CN115109719B - 一株具有絮凝以及低温生物脱氮功能的陶厄氏菌及其应用 - Google Patents

一株具有絮凝以及低温生物脱氮功能的陶厄氏菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株具有絮凝以及低温生物脱氮功能的陶厄氏菌及其应用，属于环境微生物应用技术领域。本发明分离得到的一株陶厄氏菌株，命名为Thauerasp.LJY‑001，分类命名为Thauera sp.LJY‑001，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 20211466，保藏时间为2021年11月22日。本发明提供的陶厄氏菌是一株具有高效脱氮、高效絮凝菌株，可广泛应用于市政污水中；该菌株在pH 7.2，温度28℃，转速为120r/min的条件下生长最佳，可用于处理高硝酸盐废水，其对硝态氮最高去除率可达95.5％，絮凝率最高可达68.6％。本发明的提出为提高寒冷地区废水脱氮处理系统的净化能力和运行的稳定性提供了技术手段。

Description

一株具有絮凝以及低温生物脱氮功能的陶厄氏菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种具有絮凝以及低温脱氮生物学活性的细菌，还涉及培养该细菌的方法、以该菌为主要组成成分的生物脱氮剂的制备、及其在水体氮素降解中的应用。本发明属于环境微生物应用技术领域。
背景技术
水体中的氮主要以有机氮、氨氮和硝酸盐氮等形式存在，是导致水体富营养化、危害人体健康和破坏水体生态环境最为常见的污染物之一。农业氮肥、工业废水及城镇污水等废水的排放是水体中氮素的主要来源。如何经济、高效地去除水体中氮素污染己成为水污染控制领域的研究重点和热点。
微生物具有来源广、繁殖快和适应环境能力强等特征，因此生物脱氮被认为是最为经济有效的方法。很多研究结果表明，温度降低导致反硝化菌活性下降、处理负荷和处理效率降低。
我国常规的污水处理厂针对冬季低温污水生物处理效果差的问题，为了保证出水能够达到国家排放标准，一般多采用降低污泥负荷、增加污泥回流量、增加污水停留时间、对构筑物进行保温等措施来提高处理效果，但这无疑会增加基建和运行费用，并且处理效果难以保证，还经常引起污泥膨胀等问题。
生物絮凝剂(Biological Flocculant或Bioflocculant)是一类由微生物产生的有絮凝活性的高分子代谢产物，成份有糖蛋白、多糖、蛋白质、纤维素和DNA等。它是利用微生物技术，通过细菌、真菌等微生物发酵、提取、精制而得到的，是具有可生物降解性和安全性的新型、高效、无毒、无二次污染的水处理剂。生物絮凝剂因其独特的性质具有以下优势：(1)高效，易于固液分离。同等用量下，与现在常用的各类絮凝剂相比，普通生物絮凝剂对活性污泥的絮凝速度最大，而且絮凝沉淀比较容易用滤布过滤。(2)无毒无害，安全性高。生物絮凝剂为微生物菌体或菌体外分泌的生物高分子物质，属于天然有机高分子絮凝剂，它安全无毒。因此，生物絮凝剂不仅可以应用于水处理领域，而且完全适用于食品、医药等行业的发酵后处理。(3)无二次污染，属于环境友好材料。生物絮凝剂是微生物的分泌物，主要成分是多聚糖、多肽和蛋白质等，易被微生物降解，不会影响水处理效果，且絮凝后的残渣可被生物降解，对环境无害，不会造成二次污染。(4)使用范围广，净化效果好。生物絮凝剂能絮凝处理的对象有：活性污泥、粉煤灰、木炭、墨水、泥水、河底沉积物、高岭土、粪尿水、印染废水、果汁等；同时还具有热稳定性强，用量少等特点。
人工筛选培育耐低温优势反硝化菌是解决低温废水脱氮效果差问题的最佳途径。本发明通过低温富集，从城市污水处理厂的活性污泥中分离出低温下具有高效降解硝态氮的耐低温反硝化菌，并在实验室条件下探讨其反硝化特性，旨在为提高寒冷地区废水脱氮处理系统的净化能力和运行的稳定性提供技术手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一株具有低温脱氮和高效絮凝的细菌，该细菌具有较高的反硝化活性和絮凝能力，可广泛应用于污水处理当中。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明分离得到一株陶厄氏菌株，命名为Thauera sp.LJY-001，分类命名为Thauera sp.LJY-001，保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为CCTCC No：M 20211466，保藏时间为2021年11月22日。
进一步的，本发明还提出了所述的陶厄氏菌株在制备生物脱氮剂中的应用、所述的陶厄氏菌株在制备絮凝剂中的应用以及所述的陶厄氏菌株在去除水体硝态氮中的应用。
更进一步的，本发明还提出了一种去除水体硝态氮的方法，其包括向欲处理的水体中加入所述的陶厄氏菌株的发酵液，在常温或低温条件下，处理6-24h的步骤。其中，优选的，所述的低温为8-10℃。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明提供的陶厄氏菌是一株具有高效脱氮、高效絮凝菌株，可广泛应用于市政污水中；该菌株在pH 7.2，温度28℃，转速为120r/min的条件下生长最佳，可用于处理高硝酸盐废水，其对硝态氮最高去除率可达95.5％，絮凝率最高可达68.6％。本发明的提出为提高寒冷地区废水脱氮处理系统的净化能力和运行的稳定性提供了技术手段。
附图说明
图1是陶厄氏菌(Thauera sp.)LJY-001在液体培养基上的菌落形态；
图2是陶厄氏菌(Thauera sp.)LJY-001的生长曲线；
图3是陶厄氏菌(Thauera sp.)LJY-001的16S r DNA序列；
图4是陶厄氏菌(Thauera sp.)LJY-001的淀粉水解试验结果；
图5是陶厄氏菌(Thauera sp.)LJY-001的油脂水解试验结果；
图6是陶厄氏菌(Thauera sp.)LJY-001的明胶水解试验结果；
其中，①号为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)；②号为陶厄氏菌(Thauerasp.)LJY-001；CK为对照；
图7是陶厄氏菌(Thauera sp.)LJY-001的葡萄糖发酵试验结果；
其中，①号为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)；②号为陶厄氏菌(Thauerasp.)LJY-001；CK为对照；
图8是陶厄氏菌(Thauera sp.)LJY-001的乳糖发酵试验结果；
其中，①号为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)；②号为陶厄氏菌(Thauerasp.)LJY-001；CK为对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随具体实施例的描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1陶厄氏菌(Thauera sp.)LJY-001的分离和鉴定
(1)细菌的富集、分离
从文昌污水处理厂邮寄曝气池水样，通过富集、梯度稀释、纯化等手段，得到8株菌。
将取回的活性污泥10m1，接种于装有100ml富集培养基的250ml三角瓶中，并在其中加入一定量的玻璃珠以起到分散活性污泥的作用。然后，将三角瓶置于温度28℃120rpm恒温振荡摇床振荡培养3d，得到细菌富集菌悬液。从富集培养菌悬液中取出10mL进行平板梯度稀释法分离菌种，选取10-3到10-6的菌悬液200μL倒入带有培养基的平板中，涂布棒涂匀，28℃培养3-4d，得到单菌落。
然后用接种环小心挑取平板中菌落颜色、大小、形状不同的单个菌落分别进行平板划线分离(牛肉膏蛋白胨培养基)，28℃，培养2-3d。单菌落再次划线涂平皿，做菌种保存验证用。通过富集培养基培养3d后测定培养基中硝态氮去除效果，选取硝态氮去除效果较好的菌种液，再次复筛验证。将去除效果最好的单一菌株进行16s基因测序鉴定，经过比对，该菌株为陶厄氏菌，命名为Thauera sp.LJY-001，Thauera sp.LJY-001在液体培养基上的菌落形态如图1所示，生长曲线如图2所示，测序结果如图3所示。
菌株液体培养基为乙酸钠2g/L，磷酸二氢钾0.4g/L，硫酸镁0.6g/L，氯化钙0.07g/L，硝酸钾1g/L，微量元素2mL，Tris缓冲液12mL，用NaOH调节该培养基的pH，使其达到pH7.0-7.2，121℃20min高温灭菌。
菌株固体培养基为蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，用NaOH调节该培养基的pH，使其达到7.0—7.2，加15g—20g琼脂粉，121℃20min高温灭菌。
(2)陶厄氏菌(Thauera sp.)LJY-001的生理生化特征
对陶厄氏菌(Thauera sp.)LJY-001的生理生化特征进行鉴定，结果如表1以及图4-8所示。
表1陶厄氏菌(Thauera sp.)LJY-001的生理生化特征
生理生化特征 陶厄氏菌(Thauera sp.)LJY-001
淀粉水解试验 ﹢
油脂水解试验 ﹢
明胶水解试验 ﹣
葡萄糖发酵 ﹣
乳糖发酵 ﹣
(3)保藏
将分离得到的一株陶厄氏菌株，命名为Thauera sp.LJY-001，分类命名为Thauerasp.LJY-001，保藏在中国武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号为CCTCC No：M 20211466，保藏时间为2021年11月22日。
实施例2培养基验证Thauera sp.LJY-001的硝态氮去除效果
实验室配反硝化富集培养基，250mL三角瓶装量200mL，用接菌签挑大量Thauerasp.LJY-001菌苔接入三角瓶中，28℃120rpm培养2天，静置1-2天。筛选菌株的硝态氮去除率88.5％，重复验证硝态氮去除率为86.4％。
实施例3常温缺氧条件下Thauera sp.LJY-001菌株的污水脱氮效果
取文昌污水处理厂进水，5L污水共加入无水乙酸钠10g，硝酸钾1.5g，磷酸氢二钾0.1g，分装到六联搅拌器1000mL容器中，投加28℃120rpm培养2天的菌种发酵液，转数35rpm，空白组投加相同体积的培养基，由数据可看出，常温条件下，16h陶厄氏菌的硝态氮去除率93.2％(表2)。
表2 Thauera sp.LJY-001菌株的污水脱氮效果
实施例4低温(8-10℃)缺氧条件下Thauera sp.LJY-001菌株的污水脱氮效果
在低温室(8-10℃)开展脱氮效果验证试验，取文昌污水处理厂进水，5L污水共加入无水乙酸钠10g，硝酸钾1.5g，磷酸氢二钾0.1g，分装到六联搅拌器1000mL容器中，投加28℃120rpm培养2天的菌种发酵液，转数35rpm，空白组投加相同体积的培养基，由数据可看出，低温8-10℃条件下，24h陶厄氏菌的硝态氮去除率96.9％(表3)。
表3低温(8-10℃)缺氧条件下Thauera sp.LJY-001菌株的污水脱氮效果
实施例5反硝化滤池验证Thauera sp.LJY-001菌株的脱氮效果
开展反硝化滤池脱氮效果研究，搭建约2吨容量反硝化反应玻璃柱装置，投加填料，反硝化滤池稳定运行后，投入菌落数为3×108/mL的Thauera sp.LJY-001发酵液，内循环阶2d段硝态氮去除到1mg/L，去除率达到90％以上；正常进出水运行后，填料挂膜明显，硝态氮去除率达到95％以上。
实施例6Thauera sp.LJY-001菌株的絮凝率测定
采用5g/L自来水配制的高岭土悬浊液作为试验水样。具体过程如下：在1000m L待测水样中，按照顺序投加一定量的Thauera sp.LJY-001培养液和1.5mL 10％CaCl2，然后用2mol/L NaOH溶液或2mol/L HCl溶液调节水样pH值至7.2左右。同时，以相同条件下添加菌株1或菌株2(菌株1或2为实验中其他菌种，菌株1为不动杆菌，菌株2为施氏假单胞菌)作为对照组，以相同条件下不添加任何絮凝剂的水样作为空白对照。在六联的混凝搅拌仪搅拌完成之后，静止沉淀20min。其中水温实测，水力条件为二段式搅拌(第一段搅拌速度160r/min，搅拌时间40s；第二段搅拌速度40r/min，搅拌时间280s)。用721分光光度计在550nm处测定上清液的透光率。絮凝效果用絮凝率(Flocculating efficiency)进行表征：
μ(％)＝(A-B)/A×100％
其中A表示空白水样上清液的浊度(吸光度)，B表待测水样上清液的浊度(吸光度)。
絮凝率μ表示投加絮凝剂前后，水样中悬浮物的去除率即絮凝率。
结果表明，陶厄氏菌Thauera sp.LJY-001有较好的絮凝作用，絮凝率可达68.6％(表4)。
表4絮凝率测定

Claims (6)

1.一株陶厄氏菌株，命名为Thauera sp.LJY-001，分类命名为Thauera sp.LJY-001，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 20211466，保藏时间为2021年11月22日。
2.权利要求1所述的陶厄氏菌株在制备生物脱氮剂中的应用。
3.权利要求1所述的陶厄氏菌株在制备絮凝剂中的应用。
4.权利要求1所述的陶厄氏菌株在去除水体硝态氮中的应用。
5.一种去除水体硝态氮的方法，其特征在于，包括向欲处理的水体中加入权利要求1所述的陶厄氏菌株的发酵液，在常温或低温条件下，处理6-24h的步骤。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的低温为8-10℃。
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