CN114836330B - 一种蜡样芽孢杆菌的抑制物制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于有害微生物防治技术领域，公开了一种蜡样芽孢杆菌的抑制物制备方法及应用，所述木贼镰刀菌HS02的ITS区核苷酸序列为SEQ ID NO：1；由木贼镰刀菌HS02制备得到的木贼镰刀菌HS02发酵物提取物；所述木贼镰刀菌HS02发酵物提取物在抑制蜡样芽孢杆菌的生长中的应用方法为：将木贼镰刀菌HS02进行发酵，将发酵物提取物用于抑制所述蜡样芽孢杆菌的生长。本发明结果表明提取物浓度在5mg/mL时对蜡样芽孢杆菌抑菌圈直径可达20.33±1.03mm，最低抑菌浓度(MIC)为0.078125mg/mL，抑菌效果非常突出。本发明具有方法简单、成本低、抑菌效果突出，在食品和医药行业具有广阔的应用前景。

Description

一种蜡样芽孢杆菌的抑制物制备方法及应用
技术领域
本发明属于有害微生物防治技术领域，尤其涉及一种蜡样芽孢杆菌的抑制物制备方法及应用。
背景技术
蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，是一种革兰氏阳性菌杆状芽孢杆菌，是一种食源性致病菌，其广泛存在于空气、土壤和水体中，在食品加工、贮存、运输过程中易受其污染，主要通过灰尘、昆虫、不洁用具及人手传播。蜡样芽胞杆菌能够产生肠毒素，部分菌株可产生呕吐毒素(Ccereulide)。食用被污染的食品后会食物中毒，主要临床表现为呕吐和腹泻。有的蜡样芽胞杆菌致病菌株也会感染人的眼部，严重时引发突发性肝脏衰竭，导致死亡。
近年来，由蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒事件屡有发生，由于蜡样芽孢杆菌芽孢高度耐热，能够承受干燥、有毒化学物质、UV射线、射线和其他不利的环境，很难通过加热烹调的方式彻底清除，导致8％的食物受其污染，影响食品安全和人们的身体健康。医疗器械灭菌方式不合理，使得少量存活的芽孢大量萌发成营养细孢，严重危害人类健康。因此，有效地抑制蜡样芽孢杆菌的生长繁殖，对于防止蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒具有十分重要的意义。
与此同时，由于抗生素滥用引起的微生物耐药基因，通过基因水平转移导致蜡样芽孢杆菌出现耐药性，给临床治疗带来了很大挑战，因此开发新的抑制蜡样芽胞杆菌的药物迫在眉睫。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
(1)现有的蜡样芽孢杆菌很难通过加热烹调的方式彻底清除，导致8％的食物受其污染，影响食品安全和人们的身体健康。
(2)医疗器械灭菌方式不合理，使得少量存活的芽孢大量萌发成营养细孢，严重危害人类健康。
(3)抗生素滥用引起的微生物耐药基因，通过基因水平转移在病原菌之间传递，导致蜡样芽孢杆菌出现耐药性，给临床治疗带来了很大挑战。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种蜡样芽孢杆菌的抑制物制备方法及应用。
本发明是这样实现的，一株对蜡样芽孢杆菌抑制活性的木贼镰刀菌HS02，其保藏编号为CGMCC No.40175，该菌株是从黄参根部组织中分离获得的，于2022年05月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
进一步，所述木贼镰刀菌HS02的ITS区核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
本发明的另一目的在于提供一种实施所述的木贼镰刀菌HS02的木贼镰刀菌HS02的分离、纯化和鉴定方法，所述木贼镰刀菌HS02的分离、纯化和鉴定方法包括：
(1)采集正处于生长期的黄参根，于4℃条件下运输至实验室；在自来水中冲洗掉黄参根表面泥土、晾干表面水分后用75％酒精浸泡90s，用无菌水冲洗1～2次，再用5％次氯酸钠溶液浸泡10min，用无菌水冲洗1～2次，再用75％酒精浸泡60s，最后用无菌水冲洗3～5次，用无菌滤纸吸干表面水分；
(2)用无菌手术刀切割成0.5cm的薄片，用无菌镊子夹取，放置于含有青霉素和链霉素的PDA固体培养基表面；在28℃培养3～5d，待表面长出菌丝后，用接种针挑取至新的PDA培养基进行不断的纯化，获得HS02；
(3)取纯化后的HS02菌株，液氮冻干研磨后用CTAB法提取基因组DNA，用通用引物ITS1/ITS4扩增ITS区，对PCR产物进行sanger测序，并将序列在NCBI/BLAST进行比对，得到木贼镰刀菌HS02。
进一步，所述PDA固体培养基包括马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15g/L。
本发明的另一目的在于提供一种由所述的木贼镰刀菌HS02制备得到的木贼镰刀菌HS02发酵物提取物。
本发明的另一目的在于提供一种制备所述的木贼镰刀菌HS02发酵物提取物的木贼镰刀菌HS02发酵物提取物的制备方法，所述木贼镰刀菌HS02发酵物提取物的制备方法包括：
将已纯化的木贼镰刀菌HS02，接种于500mL已灭菌的PDB培养基中，在28℃、120r/min条件下振荡培养5d，得到发酵种子液；将100g大米和100mL去离子水加入500mL锥形瓶，121℃灭菌20min，得到大米培养基；
将制备的种子液按照5％比例接种至大米培养基，在28℃恒温培养箱中培养30d；将200mL乙酸乙酯加入大米发酵物进行浸提3次，每次2d；合并乙酸乙酯提取液，减压浓缩后风干，得到木贼镰刀菌HS02发酵物提取物。
进一步，所述木贼镰刀菌HS02接种至大米培养基，在28℃静置培养25d。
进一步，所述木贼镰刀菌HS02发酵培养基为大米培养基或PDB培养基。
本发明的另一目的在于提供一种所述的木贼镰刀菌HS02发酵物提取物在抑制蜡样芽孢杆菌的生长中的应用。
进一步，所述木贼镰刀菌HS02发酵物提取物在抑制蜡样芽孢杆菌的生长中的应用方法为：将木贼镰刀菌HS02进行发酵，将发酵物提取物用于抑制所述蜡样芽孢杆菌的生长。
本发明的另一目的在于提供一种实施所述的木贼镰刀菌HS02的木贼镰刀菌HS02对蜡样芽孢杆菌抑制活性的测定方法，所述木贼镰刀菌HS02对蜡样芽孢杆菌抑制活性的测定方法包括：
将木贼镰刀菌HS02发酵物提取物用二甲基亚砜溶解后，配置成不同浓度提取物溶液，用0.22μm过滤器过滤；将活化的蜡样芽孢杆菌[购自中国医学细菌保藏管理中心，地址：北京市大兴区生物医药产业基地华佗路31号院，保藏编号为CMCC(B)63301]菌液稀释至1.0×108cfu/mL，取200μL均匀涂布在LB培养基表面；
待液体被充分吸收后，采用琼脂打孔法用直径2mm打孔器打孔，取出琼脂柱，取50μL提取物滤液加入孔内，同时设置青霉素阳性对照和二甲基亚砜溶剂对照，置于37℃培养12h，观察并测量抑菌圈直径。
结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
本发明采用经典的组织表面消毒法和平板分离法，从黄参根部组织中分离纯化出一株木贼镰刀菌HS02，该菌株发酵物乙酸乙酯粗提物对蜡样芽孢杆菌的生长具有很强的抑制作用。根据以上结果，本发明所涉及的木贼镰刀菌HS02及其发酵物提取物在蜡样芽孢杆菌的防治方面有可观的应用前景。
本发明公开的蜡样芽孢杆菌的抑制物制备方法及其应用，其包括：从黄生根部分离出一株木贼镰刀菌HS02(Fusarium equiseti)，该菌株发酵产物提取物对蜡样芽孢杆菌生长具有明显的抑制作用。本发明结果表明提取物浓度在5mg/mL时对蜡样芽孢杆菌抑菌圈直径可达20.33±1.03mm，最低抑菌浓度(MIC)为0.078125mg/mL，抑菌效果非常突出。本发明具有方法简单、成本低、抑菌效果突出，在食品和医药行业具有广阔的应用前景。
第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
本发明提供了一种蜡样芽孢杆菌的抑制物制备方法，对蜡样芽孢杆菌具有很好的抑制活性，能够为蜡样芽孢杆菌的抑制提供一种新途径。
第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：
(1)本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：
本发明技术方案转化后可防治蜡样芽孢杆菌对食品原材料污染和食品加工过程引起的蜡样芽孢杆菌污染。减少蜡样芽孢杆菌污染引起的食物中毒事件，其商业价值和社会意义重大。
(2)本发明的技术方案是否解决了人们一直渴望解决、但始终未能获得成功的技术难题：
食品原料受蜡样芽孢杆菌污染导致的食品安全问题是国内外普遍存在，但又长期得不到有效解决的问题，本发明提供了一种抑制蜡样芽孢杆菌的方法，可有效的抑制蜡样芽胞杆菌对食品原材料的污染，对于解决由蜡样芽孢杆菌引起的食品安全问题提供了一种新的解决方法。
此外，对耐药性蜡样芽孢杆菌的临床治疗提供了一种新的抗生素筛选途径。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的木贼镰刀菌HS02发酵物提取物制备方法流程图；
图2是本发明实施例提供的木贼镰刀菌HS02(Fusarium equiseti)菌落形态示意图；
图3是本发明实施例提供的不同浓度的木贼镰刀菌HS02发酵物提取物对蜡样芽孢杆菌的生长抑制效果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种蜡样芽孢杆菌的抑制物制备方法及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。
一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。
本发明设计的具体技术过程如下：
(1)采集正处于生长期的黄参根，于4℃条件下运输至实验室；在自来水中冲洗掉黄参根表面泥土、晾干表面水分后用75％酒精浸泡90s，用无菌水冲洗1～2次，再用5％次氯酸钠溶液浸泡10min，用无菌水冲洗1～2次，再用75％酒精浸泡60s，最后用无菌水冲洗3～5次，用无菌滤纸吸干表面水分；
(2)用无菌手术刀切割成0.5cm的薄片，用无菌镊子夹取，放置于含有青霉素和链霉素的PDA固体培养基表面；在28℃培养3～5d，待表面长出菌丝后，用接种针挑取至新的PDA培养基进行不断的纯化，获得HS02；
(3)取纯化后的HS02菌株，液氮冻干研磨后用CTAB法提取基因组DNA，用通用引物ITS1/ITS4扩增ITS区，对PCR产物进行sanger测序，并将序列在NCBI/BLAST进行比对，得到木贼镰刀菌HS02。
(4)将已纯化的木贼镰刀菌HS02，接种于500mL已灭菌的PDB培养基中，在28℃、120r/min条件下振荡培养5d，得到发酵种子液；将100g大米和100mL去离子水加入500mL锥形瓶，121℃灭菌20min，得到大米培养基；
(5)将制备的种子液按照5％比例接种至大米培养基，在28℃恒温培养箱中培养30d；将200mL乙酸乙酯加入大米发酵物进行浸提3次，每次2d；合并乙酸乙酯提取液，减压浓缩后风干，得到木贼镰刀菌HS02发酵物提取物。
(6)将木贼镰刀菌HS02发酵物提取物用二甲基亚砜溶解后，配置成不同浓度提取物溶液，用0.22μm过滤器过滤；将活化的蜡样芽孢杆菌菌液稀释至1.0×108cfu/mL，取200μL均匀涂布在LB培养基表面；
(7)待液体被充分吸收后，采用琼脂打孔法用直径2mm打孔器打孔，取出琼脂柱，取50μL提取物滤液加入孔内，同时设置青霉素阳性对照和二甲基亚砜溶剂对照，置于37℃培养12h，观察并测量抑菌圈直径。
本发明的第一个目的在于提供一株木贼镰刀菌HS02，其分离自黄参根组织。
本发明的第二个目的在于，提供木贼镰刀菌HS02或其发酵物提取物用于抑制蜡样芽孢杆菌生长中的应用。所述应用在于，将木贼镰刀菌HS02或其发酵物提取物用于抑制蜡样芽孢杆菌生长。
本发明的第三个目的在于，提供一种抑制蜡样芽孢杆菌生长的抑制物，其包括木贼镰刀菌HS02或其发酵物提取物中的活性成分。所述发酵物提取物包括木贼镰刀菌HS02及其发酵物的乙酸乙酯提取物，所述的乙酸乙酯提取物是以大米或PDB培养基发酵获得的，所述发酵培养基配方为：(1)大米固态发酵培养：100g大米，200g H2O。(2)PDB培养基：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L。
如图1所示，本发明实施例提供的木贼镰刀菌HS02发酵物提取物制备方法包括：
S101，将已纯化的木贼镰刀菌HS02，接种于500mL已灭菌的PDB培养基中，在28℃、120r/min条件下振荡培养5d，得到发酵种子液；
S102，将100g大米和100mL去离子水加入500mL锥形瓶，121℃灭菌20min，得到大米培养基；
S103，将制备的种子液按照5％比例接种至大米培养基，在28℃恒温培养箱中培养30d；将200mL乙酸乙酯加入大米发酵物进行浸提3次，每次2d；
S104，合并乙酸乙酯提取液，减压浓缩后风干，得到木贼镰刀菌HS02发酵物提取物。
本发明实施例提供的木贼镰刀菌HS02发酵物提取物在抑制蜡样芽孢杆菌的生长中的应用是将木贼镰刀菌HS02进行发酵，将发酵物提取物用于抑制所述蜡样芽孢杆菌的生长。
本发明实施例提供的将木贼镰刀菌HS02进行培养发酵提取物用于抑制所述蜡样芽孢杆菌的生长步骤之前，所述方法包括木贼镰刀菌HS02发酵物提取步骤；所述木贼镰刀菌HS02发酵物提取步骤包括：将木贼镰刀菌HS02的发酵物用2倍体积乙酸乙酯进行浸提。
本发明实施例提供的木贼镰刀菌HS02的发酵物制备法包括木贼镰刀菌HS02接种至大米培养基，在28℃静置培养25d。本发明实施例提供的木贼镰刀菌HS02为从黄参根部组织分离，其菌落形态如图2所示。
本发明实施例提供的木贼镰刀菌HS02的发酵物用2倍体积乙酸乙酯进行浸提3次，每次2d；木贼镰刀菌HS02发酵培养基为大米培养基或PDB培养基。
实施例1
1、菌株的分离、纯化：
甘肃省张掖市山丹县种植黄参的农田里采集正处于生长期的黄参根，于4℃条件下运输至实验室。在自来水中冲洗掉黄参根表面泥土、晾干表面水分后用75％酒精浸泡90s，用无菌水冲洗1～2次，再用5％次氯酸钠溶液浸泡10min，用无菌水冲洗1～2次，再用75％酒精浸泡60s，最后用无菌水冲洗3～5次，用无菌滤纸吸干表面水分后，用无菌手术刀切割成0.5cm的薄片，用无菌镊子夹取，放置于含有青霉素和链霉素的PDA固体培养基(马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15g/L)表面。在28℃培养3～5d，待表面长出菌丝后，用接种针挑取至新的PDA培养基进行不断的纯化，获得HS02，菌落形态如图2所示。
2、菌株鉴定
取纯化后的HS02菌株，液氮冻干研磨后用CTAB法提取基因组DNA，用通用引物ITS1/ITS4扩增ITS区，PCR产物交由生工生物工程(上海)股份有限公司进行sanger测序，结果如SEQ ID NO.1所示。序列在NCBI/BLAST比对，结果表明与Fusarium equiseti strainD25-1相似度达98.62％。因此HS02菌株归属为木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)，命名为木贼镰刀菌HS02。
实施例2：木贼镰刀菌HS02发酵物提取物制备
将已纯化的木贼镰刀菌HS02，接种于500mL已灭菌的PDB培养基中，在28℃、120r/min条件下振荡培养5d，得到发酵种子液。将100g大米和100mL去离子水加入500mL锥形瓶，121℃灭菌20min，得到大米培养基。将制备的种子液按照5％比例接种至大米培养基，在28℃恒温培养箱中培养30d。将200mL乙酸乙酯加入大米发酵物进行浸提3次，每次2d。合并乙酸乙酯提取液，减压浓缩后风干即得木贼镰刀菌HS02发酵物提取物。
实施例3：对蜡样芽孢杆菌抑制活性的测定
将木贼镰刀菌HS02发酵物提取物用二甲基亚砜溶解后，配置成不同浓度提取物溶液，用0.22μm过滤器过滤。将活化的蜡样芽孢杆菌[保藏编号为CMCC(B)63301]菌液稀释至1.0×108cfu/mL，取200μL均匀涂布在LB培养基表面，待液体被充分吸收后，采用琼脂打孔法用直径2mm打孔器打孔，取出琼脂柱，取50μL提取物滤液加入孔内，同时设置青霉素阳性对照和二甲基亚砜溶剂对照，置于37℃培养12h，观察并测量抑菌圈直径。
结果如图3所示，结果表明5mg/mL的木贼镰刀菌HS02发酵物提取物对蜡样芽孢杆菌具有非常明显的生长抑制作用，抑菌圈直径可达20.33±1.03mm。而且抑制作用呈现一定的剂量关系，当提取物浓度为0.0390625mg/mL和0.01953125mg/mL时无明显抑菌圈形成(见表1)。
表1木贼镰刀菌HS02发酵物提取物对蜡样芽孢杆菌生长的抑制
二、应用实施例。为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用实施例。
本发明提供了通过分离、纯化，筛选出一株木贼镰刀菌，将其在大米培养基进行发酵，获得的发酵产物乙酸乙酯提取物具有高效的蜡样芽孢杆菌抑制作用。
应用实例1
蜡样芽孢杆菌通过环境污染引起食物材料和加工过程引起的食品污染一直没能得到有效的解决，将该提取物配置成溶液在环境中喷洒可杀死环境中的蜡样芽孢杆菌及其芽孢，可防止因环境污染引起的食品原料和食品制备中引入的蜡样芽孢杆菌污染。
应用实例2
微生物的污染繁殖与代谢活动是引起食品腐败变质与食源性疾病的最主要原因之一，化学合成类食品防腐剂因存在食品安全风险，本发明中获得提取物包含的化合物均为天然来源，经进一步纯化可具有很强蜡样芽孢杆菌抑制活性的单一化合物，该化合物可能作为一种新的天然防腐剂，用于食品防腐保鲜，控制食源性致病菌的滋生与污染，对保障食品安全具有重要意义。
应用实例3
本发明中获得的提取物除对蜡样芽胞杆菌具有很强抑制活性外，还对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌具有抑制活性，具有很强的有害微生物广谱抑制活性。将提取物以抑菌活性为导向经进一步分离纯化后可获得特异性强的单体化合物，也可获得广谱抗菌性强的单体化合物，这些单体物质可作为先导化合物用于抗菌药物筛选，进一步充实抗生素先导化合物库。
三、实施例相关效果的证据。本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。
实施例1
本发明从黄参根部组织中分离得到的一株木贼镰刀菌，其5mg/mL的大米发酵产物乙酸乙酯提取物对蜡样芽孢杆菌的抑菌圈直径可达到20.5±1.03mm。该结果说明低浓度的提取物对蜡样芽孢杆菌具有极强的抑制活性，抑制效果突出。采用2倍稀释法测得的最低抑菌浓度为0.078125mg/mL(表1)，进一步说明提取物高效的抑制作用。
实施例2
根据本发明研究结果，获得的提取物除对蜡样芽胞杆菌具有很强抑制活性外，还对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌具有抑制活性，而对大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、沙门氏菌等革兰氏阴性菌没有抑制作用。因此获得的提取物对革兰氏阳性具有特异性抑制作用，推测提取物中有效成分物质在革兰氏阳性菌细胞膜或细胞壁上有特异性结合位点。通过破坏细胞壁或细胞膜完整性使得胞内物质，如蛋白质、核酸、无机离子泄露导致细胞死亡，因此本发明获得的提取物包含特异性抗菌成分，在未来很大的潜在开发应用价值。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 甘肃中商食品质量检验检测有限公司
甘肃省商业科技研究所有限公司
<120> 一种蜡样芽孢杆菌的抑制物制备方法及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 518
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtgcatcggc taactcccat atctcttgtg ttctacctat acgttgcctc ggcggatcag 60
cccgcgcccc gtaaaacggg acggcccgcc cgaggaccct aaactctgtt tttagtggaa 120
cttctgagta aaacaaacaa ataaatcaaa actttcaaca acggatctct tggttctggc 180
atcgatgaag aacgcagcaa aatgcgataa gtaatgtgaa ttgcagaatt cagtgaatca 240
tcgaatcttt gaacgcacat tgcgcccgcc agtattctgg cgggcatgcc tgttcgagcg 300
tcatttcaac cctcaagctc agcttggtgt tgggactcgc ggtaacccgc gttccccaaa 360
tcgattggcg gtcacgtcga gcttccatag cgtagtaata atacacctcg ttactggtaa 420
tcgtcgcggc cacgccgtaa aaccccaact tctgaatgtt gacctcggat caggtaggaa 480
tacccgctga acttaagcat atcaataagg cggaggaa 518

Claims (5)

1.一株抑制蜡样芽孢杆菌活性的木贼镰刀菌HS02，保藏编号为CGMCCNo.40175,拉丁名称为:Fusarium equiseti。
2.如权利要求1所述的木贼镰刀菌HSo2，其特征在于，所述木贼镰刀菌HS02的ITS区核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
3.一种如权利要求1所述的木贼镰刀菌HSO2发酵物提取物的制备方法，其特征在于，所述木贼镰刀菌HS02发酵物提取物的制备方法包括:
将已纯化的木贼镰刀菌HSo2，接种于500mL已灭菌的PDB培养基中，在28℃、120r/min条件下振荡培养5d，得到发酵种子液；将100g大米和100mL去离子水加入500mL锥形瓶，121℃灭菌20min，得到大米培养基；
将制备的种子液按照5％比例接种至大米培养基，在28℃恒温培养箱中培养30d；将200mL乙酸乙酯加入大米发酵物进行浸提3次，每次2d；合并乙酸乙酯提取液，减压浓缩后风干，得到木贼镰刀菌HSO2发酵物提取物。
4.一种如权利要求3所述的木贼镰刀菌HSO2发酵物提取物在抑制蜡样芽孢杆菌的生长中的应用。
5.如权利要求4所述的木贼镰刀菌HS02发酵物提取物在抑制蜡样芽孢杆菌的生长中的应用，其特征在于，所述木贼镰刀菌HSo2发酵物提取物在抑制蜡样芽孢杆菌的生长中的应用方法为:将木贼镰刀菌HSo2进行发酵，将发酵物提取物用于抑制所述蜡样芽孢杆菌的生长。
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