CN109706096B - 一株具有脱氮和高效絮凝能力的耐寒短杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株具有脱氮和高效絮凝能力的耐寒短杆菌及其应用。该耐寒短杆菌命名为：耐寒短杆菌(Brevibacterium frigoritolerans)ZQ 1‑1，保藏号为GDMCC No:60520。该耐寒短杆菌ZQ 1‑1具有高效的絮凝能力和较强的氨氮脱除能力：对5g/L的高岭土悬浮液，该菌株10分钟内的絮凝率达到90％以上；在氨氮初始浓度150mg/L的培养基中，该菌株对NH₄ ⁺‑N的去除率达87％以上；在氨氮含量高达600mg/L的猪粪水中，该菌株的氨氮脱除率达到60％以上，且在去除氨氮的同时，不积累亚硝态氮，无二次污染。本发明的耐寒短杆菌ZQ 1‑1可用于水体脱氮处理。

Description

一株具有脱氮和高效絮凝能力的耐寒短杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株具有脱氮和高效絮凝能力的耐寒短杆菌及其应用。

背景技术

目前，我国养殖业正向规模化、集约化方向迅速发展，在促进农业经济发展、提高人民生活质量之余，也带来很多环境问题和生态危机。据《第一次全国污染源普查公报》显示，我国仅畜禽养殖业氨氮年排放量就高达65万吨、总氮102.48万吨。含氮废水通过地表径流以及土壤渗滤进入到地表水体和地下水层之中，引起水体富营养化、水生生物死亡、生态系统失衡，不仅制约了我国养殖业的健康可持续发展，还造成严重的食品安全和环境安全问题，目前已成为我国地表水污染的主要问题。因此，加强废水脱氮具有重要的现实意义。

微生物脱氮因其经济、高效和无二次污染等优点被广泛应用于废水处理中。目前，国内外学者已分离到许多脱氮性能优异的菌株，主要包括粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)、不动杆菌(Acinetobacter sp.)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、无色杆菌(Achromobacter sp.)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)等。然而，由于实际水环境的复杂性，向水体直接投放游离菌株进行脱氮往往效果不佳。而研究表明，部分微生物能分泌多糖、蛋白质、腐殖质等组成的胞外聚合物形成絮凝剂，可将细菌细胞及环境中微粒络合形成结构疏松多孔的生物絮团，有助于菌株高效截获水流中碳、氮源，保障脱氮效率。因此，分离筛选同时具有高效脱氮和絮凝能力的菌株并将其应用于废水处理中，对于水体高效脱氮具有重要实际意义。

发明内容

本发明的目的提供一株同时具有高效絮凝和脱氮能力的耐寒短杆菌(Brevibacterium frigoritolerans)ZQ 1-1，为水体脱氮提供一种良好的生物材料。

本发明的另外一个目的是提供所述的耐寒短杆菌(Brevibacteriumfrigoritolerans)ZQ 1-1在水体脱氮中的应用，特别是在水体脱除氨氮中的应用。

本发明还提供了上述耐寒短杆菌ZQ 1-1在絮凝中的应用，如在絮凝高岭土中的应用。

为实现上述目的，本发明公布了一株脱氮絮凝耐寒短杆菌，其为耐寒短杆菌(Brevibacterium frigoritolerans)，菌株名为ZQ 1-1，该菌株已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼，保藏编号为GDMCCNo:60520，保藏日期为2018年12月18日。

本发明的耐寒短杆菌(Brevibacterium frigoritolerans)ZQ 1-1是由发明人于2018年10月从猪粪水自然曝气池污水中经过二次驯化富集分离得到，该菌株生理生化特征为：革兰氏阳性菌，细胞形状为杆状，无芽孢，无鞭毛，菌体外围包裹一层厚厚的粘性物质，大小为0.8～1.0×2.0～15.0μm(见图2)；菌落为浅黄色光滑的圆形，并具有全缘凸面(见图1)。

能利用铵盐为唯一氮源生长。

提取上述脱氮絮凝耐寒短杆菌ZQ 1-1的基因组DNA，利用27F/1492R引物扩增其16S rDNA基因，测序后得到的基因序列见SEQ ID NO.1。将该序列在NCBI及EzBioCloud网站上进行同源性比对分析，结果表明其与Brevibacterium frigoritolerans的16S rDNA序列相似性较高，相似度为99.48％，基于以上结果分析，初步鉴定本发明菌株为Brevibacterium frigoritolerans。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明的耐寒短杆菌(Brevibacterium frigoritolerans)ZQ 1-1对5g/L的高岭土悬浮液进行絮凝处理，该菌株10分钟内的絮凝率达到90％以上。

(2)本发明的耐寒短杆菌(Brevibacterium frigoritolerans)ZQ 1-1在以NH₄ ⁺-N(初始浓度150mg/L)为唯一氮源的液体培养基中培养48h，NH₄ ⁺-N去除率达87％以上；在氨氮含量高达600mg/L的猪粪水中处理72h后，废水中的氨氮脱除率达到60％以上，且去除氨氮的同时，不积累亚硝态氮，无二次污染。

综上所述，本发明的耐寒短杆菌(Brevibacterium frigoritolerans)ZQ 1-1在水体中的絮凝能力强，对水体中氨氮脱除效果好，在水体脱氮中有较大的应用潜力。

本发明的耐寒短杆菌(Brevibacterium frigoritolerans)ZQ 1-1，于2018年12月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼，保藏编号为GDMCC No:60520。

附图说明

图1为耐寒短杆菌ZQ 1-1在固体平板上的菌落形态。

图2为耐寒短杆菌ZQ 1-1经结晶紫染色后在光学显微镜下(100×)的照片。

图3为耐寒短杆菌ZQ 1-1对高岭土悬浮液10分钟内的絮凝效果，其中，a为去离子水对照组(侧面图)，b为耐寒短杆菌ZQ1-1实验组(侧面图)，c为去离子水对照组(俯视图)，d为耐寒短杆菌ZQ1-1实验组(俯视图)。

图4为耐寒短杆菌ZQ 1-1的生长趋势与脱氮曲线示意图。

图5为耐寒短杆菌ZQ 1-1对高氨氮猪粪水脱氮曲线示意图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1耐寒短杆菌ZQ 1-1的富集培养与分离纯化及保存

(1)富集培养

富集培养基：NH₄Cl 0.4g/L、NaNO₂ 0.25g/L、KH₂PO₄ 2.0g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2g/L、Na₂CO₃ 0.4g/L，溶剂为水；于121℃高温高压灭菌20min。分装至250mL三角瓶中，每瓶90mL。

取猪粪水自然曝气池污水10mL，放入装有上述培养基的锥形瓶中，30℃，180rpm，培养48h，进行脱氮细菌的富集。后转接10mL至新的装有上述富集培养基的锥形瓶中，30℃，180rpm，培养48h，进行二次富集，得到的二次富集培养物。

(2)耐寒短杆菌ZQ 1-1的分离纯化与保存

分离培养基(铵离子作为唯一氮源培养基)：丁二酸钠2.5g、二水合柠檬酸钠2.5g、(NH₄)₂SO₄ 0.707g、K₂HPO₄ 1.0g、KH₂PO₄ 1.0g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、琼脂15g/L，加水定容至1000mL，调pH至7.4，分装至250mL三角瓶中，每瓶100mL；于121℃高温高压灭菌20min；然后添加无菌过滤后的复合碳源溶液1％(v/v)、复合维生素溶液0.2％(v/v)和复合微量元素溶液0.2％(v/v)。其中复合碳源溶液：称取D-葡萄糖6.9g、D-果糖6.9g、D-乳糖6.9g、醋酸钠9.5g、甘露醇7.0g、苯甲酸钠4.8g、水杨酸4.6g、90％乳酸6.4mL、无水乙醇7.0mL、甘油6.3mL，溶于500mL水中，调pH至7.4，0.22μm滤膜过滤除菌。复合维生素溶液：称取生物素(VH)10mg、叶酸(VB₉)100mg、吡哆醇(VB₆)100mg、硫胺素(VB₁)200mg、烟酸200mg、泛酸钙100mg、VB₁₂ 2mg、核黄素(VB₂)20mg、硫辛酸20mg、EDTA-Na 400mg，溶于1000mL水中，调pH至7.5，0.22μm滤膜过滤除菌。复合微量元素溶液：称取ZnSO₄·7H₂O 0.1g、MnCl₂·4H₂O 0.4g、H₃BO₃ 1.24g、CoCl₂·2H₂O 0.5g、CuCl₂·2H₂O 0.5g、NiSO₄·6H₂O 0.02g、NaMoO₄·2H₂O0.4g、KI 0.2g、CaCl₂ 5.0g、FeSO₄·7H2O 1.1g、EDTA-Na 10.0g，溶于1000mL H₂O，调pH至7.4，0.22μm滤膜过滤除菌。

将步骤(1)得到的二次富集培养物，采用稀释涂布法涂布到含分离培养基的平板上；肉眼观察菌落形态，结果见图1和图2；该菌落呈浅黄色光滑的圆形，并具有全缘凸面(图1)，为革兰氏阳性菌，细胞形状为杆状，无芽孢，无鞭毛，菌体外围包裹一层厚厚的粘性物质，大小为0.8～1.0×2.0～15.0μm(图2)，能利用铵盐为唯一氮源生长；进一步划线纯化，对纯化后的菌株，扩大培养并将菌种保存于甘油管和冻干管。

实施例2耐寒短杆菌ZQ 1-1的16S rDNA鉴定

提取耐寒短杆菌ZQ 1-1的基因组DNA，用细菌16S rDNA基因扩增通用引物27F/1492R(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和5’-TACGACTTAACCCCAATCGC-3’)扩增得到PCR产物，并送至上海美吉生物医药科技有限公司(广州分公司)进行序列测序，序列见SEQ ID NO.1。将测序结果与NCBI及EzBioCloud数据库中的16S rDNA序列进行同源性比对分析，结果分析表明其与菌株Brevibacterium frigoritolerans的16S rDNA基因序列相似性最高(99.48％)。基于以上结果分析，初步鉴定本发明的耐寒短杆菌为Brevibacteriumfrigoritolerans，将其命名为：耐寒短杆菌(Brevibacterium frigoritolerans)ZQ 1-1。该菌株于2018年12月18日日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼，保藏编号为GDMCC 60520。

实施例3耐寒短杆菌ZQ 1-1的絮凝效率检测

絮凝效率检测采用高岭土悬浮液检测法(Kaolin法)：

耐寒短杆菌ZQ1-1发酵液的制备：发酵培养基为营养肉汤，挑取耐寒短杆菌ZQ1-1菌株接种至发酵培养基中，培养48h后即为发酵液，备用。

高岭土悬浮液的制备：称取5g高岭土加入到950mL去离子水中，再加入50mL0.01g/mL CaCl₂溶液，混合均匀形成稳定的悬浮液，现配现用。

实验组(A1)：取2mL上述发酵液加入到100mL上述高岭土悬浮液中；对照组(A0)：加等量去离子水替换发酵液。将混合液在180rpm下处理1min，接着在80rpm下处理3min，再静置10min后，吸取上清液于比色皿中，检测550nm下的吸光度值，絮凝效率根据以下公式计算：

通过上述公式计算后得到耐寒短杆菌ZQ1-1的絮凝效率值为90.9％，结果见图3。如图3所示，与去离子水对照组比较，耐寒短杆菌ZQ1-1实验组有明显的絮凝沉淀效果产生。

实施例4耐寒短杆菌ZQ 1-1在氨氮为唯一氮源培养液的脱氮应用

将耐寒短杆菌ZQ 1-1接种至NH₄ ⁺-N液体培养基(即实施例1的分离培养基不加琼脂，其它成分和浓度不变，且NH₄ ⁺-N浓度为150mg/L)中，于30℃，180rpm/min恒温摇床培养，在培养0、8、12、24、48h后取样，一部分样品用于检测OD₆₀₀值，另一部分培养液离心取上清，定量检测溶液中NH₄ ⁺-N(钠氏试剂分光光度法HJ 535-2009)、NO₃ ^--N(紫外分光光度法HJ/T346-2007)和NO₂ ^--N(4-氨基苯磺酰胺分光光度法GB 7493-1987)浓度，结果见图4。如图4所示，耐寒短杆菌ZQ 1-1对培养液中NH₄ ⁺-N有很好的脱除效果，在该菌生长到48h时，能将培养液中初始浓度为150mg/L的NH₄ ⁺-N脱除87％以上，且脱除氨氮的过程中不积累亚硝态氮和硝态氮，无二次污染。

实施例5耐寒短杆菌ZQ 1-1在高氨氮猪粪水中的脱氮应用

供试样品为猪粪水自然曝气池污水；经检测，污水样品中氨氮含量为608.3mg/L，亚硝态氮检测不出。将污水样品用葡萄糖调节碳氮比为10，在115℃，灭菌15min。按1％(v/v)接种量接入耐寒短杆菌ZQ 1-1悬液，对照组接入等体积无菌水。于30℃，180rpm/min，在培养0、16、30、42、72h后取样，检测氨氮和亚硝态氮的浓度。结果见图5。如图5所示，耐寒短杆菌ZQ 1-1对高氨氮猪粪水氨氮脱除效果显著，在处理72h后，能将废水中初始浓度为608.3mg/L的NH₄ ⁺-N脱除60％以上。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 广东博沃特生物科技有限公司

<120> 一株具有脱氮和高效絮凝能力的耐寒短杆菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1422

<212> DNA

<213> 耐寒短杆菌 ZQ 1-1 (Brevibacterium frigoritolerans ZQ 1-1)

<400> 1

cttaggcggc tggctccatg aaggttacct caccgacttc gggtgttaca aactctcgtg 60

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Claims (3)

1.一株耐寒短杆菌（Brevibacterium frigoritolerans）ZQ 1-1，其保藏编号为：GDMCCNo:60520。

2.权利要求1所述的耐寒短杆菌ZQ 1-1在水体脱氮中的应用，其特征在于，是在水体脱除氨氮中的应用。

3.权利要求1所述的耐寒短杆菌ZQ 1-1在絮凝中的应用，其特征在于，是在絮凝高岭土中的应用。

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