CN112940961A - 一种微生物絮凝剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种微生物絮凝剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于污水处理技术领域，具体涉及一种微生物絮凝剂及其制备方法和其在污水处理中的应用；所述微生物絮凝剂包含拉乌尔菌XN‑1微生物菌株，该菌株可以用作微生物絮凝剂去除废水中重金属，尤其是重金属Cr6+；此菌株也可直接培养菌液作为微生物絮凝剂使用，易于培养产量较高，具有广泛应用范围。

Description

一种微生物絮凝剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于污水处理技术领域，具体涉及一种微生物絮凝剂及其制备方法和其在污水处理中的应用。
背景技术
微生物絮凝剂是由微生物发酵、培养产生的具有絮凝活性的有机聚合物，通过絮凝过程去除废水中悬浮颗粒物、细胞、胶体固体等有机高分子物质。与化学絮凝剂相比，微生物絮凝剂在水处理过程中安全无毒、无二次污染、能自然降解、处理效果好、来源广等优点，受到人们的广泛关注。
虽然国内外对微生物絮凝剂的研究已有多项突破，但是微生物絮凝剂的制备成本很高，特别是在制备大量的、纯度高的、絮凝活性强的微生物絮凝剂的过程中，无论是仪器、药品或其他的消耗，成本都很高，且制备过程复杂，微生物絮凝剂产量低、而在应用中用量大等多种制约因素加大了微生物絮凝剂批量式生产的难度。因此，筛选高效的絮凝微生物菌株和开发低成本发酵技术显得尤为重要。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明提供了一株适用于污水处理的高效絮凝微生物菌，其特征是：该菌株为拉乌尔菌(Raoultellasp.)，保藏名称为XN-1絮凝菌，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为中国北京，保藏编号为21338，保藏日期为2020年 12月9日。
本发明还提供了一种微生物絮凝剂，其特征在于，包含有权利要求1所述的拉乌尔菌XN-1 微生物菌株。
本发明还提供了一种拉乌尔菌XN-1或含拉乌尔菌XN-1的微生物絮凝剂在去除废水中重金属的使用方法。
优选的，所述废水中重金属为Cr6+。
优选的，将拉乌尔菌XN-1或其发酵液作为微生物絮凝剂来去除废水中重金属。
优选的，拉乌尔菌XN-1或含拉乌尔菌XN-1的微生物絮凝剂在去除废水中重金属在温度30℃～35℃，pH值为4-9的环境下进行。
本发明还公开了所述的高效絮凝微生物菌的筛选方法，其特征在于，所述的方法包括：
(1)菌株的分离与纯化：从安徽省马鞍山市第二污水厂污泥中采集活性污泥样品，按照 10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6六个梯度稀释，取稀释好的样品涂布LB培养基，将平板倒置放置于30℃恒温培养箱中培养48h后挑取形态差异较大的菌株，将其放置装有5mL的LB液体培养基试管中，放置30℃180rpm/min的恒温震荡培养箱中培养36h至对数生长期，将菌液划线培养后挑取单菌落得到纯化的单菌落；
(2)初筛：培养分离纯化的单菌落，利用高岭土体系进行筛选，筛选出具有絮凝活性的微生物作菌株。
优选的，高岭土体系选自0.2g高岭土和2mL 1％的CaCl2溶液。
更具体的，步骤(2)为在100mL量筒内加入0.2g高岭土、2mL 1％的CaCl2溶液、2mL分离纯化所得的菌株发酵液，在200r/min转速快速搅拌5min，然后100r/min，慢速搅拌5min使其均匀，静置10min，测上清液在550nm处的吸光度，计算絮凝率来筛选出具有絮凝活性的微生物菌株。
本发明所述菌株XN-1，在30～35℃，pH为7-9，转速为100-300rpm/min下，菌株的絮凝率最高可以达到92％。
附图说明
图1为高岭土絮凝体系筛选絮凝剂微生物；
图2为絮凝剂菌体发酵液中不同成分絮凝活性分布。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。所描述的实施例及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：絮凝微生物菌株的筛选与鉴定
1.实验材料
试验材料为安徽省马鞍山市第二污水厂活性污泥；
2.培养基
LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L；
LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L。
絮凝微生物菌株的筛选：从安徽省马鞍山市第二污水厂污泥中采集活性污泥样品，称取 10g污泥样品至装有100mL无菌蒸馏水的烧杯中，用磁力搅拌器搅拌均匀；随后，将样品依次按照10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6六个梯度稀释；取稀释好的样品0.2mL均匀涂布LB 培养基，将平板倒置于30℃恒温培养箱中培养48h；挑取外观形态不一的单菌落12株于LB 液体培养基试管中，放置30℃180rpm/min的恒温震荡培养箱中培养36h至对数生长期，将菌液划线培养后挑取单菌落得到纯化的菌株进行斜面保存。
测试絮凝活性：在100mL量筒内加入0.2g高岭土、2mL 1％的CaCl2溶液、2mL分离纯化所得的菌株发酵液，在200r/min转速快速搅拌5min，然后100r/min，慢速搅拌5min使其均匀，静置10min，测上清液在550nm处的吸光度，根据以下公式计算絮凝率。
絮凝率计算公式为：
Figure RE-GDA0003025918020000031
式中：E———絮凝率，％；
A———加入待测样品处理后的高岭土悬液吸光度；
B———对照实验(空白高岭土悬浮液)测得的吸光度。
经过测定编号为XN-1，XN-2两株菌具有一定的絮凝活性，见图1，其中XN-1絮凝率最高可达到90％。
3.絮凝微生物菌株的鉴定
将0.5mLXN-1菌液接种于5mL的LB液体培养基中，于30℃、180rpm条件下培养48h。将所述菌株离心收集菌体，采用细菌提取试剂盒提取细菌基因组DNA，并采用通用引物27F(5′-AG AGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和引物1492R(5′-CGGGCGGTGTGTACAAG-3′) 进行测序。测序结果在GenBank中经NCBI Blast检索比对，确定复筛菌株的种属。在GenBank 中经NCBIBlast检索比对，本发明的菌株XN-1与Raoultella sp.的相似度达到99％；根据菌株 XN-1的形态特征和生理生化特征及16S rDNA基因序列特征，鉴定菌株XN-1为拉乌尔菌(Raoultella sp.)，命名为Raoultella sp.XN-1。
实施例2：产絮凝剂微生物菌株XN-1的培养条件优化
(1)温度：用接种环挑取保存于LB斜面的XN-1菌株至5mL的LB液体培养基中，30℃180rpm条件下振荡培养24h，用移液器吸取50μL的菌液转接到新鲜5mL LB培养基中，分别放置于25℃、30℃、35℃、37℃的不同温度条件下培养48h，分别测定菌株的絮凝率；结果表明在温度为35℃条件培养下菌株XN-1的絮凝率最高达92％。
(2)pH：用接种环挑取保存于LB斜面的XN-1菌株至5mL的LB液体培养基中，35℃180rpm条件下振荡培养24h，用移液器吸取50μL的菌液转接到新鲜的pH分别为4、5、6、7、 8、9的5mL LB培养基中，通过紫外分光光度计测定OD600比较菌株的生长情况，结果表明在pH为5-8范围内，菌株均可正常生长，具有广泛的pH适用范围。
(3)转速条件：用接种环挑取保存于LB斜面的XN-1菌株至5mL的LB液体培养基中，35℃180rpm条件下振荡培养24h，用移液器吸取50μL的菌液转接到新鲜5mL LB培养基中，将试管分别放置在温度为35℃，转速分别为100、150、200、250、300rpm的条件下培养至对数生长期，测试不同转速下菌株对高岭土体系的絮凝率，结果显示不同转速下培养的菌株的絮凝效率差异不大，可以在应用阶段使用中等转速等培养条件降低能耗。
实施例3：微生物絮凝剂的活性分布与提取
将0.5mL XN-1菌液接种于2瓶装有50mL的LB液体培养基的三角瓶中，于30℃、180rpm 条件下培养48h。收集其中一瓶发酵液，在12000r/min下离心10min，将上清液和菌体分离，用蒸馏水洗涤菌体两次，再将菌体细胞悬浮在与上清液等体积的蒸馏水中，置于振荡器上振荡数分钟混匀得菌体悬液。以LB培养基作为空白对照，分别将等体积的发酵液、上清液、菌悬液及培养基加入高岭土絮凝体系中，测定其絮凝效果，结果见图2。发酵液跟上清液均表现出较高的絮凝活性，菌体细胞絮凝活性较低，所以菌株XN-1产生的絮凝剂绝大部分是被微生物分泌到细胞外的上清液中的，并且菌体的存在对絮凝效果基本没有影响。
根据微生物絮凝剂的活性分布情况，絮凝剂主要由微生物菌体分泌到发酵液中，而且据研究报道絮凝物质主要是多糖和蛋白质类物质，本发明选用有机溶剂丙酮来提取絮凝剂，取20mL 的在4℃冰箱中预冷的丙酮加入到10mL的菌株XN-1发酵液上清，4℃过夜沉淀，真空冷冻干燥，得到粗制微生物絮凝剂。
实施例4：产絮凝剂微生物对废水中重金属的去除研究
将50mL培养至对数生长期的XN-1菌株加入到500mL浓度为10mg/L的Cr(VI)废水中，将其加入到35℃150rpm的恒温摇床中24h，测试体系中Cr(VI)的去除率，测定采用二苯碳酰二肼分光光度法，参见GB7467—1987。
Cr(VI)去除率采用如下公式计算：R(％)＝(C1–C2)/C1
其中R为Cr(VI)的去除率，C1和C2分别为Cr(VI)的初始浓度和最终浓度。
测试结果表明可去除90％以上的重金属含量。在废水的处理中表现出很好的Cr(VI)去除作用，在重金属污染治理应用中具有很大的潜力。

Claims (10)

1.一株适用于污水处理的高效絮凝微生物菌，其特征是：该菌株为拉乌尔菌(Raoultella sp)，保藏名称为XN-1絮凝菌，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为中国北京，保藏编号为21338，保藏日期为2020年12月9日。
2.一种微生物絮凝剂，其特征在于，包含有权利要求1所述的拉乌尔菌XN-1微生物菌株。
3.一种拉乌尔菌XN-1或含拉乌尔菌XN-1的微生物絮凝剂在去除废水中重金属的使用方法。
4.根据权利要求3所述的使用方法，其特征在于，所述废水中重金属为Cr6+。
5.根据权利要求3所述的使用方法，其特征在于：将拉乌尔菌XN-1或其发酵液作为微生物絮凝剂来去除废水中重金属。
6.根据权利要求3所述的使用方法，其特征在于：拉乌尔菌XN-1或含拉乌尔XN-1发酵液的微生物絮凝剂在去除废水中重金属在温度30℃～35℃，pH值为4-9的环境下进行。
7.权利要求1所述的高效絮凝微生物菌的筛选方法，其特征在于，所述的方法包括：
(1)菌株的分离与纯化：从安徽省马鞍山市第二污水厂污泥中采集活性污泥样品，按照10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6六个梯度稀释，取稀释好的样品涂布LB培养基，将平板倒置放置于30℃恒温培养箱中培养48h后挑取形态差异较大的菌株，将其放置装有5mL的LB液体培养基试管中，放置30℃180rpm/min的震荡培养箱中培养36h至对数生长期，将菌液划线培养后挑取单菌落得到纯化的单菌落；
(2)初筛：培养分离纯化的单菌落，利用高岭土体系进行筛选，筛选出具有絮凝活性的微生物作菌株。
8.根据权利要求7所述的筛选方法，其特征在于，还包括通过测定初筛菌株的絮凝活性进行复筛的步骤。
9.根据权利要求7所述的筛选方法，其特征在于，高岭土体系选自0.2g高岭土和2mL1％的CaCl2溶液。
10.根据权利要求7所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)为在100mL量筒内加入0.2g高岭土、2mL 1％的CaCl2溶液、2mL分离纯化所得的菌株发酵液，在200r/min转速快速搅拌5min，然后100r/min，慢速搅拌5min使其均匀，静置10min，测上清液在550nm处的吸光度，计算絮凝率来筛选出具有絮凝活性的微生物菌株。
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