。待平板长出菌落后，挑取不同形态的单菌落采用划线分离法反复进行分离纯化，直到得到单菌落的纯培养物，纯化后的菌株保存于PB培养基斜面。

以花生叶斑病球座尾孢菌为指示菌，采用十字交叉法测定不同菌株对花生叶斑病球座尾孢菌生长的抑制率。将筛选出的细菌菌株点接在距平板中央3cm 处的4个角上，平板中央同时接种直径5mm的活化的花生叶斑病球座尾孢菌菌块，每个菌株重复三次，以只接种花生叶斑病菌菌块的为对照，28℃恒温培养5d，测量、记录抑菌圈直径的大小并计算平均抑制率。筛选出了对花生叶斑病菌拮抗作用最强的菌株，该菌株的编号为BA-KA1，并对该菌株进行了保藏，保藏号为CGMCC No.8341。

实施例2 BA-KA1的抑菌谱测定

以群结腐霉、小麦赤霉病菌、灰霉病菌、丝核菌、烟草赤星病菌、辣椒炭疽病菌、辣椒疫霉病菌、棉花枯萎病、番茄早疫病菌等9种病原菌为靶标，测定BA-KA1的抑菌谱，BA-KA1对9种病原真菌都具有较强的拮抗作用，对所有的病原菌的拮抗作用都在40%以上，其中对番茄早疫病菌的抑制作用最强，为74.3%。

表1 解淀粉芽孢杆菌BA-KA1对不同病原真菌的抑制作用

实施例3 拮抗菌株的鉴定

根据《常见细菌系统鉴定手册》中记载的实验内容和实验方法，对筛得的保藏号为：CGMCC No.8341进行鉴定，菌落形态观测在PB培养基上进行，将菌株划线接种后，于28℃恒温培养36小时观察菌落形态。保藏号为CGMCC No.8341的菌株的菌落近圆形、颜色为乳白色、表面较为干燥皱褶、无光泽不透明、边缘啮蚀状、中间凹陷、易挑取、菌落正反面或边缘与中央部位的颜色一致（如图3所示）。

挑取培养24小时菌落革兰氏染色后，在光学显微镜的100倍油镜下观察，如图4所示，在显微镜下可以看到，保藏号为CGMCC No.8341的菌株为长杆菌、产芽孢、革兰氏阳性菌、芽孢位置中生、芽孢膨大。初步确定为芽孢杆菌。

16SrDNA鉴定：将保藏号为CGMCC No.8341的菌株接种到PB培养基，28℃摇床培养24 h，采用天根生化科技（北京）有限公司基因组DNA提取试剂盒提取该菌株的基因组DNA，然后以提取的总DNA 作为模板，以27f（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3′）和1492r(5′- TACGGCTACCTTGTTACGAC TT -3 ′)引物对进行PCR扩增。PCR反应体系为25 μl，反应体系为：基因组DNA 1μL，10×PCR buffer 2.5μL，27f引物0.5μL，1492r引物0.5μL，dNTPs 2μL，Taq 酶(5U/μL) 0.25μL，ddH₂O 18.25μL。反应条件为：94℃ 预变性5 min；94℃变性30s，50℃退火1min，72℃ 延伸2min，循环30次；72℃ 10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，将PCR条带大小约为1500bp的PCR产物送上海生工生物技术有限公司测序后，将获得的DNA序列（见Seq1），输入GenBank，用Blast程序与数据库中的所有序列进行比较分析。利用MEGA4.1进行系统发育树的构建。经过序列分析显示，保藏号为CGMCC No.8341的菌株属于解淀粉芽孢杆菌。

实施例4 微生物菌剂的制备

将保存的解淀粉芽孢杆菌菌株BA-KA1划线转接到PB平板中，置于培养箱28℃恒温培养2天；将培养好的解淀粉芽孢杆菌菌株BA-KA1 的菌苔用接种环刮取接种到PB 液体培养基中，28℃摇床振荡培养18h 得到种子液；按5.0% 的比例（体积比）将种子液接种到大量发酵培养基中，配方为葡萄糖2.5%、蛋白胨0.8%、酵母膏0.58%、磷酸二氢钾0.35%、碳酸钙0.25%，pH值7.2，培养温度28℃，培养时间36h，发酵完成后得到发酵液，发酵液菌数可达50亿/ml。将发酵液与基质（选自微粉碳酸钙、膨润土、沸石中的一种或多种）等量混合均匀并干燥，经干燥后菌数可达5×10⁹个/g以上。

实施例5 解淀粉芽孢杆菌BA-KA2菌剂的田间应用

在河北省灵寿县花生地花生田中进行该微生物菌剂的田间试验（如图1所示），将微生物菌剂稀释成250倍、500倍、750倍、1000倍、1500倍进行花生的叶面喷施，以喷施清水的为空白对照，每个处理设3次重复，在花生开花期开始喷施，连续喷施3次，次与次之间的间隔为15天，最后一次喷药之后10天统计花生叶斑病的发病情况。

调查方法：

每处理采4株，每株调查主茎全部叶片，记录每个处理花生总叶数、各级病叶数，并根据病叶分级计算病情指数和防治效果。

病叶分级标准：

0级：花生叶片完好，无被害病斑；1级：花生叶片上有病斑，病斑面积占整个叶片面积的5%以下；3级：花生叶片上有病斑，病斑面积占整个叶片面积6%-25%；5级：花生叶片上有病斑，病斑面积占整个叶片面积26%-50%；7级：花生叶片上有病斑，病斑面积占整个叶片面积的51%-75%；9级：病斑面积占整个叶片面积的76%。

防效计算方法：

病情指数=∑（各级病叶数×相对级数值）/（总叶数×最高级值）×100

防治效果（%）=（对照区病情指数—处理区病情指数）/对照区病情指数 ×100

防治效果如表2所示，在河北省灵寿县的花生叶斑病田间防病试验表明，稀释250倍、500倍、750倍、1000倍、1500倍都对花生叶斑病有良好的防治效果，其中1500倍防治效果较其他喷施倍数有所降低，稀释250倍的防效与稀释500倍、750倍、1000倍的防效差异不大，综合考虑施用成本和防治效果，确定最优的稀释倍数为500倍—1000倍，在此稀释范围内该微生物菌剂对花生叶斑病的防治效果在70%以上。

表2 不同喷施浓度对花生叶斑病的防治效果

由上述结果可以看出，本发明筛选出的保藏号为CGMCC No.8341的菌株对花生叶斑病菌有良好的拮抗作用，其微生物菌剂能够有效防治花生田间叶斑病的发生。

该菌剂用水稀释500-1000倍后在花生叶部喷施，以喷施清水的为对照。结果显示，使用该微生物菌剂可降低花生叶斑病发病率、降低病情指数，防病效果在70%以上。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北省科学院生物研究所

<120> 一种解淀粉芽孢杆菌和微生物菌剂及其应用

<130> 2013

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1401

<212> DNA

<213> Bacillus amyloliquefaciens

<400> 1

taaaaggtta cctcaccgac ttcgggtgtt acaaactctc gtggtgtgac gggcggtgtg 60

tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc atgctgatcc gcgattacta gcgattccag 120

cttcacgcag tcgagttgca gactgcgatc cgaactgaga acagatttgt gggattggct 180

taacctcgcg gtttcgctgc cctttgttct gtccattgta gcacgtgtgt agcccaggtc 240

ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc caccttcctc cggtttgtca ccggcagtca 300

ccttagagtg cccaactgaa tgctggcaac taagatcaag ggttgcgctc gttgcgggac 360

ttaacccaac atctcacgac acgagctgac gacaaccatg caccacctgt cactctgccc 420

ccgaagggga cgtcctatct ctaggattgt cagaggatgt caagacctgg taaggttctt 480

cgcgttgctt cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg cgggcccccg tcaattcctt 540

tgagtttcag tcttgcgacc gtactcccca ggcggagtgc ttaatgcgtt agctgcagca 600

ctaaggggcg gaaaccccct aacacttagc actcatcgtt tacggcgtgg actaccaggg 660

tatctaatcc tgttcgctcc ccacgctttc gctcctcagc gtcagttaca gaccagagag 720

tcgccttcgc cactggtgtt cctccacatc tctacgcatt tcaccgctac acgtggaatt 780

ccactctcct cttctgcact caagttcccc agtttccaat gaccctcccc ggttgagccg 840

ggggctttca catcagactt aagaaaccgc ctgcgagccc tttacgccca ataattccgg 900

acaacgcttg ccacctacgt attaccgcgg ctgctggcac gtagttagcc gtggctttct 960

ggttaggtac cgtcaaggtg ccgccctatt tgaacggcac ttgttcttcc ctaacaacag 1020

agctttacga tccgaaaacc ttcatcactc acgcggcgtt gctccgtcag actttcgtcc 1080

attgcggaag attccctact gctgcctccc gtaggagtct gggccgtgtc tcagtcccag 1140

tgtggccgat caccctctca ggtcggctac gcatcgtcgc cttggtgagc cgttacctca 1200

ccaactagct aatgcgccgc gggtccatct gtaagtggta gccgaagcca ccttttatgt 1260

ctgaaccatg cggttcaaac aaccatccgg tattagcccc ggtttcccgg agttatccca 1320

gtcttacagg caggttaccc acgtgttact cacccgtccg ccgctaacat cagggagcaa 1380

gctcccatct gtccgctcga c 1401

Claims

1.一种解淀粉芽孢杆菌菌株BA-KA1，该解淀粉芽孢杆菌于2013年10月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为CGMCCNo.8341。

2.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌BA-KA1，其特征在于其拮抗花生叶斑病病原菌。

3.根据权利要求2所述的解淀粉芽孢杆菌BA-KA1，其特征在于其对群结腐霉、小麦赤霉病菌、灰霉病菌、丝核菌、烟草赤星病菌、辣椒炭疽病菌、辣椒疫霉病菌、棉花枯萎病和番茄早疫病菌具有拮抗作用。

4.一种微生物菌剂，其特征在于其含有权利要求1 所述的解淀粉芽孢杆菌菌株BA-KA1，其中所述的解淀粉芽孢杆菌BA-KA1于2013年10月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为CGMCCNo.8341。

5.根据权利要求4所述的微生物菌剂，其特征在于其在防治花生叶斑病中的应用。

6.根据权利要求5所述的微生物菌剂，其特征在于所述微生物菌剂中的总活菌数不低于5×10⁹个/g。

7.一种根据权利要求4 所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于其包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于步骤一所述种子液通过下述方法获得：将保存的解淀粉芽孢杆菌菌株BA-KA1划线转接到PB平板中，置于培养箱28℃恒温培养2天；将获得的解淀粉芽孢杆菌菌株BA-KA1 的菌苔接种到PB 液体培养基中，28℃摇床振荡培养18h 得到种子液。

9.根据权利要求7所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于步骤一中所述的大量发酵培养基包含葡萄糖2.5%（m/V）、蛋白胨0.8%（m/V）、酵母膏0.58%（m/V）、磷酸二氢钾0.35%（m/V）和碳酸钙0.25%（m/V），pH值7.2 。

10.根据权利7所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于步骤二中所述的基质选自微粉碳酸钙和/或沸石。