CN109609405B - 产抑藻活性物质的芽孢杆菌及用途 - Google Patents

产抑藻活性物质的芽孢杆菌及用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了产抑藻活性物质的芽孢杆菌及用途，产抑藻活性物质的芽孢杆菌(Bacillus sp)dhs‑330，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：M 2018846，实验证明，本发明的产抑藻活性物质的芽孢杆菌发酵生产出的抑藻活性物质对海水以及淡水藻类具有很好的去除作用，环境友好，能生物降解。

Description

产抑藻活性物质的芽孢杆菌及用途
技术领域
本发明涉及环境微生物技术领域，具体涉及一株产抑藻活性物质的芽孢杆菌及用途。
背景技术
有害藻华的爆发严重导致水域水质环境恶化，已经成为世界各国所面临的重大生态灾害问题。有害藻华的发生，不仅破坏水域生态环境，危害水产和渔业资源，造成经济损失，同时还能通过食物链危害人类的健康。另外，死亡的藻华生物被分解后产生的硫化氢等有毒、有臭味的气体，会造成水体发臭及各种病菌的快速繁殖，使水体进一步恶化，引起养殖鱼虾类病害的增加和流行，给渔业生产带来危害。
化学除藻剂有较好的除藻效果，但其存在一定或者较低的生态毒性作用，从长远角度讲，可能会对生态系统产生一定的危害。因此，寻找高效环保的有害藻类去除技术势在必行。通过环境中的微生物，“以菌治藻”，将为有害藻华爆发水域的治理以及水质净化提供一个新的思路。
发明内容
本发明的目的在于提供一株在有害藻华的治理及污染水域水质净化与处理中发挥重要作用的产抑藻活性物质的芽孢杆菌。
本发明的第二个目的是提供一种产抑藻活性物质的芽孢杆菌的用途。
本发明的技术方案概述如下：
产抑藻活性物质的芽孢杆菌(Bacillus sp)dhs-330，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：M 2018846。
上述产抑藻活性物质的芽孢杆菌发酵生产抑藻活性物质的用途。
本发明的优点：
本发明的产抑藻活性物质的芽孢杆菌(Bacillus sp)dhs-330，保藏编号为CCTCCNO：M2018846发酵生产出的抑藻活性物质对海水以及淡水藻类具有很好的去除作用，环境友好，能生物降解。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
产抑藻活性物质的芽孢杆菌(Bacillus sp)dhs-330的获得：
本发明的产抑藻活性物质的菌株是筛选自中国天津塘沽近海滩涂的污泥，经分离、纯化得到的一株菌。
具体方法为：称取1g泥样，接入装有90mL无菌水的250mL三角瓶中，混匀制成稀释液，取1mL稀释液加入9mL无菌水中制成10-1稀释液，连续稀释制成10-2～10-9等一系列稀释液；每个梯度的稀释液取100μL涂布于固体培养基平板，30℃培养；挑取单菌落进行划线培养，直至培养基上为单一菌落即为纯菌，分别测定各菌的抑藻活性，选取其中的优势菌株，得到产抑藻活性物质的菌株dhs-330。
该菌株的形态特征，培养特征，分子生物学特性分析的结果，鉴定为芽孢杆菌。具体鉴定结果如下：
一.形态和生理生化特性
1.在不同培养基上的生长特性
在LB固体培养基上形态为表面粗糙不透明的灰白色或淡黄色菌落，不规则，边缘不整齐，在血平板上形成溶血圈。
2.显微形态特性
在显微镜下为柱状，芽孢为椭圆形到柱状，包含于菌体内。
3.生理生化特性，见表1。
表1
Figure BDA0001924031300000031
二.16SrDNA基因序列测定结果：
CTGTCCACCTTCGGCGGCTGGCTCATAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGGAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTTTGAACCATGCGGTTCAAACAAGCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTGCATGTATAGCAGACTGCATGTATAGCA(SEQ ID NO.1)
本发明所述产抑藻活性物质的菌株芽孢杆菌(Bacillus sp)dhs-330已于2018年12月3日在中国典型培养物保藏中心进行了保藏，保藏中心地址为中国，武汉，武汉大学，保藏号为：CCTCC NO：M 2018846。
实施例2
产抑藻活性物质的芽孢杆菌(Bacillus sp)dhs-330，保藏编号为CCTCC NO：M2018846发酵生产抑藻活性物质的用途，包括以下步骤：
(1)菌种制备
在无菌环境下，将-80℃保存的菌株dhs-330接种于固体培养基平板，30℃培养箱静置培养36h。
所述固体平板培养基配方：葡萄糖32g/L(单独灭菌)，尿素5.0g/L，酵母提取物1.2g/L，Na2HPO4·12H2O 3.0g/L，KH2PO4 0.8g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，微量元素溶液(CaCl27.5g/L，FeSO4·7H2O 2.0g/L，MnSO4·H2O 2.0g/L)2.0mL，琼脂20g/L，pH 7.0，115℃灭菌30min。
(2)二级种子液制备
无菌环境下挑取dhs-330菌株，转接到液体培养基中，摇床培养，条件为温度30℃，摇床转速160rpm，培养时间36h，获得一级种子液；无菌环境下吸取获得的一级种子液，接种到液体培养基，接种量2％，摇床培养，条件为温度30℃，摇床转速160rpm，培养时间36h，得到二级种子液。
所述液体培养基配方为：葡萄糖33g/L(单独灭菌)，尿素5.0g/L，酵母提取物1.2g/L，Na2HPO4·12H2O 3.0g/L，KH2PO4 0.8g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，微量元素溶液(CaCl27.5g/L，FeSO4·7H2O 2.0g/L，MnSO4·H2O 2.0g/L)2.0mL，pH 7.0，115℃灭菌30min。
(3)发酵培养基的配制
配制50L发酵培养基的配方：葡萄糖2.0kg，尿素300g，酵母提取物75g，Na2HPO4·12H2O 200g，KH2PO4 45g，MgSO4·7H2O 15g，CaCl2 1.125g，FeSO4·7H2O 0.3g，MnSO4·H2O0.3g，调节pH至7.0，泵入发酵罐中，设置灭菌温度121℃，灭菌20min。
(4)发酵罐培养
灭菌程序结束后，设置发酵罐温度30℃，pH 7.0±0.5，罐内压力3PSI，溶氧40％，由搅拌转速和通气量关联，调到“AUTO”模式，搅拌转速控制范围为100rpm～500rpm，通气量范围10SLPM～60SLPM，待发酵罐温度、溶氧、pH稳定后，导入二级种子液，接种量2％，培养3d后下罐，将发酵液导出，即获得含有抑藻活性物质的发酵液。
(5)抑藻活性物质的分离纯化
获得的发酵液用10000rpm，离心15min去除菌体，获得的上清液用6M的盐酸调节pH至2.0，室温静置过夜，酸化液10000rpm，离心20min，舍弃上清得到沉淀，设置烘箱温度40℃烘干，得到粗产物；粗产物用5L氯仿/甲醇复溶，氯仿/甲醇(体积比)＝5/3，10000rpm离心10min，上清液在60℃下旋蒸去除有机溶剂，得到抑藻活性物质0.523kg。
实施例3
抑藻活性物质对铜绿微囊藻(商品)的抑藻活性实验：
取1g抑藻活性物质溶于1L无菌水中，充分混匀，即为抑藻剂母液，备用。同时取处于对数生长期的铜绿微囊藻1L，装入2L三角瓶中，共设置6组，放置于光照培养箱中，3000Lux，光暗比12h：12h，培养温度设置为25℃，分别加入0mL、0.1mL、0.2mL、0.5mL、1.0mL和5.0mL的抑藻剂母液，每隔24h分别对铜绿微囊藻的藻细胞进行计数，结果如表2，并分别计算去除率，结果如表3。
表2：
Figure BDA0001924031300000061
表3：
Figure BDA0001924031300000062
实施例4
抑藻剂对东海原甲藻(商品)的抑藻活性实验：
取1g抑藻活性物质溶于1L无菌水中，充分混匀，即为抑藻剂母液，备用。同时取处于对数生长期的东海原甲藻1L，装入2L三角瓶中，共设置6组，放置于光照培养箱中，2500Lux，光暗比12h：12h，培养温度设置为25℃，分别加入0mL、0.1mL、0.2mL、0.5mL、1.0mL和5.0mL的抑藻剂母液，每隔24h分别对东海原甲藻的藻细胞进行计数，结果如表4，并分别计算去除率，结果如表5。
表4：
Figure BDA0001924031300000071
表5：
Figure BDA0001924031300000072
序列表
<110> 国家海洋局天津海水淡化与综合利用研究所
<120> 产抑藻活性物质的芽孢杆菌及用途
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1454
<212> DNA
<213> 芽孢杆菌(Bacillus sp)
<400> 1
ctgtccacct tcggcggctg gctcataaag gttacctcac cgacttcggg tgttacaaac 60
tctcgtggtg tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg cggcatgctg 120
atccgcgatt actagcgatt ccagcttcac gcagtcgagt tgcagactgc gatccgaact 180
gagaacagat ttgtgggatt ggcttaacct cgcggtttcg ctgccctttg ttctgtccat 240
tgtagcacgt gtgtagccca ggtcataagg ggcatgatga tttgacgtca tccccacctt 300
cctccggttt gtcaccggca gtcaccttag agtgcccaac tgaatgctgg caactaagat 360
caagggttgc gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacaac 420
catgcaccac ctgtcactct gcccccgaag gggacgtcct atctctagga ttgtcagagg 480
atgtcaagac ctggtaaggt tcttcgcgtt gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct 540
tgtgcgggcc cccgtcaatt cctttgagtt tcagtcttgc gaccgtactc cccaggcgga 600
gtgcttaatg cgttagctgc agcactaagg ggcggaaacc ccctaacact tagcactcat 660
cgtttacggc gtggactacc agggtatcta atcctgttcg ctccccacgc tttcgctcct 720
cagcgtcagt tacagaccag agagtcgcct tcgccactgg tgttcctcca catctctacg 780
catttcaccg ctacacgtgg aattccactc tcctcttctg cactcaagtt ccccagtttc 840
caatgaccct ccccggttga gccgggggct ttcacatcag acttaaggaa ccgcctgcga 900
gccctttacg cccaataatt ccggacaacg cttgccacct acgtattacc gcggctgctg 960
gcacgtagtt agccgtggct ttctggttag gtaccgtcaa ggtaccgccc tattcgaacg 1020
gtacttgttc ttccctaaca acagagcttt acgatccgaa aaccttcatc actcacgcgg 1080
cgttgctccg tcagactttc gtccattgcg gaagattccc tactgctgcc tcccgtagga 1140
gtctgggccg tgtctcagtc ccagtgtggc cgatcaccct ctcaggtcgg ctacgcatcg 1200
ttgccttggt gagccgttac ctcaccaact agctaatgcg ccgcgggtcc atctgtaagt 1260
ggtagccgaa gccacctttt atgtttgaac catgcggttc aaacaagcat ccggtattag 1320
ccccggtttc ccggagttat cccagtctta caggcaggtt acccacgtgt tactcacccg 1380
tccgccgcta acatcaggga gcaagctccc atctgtccgc tcgactgcat gtatagcaga 1440
ctgcatgtat agca 1454

Claims (1)

1.产抑藻活性物质的芽孢杆菌在发酵生产抑藻活性物质中的用途，所述产抑藻活性物质的芽孢杆菌为芽孢杆菌（Bacillus sp.）dhs-330，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：M 2018846；
其发酵生产抑藻活性物质中的用途，包括以下步骤：
（1）菌种制备
在无菌环境下，将-80℃保存的菌株dhs-330接种于固体培养基平板，30 ℃培养箱静置培养36 h；
所述固体平板培养基配方：葡萄糖32 g/L，尿素5.0 g/L，酵母提取物1.2 g/L，Na2HPO4·12H2O 3.0 g/L，KH2PO4 0.8 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，微量元素溶液2.0 mL，琼脂20 g/L，pH 7.0，115 ℃灭菌30 min；所述葡萄糖单独灭菌；所述微量元素溶液的组分为：CaCl2 7.5 g/L，FeSO4·7H2O 2.0 g/L，MnSO4·H2O 2.0 g/L；
（2）二级种子液制备
无菌环境下挑取dhs-330菌株，转接到液体培养基中，摇床培养，条件为温度30 ℃，摇床转速160 rpm，培养时间36 h，获得一级种子液；无菌环境下吸取获得的一级种子液，接种到液体培养基，接种量2%，摇床培养，条件为温度30 ℃，摇床转速160 rpm，培养时间36 h，得到二级种子液；
所述液体培养基配方为：葡萄糖33 g/L，尿素5.0 g/L，酵母提取物1.2 g/L，Na2HPO4·12H2O 3.0 g/L，KH2PO4 0.8 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，微量元素溶液2.0 mL，pH 7.0，115℃灭菌30 min；所述葡萄糖单独灭菌；所述微量元素溶液的组分为：CaCl2 7.5 g/L，FeSO4·7H2O 2.0 g/L，MnSO4·H2O 2.0 g/L；
（3）发酵培养基的配制
配制50 L发酵培养基的配方：葡萄糖2.0 kg，尿素300 g，酵母提取物75 g，Na2HPO4·12H2O 200 g，KH2PO4 45 g，MgSO4·7H2O 15 g，CaCl2 1.125 g，FeSO4·7H2O 0.3 g，MnSO4·H2O 0.3 g，调节pH至7.0，泵入发酵罐中，设置灭菌温度121 ℃，灭菌20 min；
（4）发酵罐培养
灭菌程序结束后，设置发酵罐温度30℃，pH 7.0±0.5，罐内压力3 PSI，溶氧40%，由搅拌转速和通气量关联，调到自动模式，搅拌转速控制范围为100 rpm~500 rpm，通气量范围10 SLPM~60 SLPM，待发酵罐温度、溶氧、pH稳定后，导入二级种子液，接种量2%，培养3 d后下罐，将发酵液导出，即获得含有抑藻活性物质的发酵液；
（5）抑藻活性物质的分离纯化
获得的发酵液用10000 rpm，离心15 min去除菌体，获得的上清液用6M的盐酸调节pH至2.0，室温静置过夜，酸化液10000 rpm，离心20min，舍弃上清得到沉淀，设置烘箱温度40 ℃烘干，得到粗产物；粗产物用5 L氯仿/甲醇复溶，所述氯仿/甲醇的体积比=5/3，10000 rpm离心10 min，上清液在60 ℃下旋蒸去除有机溶剂，得到抑藻活性物质。
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