CN102776146B - 一株解淀粉芽孢杆菌及其用途 - Google Patents

一株解淀粉芽孢杆菌及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B43-1，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2012年6月8日，保藏号：CGMCC No.6212。本发明公开的解淀粉芽孢杆菌B43-1的发酵上清液能够抑制异形枝葡孢、毛霉、木霉、链孢霉等多种病原真菌引起的食用菌病害。解淀粉芽孢杆菌B43-1对人畜无毒，绿色环保，防治食用菌污染病害效果显著，具有良好的生物农药开发前景。

Description

一株解淀粉芽孢杆菌及其用途
技术领域
本发明涉及食用菌栽培领域，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌及其用途。
背景技术
食用菌病害分为真菌、细菌、线虫、病毒等病原物侵染引起的侵染性病害和不良理化因子引起的生理性病害。生产过程中常见的真菌病害有蘑菇疣孢病害、食用菌木霉病害、青霉病害、毛霉病害、根霉病害、曲霉病害以及链孢霉病害等。真菌病害喜高温、高湿、通风不良及偏酸性环境，病菌孢子靠气流、喷水及人工操作等方式传播。其危害极其严重，给菇农和工厂化食用菌的栽培造成了巨大的经济损失。
金针菇、杏鲍菇等多种食用菌生产的工厂化生产采用了机械化操作，对菇类生长环境进行人工控制，实现了周年化生产。但是因为其栽培环境相对封闭，为各种病虫害的大规模爆发提供了环境条件。
金针菇软腐病是造成金针菇大量减产的真菌病害之一。其病原菌为异形枝葡孢(Cladabotryan varium)，以分生孢子方式进行传播。一般先在金针菇基部发病，刚开始呈褐色水浸状斑点，以后扩大产生白色絮状气生菌丝，金针菇组织逐渐软腐，其上覆盖一层白色絮状分生孢子堆。
金针菇工厂化栽培过程中，毛霉也是主要致病菌之一，常发生在菌瓶接种后的菌丝生长阶段和子实体生长阶段，与金针菇菌丝争夺养分和水分，从而使金针菇菌丝生长受到抑制。受污染的培养料，初期生长出灰白色而粗壮稀疏的菌丝，其生长速度快于金针菇的菌丝。后期气生菌丝顶端形成很多圆形的小颗粒体（孢子囊）。孢子囊初为黄白色，后变为黑色。一旦污染很难彻底清除，常引起大面的菌瓶报废，经济损失很大。
木霉是一种常见的食用菌真菌病害，它可侵染香菇、银耳、杏鲍菇、毛木耳、灵芝、金针菇等多种食用菌，各种食用菌的菌种、菌筒、栽培料和子实体上均可发病，如香菇受害后菌柄和菌盖背面变褐腐烂，病部产生绿色霉层；银耳早期染病的子实体萎缩不长，后期感染的子实体逐渐腐烂，产量损失巨大；金针菇菌瓶受到污染后，培养料迅速被木霉菌丝覆盖，产生大量的绿色孢子，导致菌瓶报废。
另外，链孢霉也是一种危害严重的真菌病害。链孢霉主要发生在以熟料为基质的食用菌栽培上，以生料为基质的栽培过程中很少发生，它的危害主要是无性繁殖的分生孢子广泛传播造成大面积污染。食用菌菌种感染后，橙红色的粉状孢子，呈团状或球状包住整个棉塞，也有的发生在培养袋底部或四周并破袋而出，形成大量的分生孢子堆，轻微的震动及空气流动，其分生孢子便随气流扩散，到处飞扬传播污染环境，如：香菇菌筒一旦受到污染就直接报废，并且在次年栽培中污染会更加严重；金针菇在发菌阶段和子实体生长阶段都会受到污染，在料面或基内生长，抑制菌丝的生长，同时产生大量孢子。
目前，食用菌的病害防治常采用化学药剂，但是效果都不理想，且会污染环境和残留于食用菌子实体上。利用生物防治病害,就能有效地避免上述缺点,因而具有广阔的发展前途。
发明内容
本发明的目的是提供一种解淀粉芽孢杆菌。该解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）菌株命名为 B43-1，于2012年6月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.6212。
该解淀粉芽孢杆菌菌株B43-1的发酵上清液能够抑制异形枝葡孢、毛霉、木霉、链孢霉等多种病原真菌引起的食用菌病害。
本发明的另一目的在于提供上述解淀粉芽孢杆菌B43-1的用途：能够抑制异形枝葡孢、毛霉、木霉、链孢霉等多种病原真菌引起的食用菌病害。对人畜无毒，绿色环保，防治食用菌污染病害效果显著，具有良好的生物农药开发前景。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种解淀粉芽孢杆菌，保藏名称为：Bacillus amyloliquefaciensB43-1，于2012年6月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.6212。其具体的鉴定如下：
(1) 形态特征：菌株在LB培养基上呈乳白色，半透明，表面褶皱。革兰氏染色阳性，细胞呈杆状，具运动性。
(2) 其生理生化特征见表1。
(3) 菌株的分子鉴定：
1) 基于16S rDNA的序列分析：以菌株B43-1(解淀粉芽孢杆菌：Bacillus amyloliquefaciens)的总DNA为模板，设计通用引物：8f- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG、1492r- GGTTACCTTGTTACGACTT。PCR扩增获得16S rDNA ，序列长度为1511bp，在NCBI上进行Blast序列比对，结果显示菌株B43-1的16S rDNA与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的同源性达到99%以上。
2) 基于gyrA基因的序列分析：以菌株B43-1的总DNA为模板，设计通用引物：gyrA-F-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT、gyrA-R- CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT。PCR扩增获得gyrA保守基因，序列长度为1025bp。在NCBI上进行Blast序列比对，结果显示菌株B43-1的gyrA基因与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的gyrA基因归为一类群。
结合菌株B43-1的生理生化特征、16S rDNA及gyrA序列分析结果，证明菌株B43-1为一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
上述的解淀粉芽孢杆菌在抑制异形枝葡孢、毛霉、木霉和链孢霉中任意一种或多种病原真菌引起的食用菌病害上的应用。
一种纯生物菌株培养物，该培养物中具有保藏号为CGMCC No.6212的解淀粉芽孢杆菌或/和保藏号为CGMCC No.6212的解淀粉芽孢杆菌抑制异形枝葡孢、毛霉、木霉和链孢霉中任意一种或多种病原真菌活性的所有鉴定特征的突变体。
上述的纯生物菌株培养物在抑制异形枝葡孢、毛霉、木霉和链孢霉中任意一种或多种病原真菌引起的食用菌病害上的应用。
一种含有纯生物菌株培养物的生物制剂，其在于，该纯生物菌株培养物中具有保藏号为CGMCC No.6212的解淀粉芽孢杆菌的菌株或/和保藏号为CGMCC No.6212的解淀粉芽孢杆菌抑制异形枝葡孢、毛霉、木霉和链孢霉中任意一种或多种病原真菌活性的所有鉴定特征的突变体。
一种从纯生物菌株培养物中分离得到的代谢物，其在于，该纯生物菌株培养物中具有保藏号为CGMCC No.6212的解淀粉芽孢杆菌的菌株或/和具有保藏号为CGMCC No.6212的解淀粉芽孢杆菌抑制异形枝葡孢、毛霉、木霉和链孢霉中任意一种或多种病原真菌活性的所有鉴定特征的突变体。
一种从纯生物菌株培养物中分离得到的上清液，其在于，该纯生物菌株培养物中具有保藏号为CGMCC No.6212的解淀粉芽孢杆菌的菌株或/和具有保藏号为CGMCC No.6212的解淀粉芽孢杆菌抑制异形枝葡孢、毛霉、木霉或链孢霉中任意一种或多种病原真菌活性的所有鉴定特征的突变体。
本发明的有益效果：
该解淀粉芽孢杆菌菌株B43-1的发酵上清液能够抑制异形枝葡孢、毛霉、木霉、链孢霉等多种病原真菌引起的食用菌病害。对人畜无毒，绿色环保，防治食用菌污染病害效果显著，具有良好的生物农药开发前景。
附图说明
图1  B43-1菌株的16SrDNA系统进化分析
图2  B43-1菌株的gyrA基因系统进化分析
图3  B43-1对食用菌病原菌的抑制作用
A: 异形枝葡孢  B：毛霉  C：木霉  D：链孢霉
1：CK，未加任何物质； 2、4：NB发酵上清液；3：NB培养基
具体实施方式
以下的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的说明。但是范围不仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明保护的范围。
一、实验材料
食用菌病原菌：毛霉：Mucor spp.
木霉：Trichoderma spp.
异形枝葡孢：Cladabotryan varium
链孢霉：Neurospora spp.
以上菌株均为实验室保存常规菌株，公众可以获得。
实施例一、解淀粉芽孢杆菌B43-1的获得
1．采集样品：采样全过程采取无菌操作。在搅拌室、装瓶操作室、灭菌室、冷却室、接种室（原种和栽培瓶）、洗菌室、培养室（原种和栽培瓶）、搔菌室、生育室、包装室、挖瓶室和冷却室等的东、南、西、北、中五个方位取点，每个点三个重复。将倒约30ml NA培养基（牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，调pH7.0-7.2，水1000ml，121℃灭菌20min）的平板打开放置于这些采样点30min，盖上平板盖，封口，置于28℃培养箱培养3天。
2.分离细菌：小心用接种针挑出细菌，划线纯化，于28℃培养箱中培养，发现有形状、大小和颜色不同的细菌菌落，则需分别挑取进一步纯化，直至每个平板呈现形状、大小和颜色均相同的细菌菌落；
3．筛选拮抗菌：将上述4种食用菌病原菌点接于PDA培养基平板中心，病原菌周围约等距离四点点接已纯化的细菌，于25℃培养箱中培养，1-2天观察抑菌情况，发现细菌周围出现抑制圈，即为目标细菌。结果从中筛选出一株对上述4种食用菌病原菌均具有明显抑菌效果的菌株，命名为：B43-1。
4．保存：将上述获得的细菌接到试管斜面中，划线28℃培养一天后，4℃冰箱保存。
5. 鉴定和保藏：经鉴定，B43-1菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，并于2012年6月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.6212，其具体的鉴定如下：
(1) 形态特征：菌株在LB培养基上呈乳白色，半透明，表面褶皱。革兰氏染色阳性，细胞呈杆状，具运动性。
(2) 生理生化特征：其生理生化特征见表1。
表1  菌株B43-1的生理生化特征
Figure BDA0000203000941
注：+表示阳性   –表示阴性
(3) 菌株的分子鉴定
1) 基于16S rDNA的序列分析
以菌株B43-1(解淀粉芽孢杆菌：Bacillus amyloliquefaciens)的总DNA为模板，设计通用引物：8f- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG（SEQ IDNO.3）、1492r- GGTTACCTTGTTACGACTT（SEQ ID NO.4）。PCR扩增获得16S rDNA ，序列长度为1511bp，具体序列如SEQ ID NO.1所示。
在NCBI上进行Blast序列比对，结果显示菌株B43-1的16S rDNA与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的同源性达到99%以上。系统进化分析，结果见图1。
2) 基于gyrA基因的序列分析
以菌株B43-1的总DNA为模板，设计通用引物：gyrA-F- CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT（SEQ ID NO.5）、gyrA-R- CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT（SEQ ID NO.6）。PCR扩增获得gyrA保守基因，序列长度为1025bp。具体序列如SEQ ID NO.2所示。
在NCBI上进行Blast序列比对，结果显示菌株B43-1的gyrA基因与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的gyrA基因归为一类群。系统进化分析，结果见图2。
结合菌株B43-1的生理生化特征、16S rDNA及gyrA序列分析结果，证明菌株B43-1为一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
实施例二、解淀粉芽孢杆菌B43-1发酵代谢液的制备，具体过程如下：
1、解淀粉芽孢杆菌B43-1种子液制备：取保存于4℃冰箱的解淀粉芽孢杆菌B43-1菌种活化后，接种于NB液体培养基（牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，调pH7.0-7.2，水1000ml，121℃灭菌20min）中，28℃下，150rpm/min振荡培养12h，作为种子液。
2、解淀粉芽孢杆菌B43-1发酵代谢液获得：将上述种子液按2%的接种量接种于NB液体培养基中，在28℃下，150rpm/min振荡培养48h，获得发酵液。10000rpm/min离心10min，取发酵上清液，用0.2μm微孔滤膜过滤，-20℃保藏备用。
实施例三、发酵液(实施例二)对食用菌病原菌的抑制作用：
采用琼脂扩散法检测发酵上清液的拮抗活性。将上述4种食用菌病原菌分别接种于PDA培养基平板中心，25℃培养一段时间，用孔径为6mm的打孔器在发菌的病原菌四周均匀打4个孔，并对4个孔进行编号，其中孔1：CK，未加任何物质、孔3：加100μl NB培养基、孔2和孔4每孔加100μl B43-1过滤除菌的发酵上清液，25℃培养一段时间，观察其抑菌作用。结果如图3所示。
由图可知，解淀粉芽孢杆菌B43-1发酵上清液能够有效的抑制异形枝葡孢、毛霉、木霉、链孢霉等多种病原真菌引起的食用菌病害。
综上所述，本发明从金针菇栽培环境分离获得了一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B43-1，其发酵液上清对食用菌污染病害：异形枝葡孢(Cladabotryan varium)、毛霉(Mucor spp.)、木霉 (Trichoderma spp.)、链孢霉（Neurospora spp.）具有显著的抑制效果。可用于制备防治食用菌污染病害的生物农药，具有良好的开发前景。
Figure IDA00002030010400011
Figure IDA00002030010400021

Claims (2)

1.一种解淀粉芽孢杆菌，该菌种分类命名为：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），于2012年6月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.6212。
2.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在制备抑制异形枝葡孢、毛霉、木霉和链孢霉中任意一种或多种病原真菌引起的食用菌病害的生物农药上的应用。
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