CN104974950B - 一种海洋解淀粉芽孢杆菌及其用途 - Google Patents

一种海洋解淀粉芽孢杆菌及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株海洋解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B01，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2014年12月11日，保藏号：CGMCC No.10154，本发明公开的海洋解淀粉芽孢杆菌B01的发酵上清液能够抑制鲍曼不动杆菌和副溶血弧菌等多种病原菌引起的水产病害，海洋解淀粉芽孢杆菌B01对人畜无毒，绿色环保，具有防治水产污染病害的效果，具有良好的生物农药开发前景。

Description

一种海洋解淀粉芽孢杆菌及其用途
技术领域
本发明涉及水产养殖领域，具体涉及一种海洋解淀粉芽孢杆菌及其用途。
背景技术
近几十年来，受野生资源限制以及市场需求的驱动，我国的水产养殖业得到了持续快速的发展，是目前世界上唯一一个养殖产量超过捕捞产量的国家，水产养殖业已成为我国国民经济的一个支柱产业，持续为我国提供大量优质蛋白，并可能成为解决我国粮食安全问题的关键因素。
随着我国水产养殖业的飞速发展，大规模、集约化的养殖模式逐渐取代了粗放、半粗放、半精养的养殖模式。养殖模式的转变在带给养殖者高产量、高收入的同时也给养殖业带来了灾难。集约化的养殖模式导致了养殖环境的恶化、养殖生物病害发生频繁，进而导致水产品品质下降等问题，这些问题正严重困扰着广大养殖者。
除了营养性因素和一些环境因素外，主要是细菌性疾病和病毒性疾病。细菌性疾病包括：各类弧菌引起的弧菌病，如鳗弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌（V. vulnifivus）、溶藻胶弧菌、副溶血弧菌（V. parahemolyticus）、河流弧菌生物型 I（V. fluvialis）等；柱状屈挠杆菌（Flexobacter columnare）引起的滑走细菌病（Gliding Bacterial Disease）；引起爱德华氏综合病（Edwardsiellosis）的鲶鱼爱德华氏菌（Edwardsiella ictaluri）及迟缓爱德华氏菌（E. tarda）；杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicida）引起的杀鲑气单胞菌症（Aeromonas salmonicida infections）；杀鱼巴斯德氏菌（Pasteurella picicida）引起的巴斯德氏菌症（Pasteurellosis），也叫类结节病；海豚链球菌引起的链球菌症（Streptococcal Infections）；帕卡奇诺卡氏菌（Nocardia kampachi）引起的诺卡氏菌症（Nocarydiosis）等。
哈氏弧菌是一种革兰氏阴性菌，具有发光特性，能运动、短杆状，是世界范围内养殖动物疾病的主要病原菌之一，如中国、澳大利亚、印度、美国和南美。它可以感染海洋脊椎动物和无脊椎动物，给养殖海洋鱼类、甲壳类和软体动物带来严重的危害。
鳗弧菌是一种革兰氏阴性菌，弧菌属，是一个高致病性海洋致病菌，能够引起 80多种不同的海洋鱼类及河口鱼类、双壳类及甲壳类等的末期出血性败血症，甚至导致鱼类死亡。鳗弧菌有23个血清型，基于O-抗原的不同，有不同的宿主特异性及不同程度的致病性。其中，O1-和O2-是最普遍的血清型。致病性菌株的所有血清型也包含在非毒力菌株中（Buch et al.2003），这说明血清型与毒力之间有着某些联系。
面对频繁发生的病害问题，目前人们主要采用各种抗生素进行控制。渔药的过度使用，给水产养殖带来了新的挑战，主要包括耐药菌株的产生、养殖微环境的破坏以及药物残留等问题。随着人们安全意识的提高，水产品药残问题越来越成为制约该产业健康发展的难题，亟待解决。
目前，水产的病害防治常采用化学药剂，但是效果都不理想，且会污染环境和残留于水产品种。利用生物防治病害，就能有效地避免上述缺点，因而具有广阔的发展前途。
发明内容
本发明的目的是提供一种海洋解淀粉芽孢杆菌。该海洋解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）菌株命名为B01，于2014年12月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.10154。
该海洋解淀粉芽孢杆菌B01的发酵上清液能够抑制鲍曼不动杆菌、曼弧菌、铜绿假单胞菌、副溶血弧菌等多种病原菌引起的水产病害。
本发明的另一目的在于提供上述海洋解淀粉芽孢杆菌B01的用途：能够抑制鲍曼不动杆菌、曼弧菌、铜绿假单胞菌、副溶血弧菌等多种病原菌引起的水产病害。对人畜无毒，绿色环保，防治水产污染病害的效果，具有良好的生物农药开发前景。
本发明通过以下措施实现：
一种海洋解淀粉芽孢杆菌，保藏名称为：Bacillus amyloliquefaciens B01，于2014年12月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.10154
本发明所述海洋解淀粉芽孢杆菌具体的鉴定如下：
(1) 形态特征：菌株在LB培养基上呈乳白色，半透明，表面褶皱。革兰氏染色阳性，细胞呈杆状，具运动性。
(2) 其生理生化特征见表1。
(3) 菌株的分子鉴定：
1) 基于16S rDNA的序列分析：以菌株B01 (海洋解淀粉芽孢杆菌：Bacillus amyloliquefaciens)的总DNA为模板，设计通用引物：8f- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG、1492r-GGTTACCTTGTTACGACTT。PCR扩增获得16S rDNA ，序列长度为1511bp，在NCBI上进行Blast序列比对，结果显示菌株B01的16S rDNA与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的同源性达到99%以上。
2) 基于gyrA基因的序列分析：以菌株B01的总DNA为模板，设计通用引物：gyrA-F-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT、gyrA-R- CAAGGTAATGCTCCAGGCATTG
CT。PCR扩增获得gyrA保守基因，序列长度为1025bp。在NCBI上进行Blast序列比对，结果显示菌株B01的gyrA基因与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的gyrA基因归为一类群。
结合菌株B01的生理生化特征、16S rDNA及gyrA序列分析结果，证明菌株B01为一株海洋分离到的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
上述的海洋解淀粉芽孢杆菌在抑制鲍曼不动杆菌和副溶血弧菌中任意一种或多种病原菌引起的水产病害上的应用。
本发明优选为每亩施用100-300ml菌液（每毫升菌液活菌数>108cfu），每10天适用一次。
一种纯生物菌株培养物，该培养物中具有保藏号为CGMCC No.10154的海洋解淀粉芽孢杆菌或/和保藏号为CGMCC No.10154的海洋解淀粉芽孢杆菌抑制鲍曼不动杆菌和副溶血弧菌中任意一种或多种病原菌活性的所有鉴定特征的突变体。
上述的纯生物菌株培养物在抑制鲍曼不动杆菌和副溶血弧菌中任意一种或多种病原菌引起的水产病害上的应用，具体为每亩施用100-300ml菌液（每毫升菌液活菌数>108cfu），每10天适用一次。
一种含有纯生物菌株培养物的生物制剂，其在于，该纯生物菌株培养物中具有保藏号为CGMCC No.10154的海洋解淀粉芽孢杆菌的菌株或/和保藏号为CGMCC No.10154的海洋解淀粉芽孢杆菌抑制鲍曼不动杆菌和副溶血弧菌中任意一种或多种病原菌活性的所有鉴定特征的突变体。
一种从纯生物菌株培养物中分离得到的上清液，其在于，该纯生物菌株培养物中具有保藏号为CGMCC No.10154的海洋解淀粉芽孢杆菌的菌株或/和具有保藏号为CGMCCNo.10154的海洋解淀粉芽孢杆菌抑制鲍曼不动杆菌和副溶血弧菌中任意一种或多种病原菌活性的所有鉴定特征的突变体。
本发明的有益效果：
该海洋解淀粉芽孢杆菌菌株B01的发酵上清液能够抑制鲍曼不动杆菌、曼弧菌、铜绿假单胞菌及副溶血弧菌等多种病原菌引起的水产病害。对人畜无毒，绿色环保，防治水产污染病害效果显著，具有良好的生物农药开发前景。
附图说明
附图1是B01菌株的16SrDNA系统进化分析图。
附图2 是B01菌株的gyrA基因系统进化分析图。
附图3 是B01对水产病原菌的抑制作用示意图。
A: 鲍曼不动杆菌 B：副溶血弧菌
具体实施方式
以下的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的说明。但是范围不仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明保护的范围。
一、实验材料
水产病原菌：鲍曼不动杆菌：Acinetobacter baumannii
副溶血弧菌：Vibrio Parahaemolyticus
以上菌株均为实验室保存常规菌株，公众可以获得。
实施例一、海洋解淀粉芽孢杆菌B01的获得
1．采集样品：采集威海海参养殖池淤泥和海水，富集培养20天，随后取出稀释1000倍，在28 °C培养箱中培养24 h。
2.分离细菌：小心用接种针挑出细菌，划线纯化，于28 °C培养箱中培养，发现有形状、大小和颜色不同的细菌菌落，则需分别挑取进一步纯化，直至每个平板呈现形状、大小和颜色均相同的细菌菌落；
3．筛选拮抗菌：将上述2种水产病原菌划线接于2216E培养基平板中心，病原菌周围约等距离四点点接已纯化的细菌，于28 °C培养箱中培养，1-2天观察抑菌情况，发现细菌周围出现抑制圈，即为目标细菌。结果从中筛选出一株对上述2种水产病原菌均具有明显抑菌效果的菌株，命名为：B01。
4．保存：将上述获得的细菌接到试管斜面中，划线28 °C培养一天后，4 °C冰箱保存。
5. 鉴定和保藏：经鉴定，B01菌株为海洋解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，并于2014年12月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.10154，其具体的鉴定如下：
(1) 形态特征：菌株在LB培养基上呈乳白色，半透明，表面褶皱。革兰氏染色阳性，细胞呈杆状，具运动性。
(2) 生理生化特征：其生理生化特征见表1。
表1 菌株B01的生理生化特征
注：+表示阳性 –表示阴性
(3) 菌株的分子鉴定
1) 基于16S rDNA的序列分析
以菌株B01(海洋解淀粉芽孢杆菌：Bacillus amyloliquefaciens)的总DNA为模板，设计通用引物：8f- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG（SEQ ID NO.3）、1492r- GGTTACCTTGTTACG
ACTT（SEQ ID NO.4）。PCR扩增获得16S rDNA ，序列长度为1511bp，具体序列如SEQID NO.1所示。
在NCBI上进行Blast序列比对，结果显示菌株B01的16S rDNA与海洋解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的同源性达到99%以上。系统进化分析，结果见图1。
2) 基于gyrA基因的序列分析
以菌株B01的总DNA为模板，设计通用引物：gyrA-F- CAGTCAGGAAATGCGTA
CGTCCTT（SEQ ID NO.5）、gyrA-R- CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT（SEQ ID NO.6）。PCR扩增获得gyrA保守基因，序列长度为1025bp。具体序列如SEQ ID NO.2所示。
在NCBI上进行Blast序列比对，结果显示菌株B01的gyrA基因与海洋解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的gyrA基因归为一类群。系统进化分析，结果见图2。
结合菌株B01的生理生化特征、16S rDNA及gyrA序列分析结果，证明菌株B01为一株海洋解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
实施例二、海洋解淀粉芽孢杆菌B01发酵代谢液的制备，具体过程如下：
1、海洋解淀粉芽孢杆菌B01种子液制备：取保存于4°C冰箱的海洋解淀粉芽孢杆菌B01菌种活化后，接种于LANDY液体培养基（牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，调pH 7.0-7.2，水1000ml，121°C灭菌20min）中，28°C下，150rpm/min振荡培养12h，作为种子液。
2、海洋解淀粉芽孢杆菌B01发酵代谢液获得：将上述种子液按2%的接种量接种于LANDY液体培养基中，在28°C下，150rpm/min振荡培养48h，获得发酵液。10000rpm/min离心10min，取发酵上清液，用0.2μm微孔滤膜过滤，-20°C保藏备用。
实施例三、发酵液(实施例二)对水产病原菌的抑制作用：
采用琼脂扩散法检测发酵上清液的拮抗活性。将上述2种水产病原菌分别画线接种于2216E培养基平板中心，28 °C培养一段时间，用孔径为8mm的打孔器在病原菌中打孔，并对其进行编号，每孔加100 µl B01过滤除菌的发酵上清液，28°C培养一段时间，观察其抑菌作用。结果如图3所示。
由图可知，海洋解淀粉芽孢杆菌B01发酵上清液能够有效的抑制鲍曼不动杆菌和副溶血弧菌等多种水产病害菌。
综上所述，本发明从海参养殖环境分离获得了一株海洋解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) B01，其发酵液上清对水产污染病害：鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）和副溶血弧菌（Vibrio Parahaemolyticus）具有显著的抑制效果。可用于制备防治水产污染病害的生物农药，具有良好的开发前景。
16S rDNA序列：
GACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTCTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAACGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCTTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCGTGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAA
gyrA基因序列：
CCTGGACTATGCAATGAGCGTTATCGTATCCCGGGCGCTTCCGGATGTGCGTGACGGTCTGAAGCCGGTTCACAGACGGATTTTGTACGCGATGAATGATTTAGGCATGACCAGTGACAAACCATATAAAAAATCTGCCCGTATCGTCGGTGAAGTTATCGGTAAGTACCACCCGCACGGTGACTCAGCGGTTTACGAATCAATGGTCAGAATGGCGCAGGATTTTAACTACCGCTACATGCTTGTTGACGGACACGGCAACTTCGGTTCGGTTGACGGCGACTCAGCGGCCGCGATGCGTTACACAGAAGCGAGAATGTCAAAAATCGCAATGGAAATTCTGCGTGACATTACGAAAGACACGATTGACTATCAAGATAACTATGACGGTTCAGAAAGAGAACCTGCCGTCATGCCTTCGAGATTTCCGAATCTGCTCGTAAACGGAGCTGCCGGTATTGCGGTCGGAATGGCGACAAATATTCCTCCGCATCAGCTTGGGGAAGTCATTGAAGGCGTGCTTGCCGTAAGTGAGAATCCTGAGATTACAAACCAGGAGCTGATGGAATACATCCCGGGCCCAGATTTTCCGACTGCAGGTCAGATTTTGGGCCGGAGCGGCATCCGCAAGGCATATGAATCCGGACGGGGATCAATCACAATCCGGGCTAAGGCTGAAATCGAAGAGACATCATCGGGAAAAGAAAGAATTATTGTCACAGAACTTCCTTATCAGTGAACAAAGCGAGATTAATTGAAAAATCGCAGATCTTGTCCGGGACAAAAAAATCGAAGGAATTACCGATCTGCGTGACGAATCCGACCGTAACGGAATGAGAATCGTCATTGAGATCCGCCGTGACGCCAATGCTCACGTCATTTTGAATAACCTTTACAAACAAACGGCCCTGCAGACGTCTTTCGGAATCAACCTGCTGGCGCTCGTTGACGGACAGCCGAAGGTACTAAGCCTGA

Claims (2)

1.一种解淀粉芽孢杆菌，其保藏名称为：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefacie ns）B01，于2014年12月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.10154。
2.一种纯微生物菌株培养物，其特征在于，该培养物中具有保藏号为CGMCC No.10154的解淀粉芽孢杆菌。
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