CN102485880B - 一株解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌及其应用。该解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)YB-3，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC №.4318。本发明菌株能够产生一种仅存在于细胞内、不扩散到发酵液的抗菌物质，本身具有广谱的抑菌范围和高效、稳定的抑菌效果，可以发展成未来集各项功能于一身的微生物生防制剂。
Description
技术领域
本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌及其应用，尤其涉及一株新筛选的解淀粉芽孢杆菌YB-3(保藏号：CGMCC NO.4318)，以及该菌株在防治能够引起植物病害的病原真菌方面的应用。
背景技术
在农业生产中，每年因病虫害造成巨大的损失。化学农药具有防治效果高，速度快，杀虫杀菌谱广，成本低和使用简便等优点，因此在农业病虫害的防治上一直居于主导地位，但是化学农药的过量施用对人类健康、环境污染和生态平衡构成了极大的威胁。
近年来，随着人们对无污染、纯天然绿色食品需求的提高，各发达国家均陆续制定了禁用化学农药的发展规划。生物农药因具有高效低毒、安全以及对生态环境相容等优点，近年来在植物真菌病害防治领域有着广泛地应用。
在微生物源的生物农药中芽孢杆菌(Bacillus)是植物病害生物防治研究中的重要微生物之一，其种类多分布广，是土壤和植物微生态的优势种群。该类微生物通过分泌抗生物质和生长竞争，在防治植物病害方面发挥多种有益作用，大量研究发现一些芽孢杆菌可以产生对植物病原真菌有抑菌活性的抗菌物质。
目前已报道具有生防活性的解淀粉芽孢杆菌合成的抗菌物质为胞外物质，浓度低且不适宜提取，而且目前分离的解淀粉芽孢杆菌在生防对象单一且生防效果一般。
发明内容
本发明的目的是提供一株具有广谱杀菌活性的解淀粉芽孢杆菌。
本发明提供的解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)YB-3，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC №.4318。
解淀粉芽孢杆菌YB-3在LB培养基上呈白色不透明菌落，表面粗糙，边缘不规则；菌体呈短杆状，具有运动性，兼性厌氧菌，可形成内生芽孢，革兰氏染色阳性。该菌株在20-40℃均可以在LB培养基、NA培养基等培养基上繁殖生长。
本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌YB-3分离自花园土壤，已于2010年11月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC №.4318。
解淀粉芽孢杆菌YB-3在抑制病原真菌中的应用也属于本发明的保护范围。
所述病原真菌为水稻纹枯病菌、辣椒疫霉菌、黄瓜炭疽菌、棉花枯萎菌、棉花黄萎菌、小麦赤霉菌、番茄灰霉菌、黄瓜灰霉菌、西葫芦菌核菌、稻瘟菌、稻曲菌、大豆根腐菌、大豆炭疽菌或莴苣菌核菌；优选为水稻纹枯病菌、辣椒疫霉菌、黄瓜炭疽菌、大豆炭疽菌、对黄瓜灰霉菌、大豆根腐菌或棉花黄萎菌。
其中，水稻纹枯病菌可以为水稻纹枯病菌ACCC 36441、辣椒疫霉可以为辣椒疫霉ACCC36278、棉花枯萎菌可以为棉花枯萎菌ACCC 36879、小麦赤霉菌可以为小麦赤霉菌ACCC 31059、番茄灰霉菌可以为番茄灰霉菌ACCC30387、西葫芦菌核菌可以为西葫芦菌核菌ACCC 36084、稻曲菌可以为稻曲菌ACCC36443、大豆根腐菌可以为大豆根腐菌ACCC36242、大豆炭疽菌可以为大豆炭疽菌ACCC36201、莴苣菌核菌可以为莴苣菌核菌ACCC36081、黄瓜炭疽菌可以为黄瓜炭疽菌ACCC36065、黄瓜灰霉菌可以为黄瓜灰霉菌ACCC 36448、稻瘟菌可以为稻瘟菌ACCC 37632、棉花黄萎菌可以为棉花黄萎菌ACCC30309。
本发明的解淀粉芽孢杆菌YB-3对多种植物病原真菌都具有强烈抗性。此菌株能够产生一种仅存在于细胞内、不扩散到发酵液的抗菌物质，有利于抗性物质的提取。此外，此菌株具有稳定、高效、广谱的植物病原菌抗性，因此有望广泛应用于农业生产中病害的防治。本发明的解淀粉芽孢杆菌YB-3为环境中常见细菌菌株，可以进一步制成微生物生防菌剂，从而显现出它固有廉价原材料的特性，能够更适应工业大规模生产；本发明的解淀粉芽孢杆菌YB-3为可安全释放的菌株，故不会给环境带来负面效应的影响。
本发明菌株能够合成抗菌物质，仅存在于胞内，且抑菌范围和高效、稳定的抑菌效果，可以发展成未来集各项功能于一身的微生物生防制剂。
附图说明
图1为基于16S rDNA部分序列构建的系统发育树；
图2为解淀粉芽孢杆菌YB-3对常见植物病原真菌的抑制效果
具体实施方式
实施例1、本发明解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)YB-3的的获得及鉴定
1、样品采集
从中国农业科学院院内花园采集土壤样品。
2、菌株的分离和抗性筛选
(1)菌种稀释：将所取的样品混合均匀，称取1g溶解到装有10ml蒸馏水的三角瓶中，用力振荡使其成10-1土壤悬浮液，然后用1ml移液枪吸取该悬浮液1ml至装有9ml蒸馏水的试管中，充分摇匀制成10-2的土壤悬浮液，依次稀释至10-8；
(2)培养基制备：将配制好的NA培养基和PDA培养基灭菌，倾倒至无菌的培养皿中冷却，其中NA培养基成分为蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCL5g，琼脂粉18g，蒸馏水1000ml，PH7.0；PDA培养基成分为葡萄糖20g，去皮马铃薯200g，琼脂粉18g，蒸馏水1000ml，PH7.0；
(3)菌种分离与筛选：吸取上述10-9土壤悬浮液0.1ml及液体培养3天的水稻纹枯病菌0.1ml至冷却好的PDA培养基中，均匀涂布，放置25℃培养箱中倒置培养4d，观察并挑选拮抗菌落(抑制圈大的菌落)；
(4)拮抗菌株纯化：将所挑选菌落在PAD培养基上进行划线纯化，再将得到的纯菌株与水稻纹枯病菌进行拮抗验证，得到一株对水稻纹枯病菌拮抗能力的较强的细菌菌株，命名为YB-3。
3、菌株的鉴定
对菌株YB-3CGMCC No.4318进行形态学、生理生化鉴定及系统发育分析。
菌株YB-3在LB培养基上呈白色不透明菌落，表面粗糙，边缘不规则；菌体呈短杆状，具有运动性，兼性厌氧菌，可形成内生芽孢，革兰氏染色阳性。
采用美国BIOLOG公司推出的BIOLOG细菌自动鉴定系统对菌株YB-3CGMCC No.4318进行生理生化测定。菌株YB-3在BUGM(BIOLOG公司)+1％葡萄糖上划线30℃培养16小时，用无菌棉签擦下菌苔于生理盐水中，制成菌悬液，用浊度计调整至适当浊度28％T，用8孔移液器将菌悬液分加在Bilog GP鉴定板的各孔中，每孔150微升，共96孔；置于30℃培养箱内培养24小时，置于阅读器上读取结果，自动检索数据库。Biolog系统系统自动给出的鉴定结果为Bacillus amyloliquefaciens，与系统数据库比较结果的可能性(Probability)为97、相似性(Similarity)为0.91、位距(Distance)为0.90。因此，此鉴定结果可信度较高，菌株YB-3应为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。
表1菌株YB-3的Biolog系统鉴定结果
收集指数生长期菌体，用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，以其为模板扩增16S rDNA基因片段。PCR扩增体系为25μL，其中含有12.5μL PCR 2×mix(TianGen)、正反向引物(10μmol/L)各1μL、模板DNA 1μL、双蒸灭菌水9.5μL。扩增程序为：95℃预变性3min；94℃变性1min，55℃复性1min，72℃延伸1.5min，共30个循环；72℃延伸10min，用于扩增16S rDNA的引物为通用引物，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后用胶回收试剂盒回收。回收得到的PCR扩增产物交由上海生工生物技术有限公司测序，测序得到解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)YB-3CGMCC No.4318的16s rDNA部分序列(序列表中序列1所示)，共有1459bp，经eztaxon网站(http://147.47.212.35：8080/index.jsp)比对分析，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)YB-3 CGMCC No.4318与BacOillus tequilensis(EU138487)的Pairwise Similarity值达到99.486％，与Bacillus amyloliquefacienssubsp.plantarum(CP000560)的Pairwise Similarity值达到98.424％。用MEGA 4.0软件进行多序列同源性分析，并构建系统发育树(图1)。YB-3与Bacillusamyloliquefaciens很好地聚在一个分支。图1中分枝上的数值为自举500次的结果。
根据对菌株YB-3的形态学、培养特征、生理生化和16S rDNA的研究结果，菌株YB-3鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。解淀粉芽孢杆菌YB-3，已于2010年11月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC №.4318。
实施例2、解淀粉芽孢杆菌YB-3抑菌谱测定
选择常见农业生产中的植物病害病原菌水稻纹枯病菌ACCC 36441、辣椒疫霉ACCC36278、棉花枯萎菌ACCC 36879、小麦赤霉菌ACCC 31059、番茄灰霉菌ACCC30387、西葫芦菌核菌ACCC 36084、稻曲菌ACCC36443、大豆根腐菌ACCC36242、大豆炭疽菌ACCC36201、莴苣菌核菌ACCC36081、黄瓜炭疽菌ACCC36065、黄瓜灰霉菌ACCC 36448、稻瘟菌ACCC 37632、棉花黄萎菌ACCC30309(以上菌株均来自中国农业微生物菌种保藏管理中心)作为指示菌，采用菌丝生长速率法，测定其抑菌效果。具体方法如下：在无菌条件下，将0.05ml的解淀粉芽孢杆菌YB-3培养液(NB培养基37℃培养至OD6600.7，NB培养基成分为蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCL5g，蒸馏水1000ml，PH7.0)放入培养皿(Φ＝90mm)后，迅速倒入经灭菌后冷却至45℃左右的PDA培养基，混合均匀，对照组加入等量的蒸馏水，放置待其凝固后，分别接入事先已培养5d的上述菌株菌落边缘处直径为5mm的菌碟置于含菌的PDA培养基平板中央，恒温(25±1)℃黑暗培养，直至对照的菌落直径长满平板为止，每处理重复3次。用下列公式计算菌丝生长抑制率：
菌落扩展直径(mm)＝测量菌落直径平均值(mm)-5mm(即菌饼直径)
相对抑制率(％)＝(对照菌落扩展直径-处理菌落扩展直径)/对照菌落扩展直径×100％
结果表明(图2)解淀粉芽孢杆菌YB-3不仅对水稻纹枯病菌产生很强的抑制作用，而且还对其他植物病原真菌都具有相对较强的抑制作用，因此表明此拮抗菌的生物活性具有广谱、高效的特点。
尤其对水稻纹枯病菌、辣椒疫霉菌抑制率达90％以上，对黄瓜炭疽菌、大豆炭疽菌抑制率达80％以上，对黄瓜灰霉菌、大豆根腐菌、棉花黄萎菌抑制率也达到70％以上。
实施例3、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)YB-3抑菌物质分布检测
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)YB-3在转速180rpm、37℃培养16小时(培养基组成：牛肉膏5g，蛋白胨8g，MgSO41.4g，CaCO30.8g，NaCL5g，蒸馏水1000ml，pH6.8，1000ml蒸馏水)，之后用0.22μm无菌过滤器对培养液进行过滤，收集滤液和菌体。
在无菌操作下将水稻纹枯病菌、辣椒疫霉培养液(PD培养基，150rpm，25℃培养4d)液涂布与PDA平板上，然后用无菌打孔器(6mm)在平板上打取若干孔，分别将收集好的菌体(一菌环)和滤液(50微升)滴加到孔中，放置25℃培养箱培养7d。
结果表明解淀粉芽孢杆菌YB-3发酵液中没有拮抗活性成分(没有产生抑菌圈)，而已报道的解淀粉芽孢杆菌的发酵液中均有拮抗活性，因此解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YB-3合成的抑菌物质仅存在于胞内，可能是一种新的具有拮抗活性活性的物质。此外活性物质的不扩散性可低今后活性物质的浓缩成本，有利于商业化的进行。
表1筛选菌株产生胞外分泌抑制物的检测
| 菌株 | 发酵滤液(抑菌圈直径) | 菌体(抑菌圈直径) |
| 辣椒疫霉 | 0cm | 3.7cm |
| 水稻纹枯病菌 | 0cm | 3.5cm |
实施例4本发明菌株抑制活性的遗传稳定性
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)YB-3置于-70℃冰箱保存，在NA培养基上于37℃经划线传代15次后，然后接种到NB培养基中37℃培养至OD6600.7进行抑制活性检测(方法同实施例2)，结果表明(表2)菌株YB-3抑菌活性比较稳定。结果表明，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)YB-3经过自然界中长期驯化，对生长的环境要求不高，能适应比较宽的温度范围，能适应大规模的工业化生产，是将来微生物生防制剂的很好选择。
表2菌株YB-3抑制活性的遗传稳定性
Claims (2)
1.解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)YB-3，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.4318。
2.解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)YB-3CGMCC No.4318在抑制病原真菌中的应用；所述病原真菌为水稻纹枯病菌ACCC 36441、辣椒疫霉ACCC36278、棉花枯萎菌ACCC 36879、小麦赤霉菌ACCC 31059、番茄灰霉菌ACCC30387、西葫芦菌核菌ACCC 36084、稻曲菌ACCC36443、大豆根腐菌ACCC36242、大豆炭疽菌ACCC36201、莴苣菌核菌ACCC36081、黄瓜炭疽菌ACCC36065、黄瓜灰霉菌ACCC 36448、稻瘟菌ACCC37632或棉花黄萎菌ACCC30309。
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| Date | Code | Title | Description |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130529 Termination date: 20211201 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |