CN107794238B - 高产生物絮凝剂的bfx-01菌株及获得的生物絮凝剂 - Google Patents

高产生物絮凝剂的bfx-01菌株及获得的生物絮凝剂 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物化学技术领域。目的是提供筛选一株微生物絮凝剂生产菌株，并将其应用于实际的污水处理的方法。采用的技术方案是：通过富集、纯化、筛选、培养，从土壤中筛选出微生物絮凝剂生产菌株BFX‑01，将其制作成为生物絮凝剂MBFX‑01，并测试絮凝效果。本发明筛选的菌株BFX‑01所产生的微生物絮凝剂，可高效絮凝污水中的悬浮颗粒和胶体，具有生物可降解、无毒、易生产等特性，解决了化学絮凝剂和有机合成高分子絮凝剂在污水处理之后的二次污染问题。

Description

高产生物絮凝剂的BFX-01菌株及获得的生物絮凝剂
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及筛选一株微生物絮凝剂生产菌株，并将其应用于实际的污水处理的方法。
背景技术
水资源是人们生产、生活必不可少的自然资源，也是各种生物赖以生存的环境资源。随着水资源危机的加剧和水环境质量不断恶化，水资源短缺已成为当今世界备受关注的问题之一。
现有的污水处理技术按照原理可分为：物理法、化学法和生物法三类。物理法包括沉淀法、气浮法、过滤法和反渗透法等。化学法有中和、电解、氧化还原、萃取等。生物法包括好氧法和厌氧法等。其中，絮凝法在当前国内外被普遍使用。絮凝法又称凝聚法，是指向污水中投加一定比例的絮凝剂，在污水中生成亲油性的絮状物，使微小油滴吸附于其上，然后用沉降或气浮的方法将油分去除的污水处理方法。
所述絮凝法中的絮凝剂，是用于将原水中的胶体部分脱稳形成细小的凝聚体，并在其作用下生成大体积絮凝物的水处理试剂。随着科学技术的发展，污水处理中絮凝剂的种类也越来越多元化，根据絮凝剂的成分不同可分为三大类：无机絮凝剂、有机合成高分子絮凝剂和生物絮凝剂。
无机絮凝剂主要有两类：铝盐类、铁盐类。无机絮凝剂由于价格低廉，絮凝效果好，得到了广泛使用。但随着科学技术发展，研究发现：铝盐会在人体内积累，导致中毒，表现症状为老年痴呆、铝性脑病、铝性骨病、铝性贫血等；少量铁盐絮凝剂虽相对无害，但由于铁盐会腐蚀设备，且铁锈有颜色，同时，高浓度的铁也会对生物体和生态带来不利影响，故其在使用上具有明显的局限性。
有机高分子絮凝剂分为天然类和人工合成类，据中文杂志《中国给水排水》(2003,19卷4期)公开的名为“复合型微生物絮凝剂的开发”的论文中报道，天然类有机高分子絮凝剂由蛋白质、藻朊酸钠、淀粉、羧甲基纤维素钠等天然化工物组成，该类絮凝剂污染较少、效果较好，但因天然物质储存难度大，易失效，且其含有的有效化学成分相对人工合成类的较低，需用量比较大，故未得到广泛应用。人工合成类有机高分子絮凝剂是直接通过化学合成的，包括聚丙烯酰胺、聚乙烯亚胺、聚丙烯酸钠、聚乙烯吡啶盐等，具有用量少、适用范围广、受外界环境的影响少和处理效果好等优点。有机高分子絮凝剂本身无毒，但难以被降解，容易在自然界中形成堆积，且其合成单体具有强烈的神经毒性，会产生非常强烈的三致效应(致癌、致畸和致突变)，因而它的使用也受到限制。
微生物絮凝剂是由微生物组成的，可分为微生物菌体、微生物细胞壁、微生物发酵产物和基因改造微生物的产物等，主要通过微生物及其新陈代谢产物与水中的颗粒相互作用、沉淀，从而达到污水处理的效果，具有来源广泛、生产周期短、生物相容性、生物可降解性和降解中间物不存在二次污染等优点。
微生物絮凝剂虽具有上述显著优点，但目前，国际上对于微生物絮凝剂的研究，大部分还处于初级阶段；我国对于微生物絮凝剂的研究，更是还处于试验阶段，未能真正大规模投入生产使用。
发明内容
本发明的目的是提供一株高产生物絮凝剂的菌株，并将其应用于实际的污水处理。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一株微生物絮凝剂生产菌株BFX-01，于2017年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏编号：14619；分类命名为：克雷伯氏菌，Klebsiellasp.。
优选的，上述菌株BFX-01，其核苷酸序列如SEQ ID NO1。
优选的，上述菌株BFX-01，克雷伯氏菌属(Klebsiellasp.)，生理生化特征为：菌落湿润、光滑、球形、粘稠、白色、容易挑起，革兰氏阴性菌，短杆状、不运动、有荚膜，可以降解明胶，产过氧化氢酶，不产氧化酶，吲哚实验为阳性，不产H2S气体。
相应的，由上述菌株BFX-01制得的生物絮凝剂，所述生物絮凝剂的适用pH范围为3～12。
优选的，所述生物絮凝剂的适用pH范围为7～10。
优选的，所述生物絮凝剂的适用浓度为0.3～3.0mg/mL。
优选的，所述生物絮凝剂的适用浓度为0.5mg/mL。
相应的，上述生物絮凝剂的制备方法，是将BFX-01菌株菌悬液培养48h，在6000rpm下离心20min，去除菌体，加入3倍体积的冷乙醇，4℃冰箱过夜。在6000rpm下离心10min，冷冻干燥得到。
优选的，上述生物絮凝剂的制备方法，其特征在于：所述BFX-01菌株菌悬液是将菌株BFX-01接种于富集培养基，将进入对数期的种子液8000rpm离心5min获得菌体细胞，用无菌纯水洗涤两次得到的。
相应的，上述生物絮凝剂BFX-01在絮凝方面的应用。
本发明具有以下有益效果：筛选出一株可以高效絮凝污水中悬浮颗粒和胶体的菌株，具有生物可降解、无毒、易以生产等特性，解决了化学絮凝剂和有机合成高分子絮凝剂在污水处理之后的二次污染问题。
附图说明
图1为BFX-01菌落形态
图2为BFX-01革兰氏染色显微镜形态
图3为BFX-01生长曲线
图4为生物絮凝剂MBFX-01浓度不同对絮凝效果的影响示意图
图5为生物絮凝剂MBFX-01的pH稳定性试验结果示意图
图6为生物絮凝剂MBFX-01的热稳定性试验结果示意图
具体实施方式
为优选出筛选微生物絮凝剂生产菌株BFX-01，并将其应用于实际的污水处理的最佳生产参数，本发明经过多次反复试验，下面具体提供优选的实施例，以使本领域技术人员更加清楚本发明的技术方案和效果。
实施例一
配置各培养基
富集培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂20g，pH＝7.2～7.4，水1L，121℃灭菌20min。
细菌培养基：酵母膏5g，蛋白胨10g，NaCl 0.5g，琼脂20g，自来水1L，pH＝7.0，121℃灭菌20min。
YPD培养基：蛋白胨5g，葡萄糖10g，麦芽膏3g，酵母膏3g，琼脂20g，水1L，添加30μg/mL链霉素或者100mg/L的氯霉素，112℃灭菌30min；
高氏Ⅰ号培养基：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O0.5g，NaCl0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂20g，pH＝7.4～7.6，121℃灭菌20min。
PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，自来水1L，pH自然。
初筛培养基：葡萄糖10g，K2HPO4 5g，KH2PO4 2g，NaCl 0.1g，MgSO4·7H2O0.2g，尿素0.5g，酵母膏0.5g，pH＝7.2～7.5，水1L，115℃灭菌20min。
复筛培养基：葡萄糖10g，K2HPO4 5g，KH2PO4 2g，NaCl 0.1g，MgSO4·7H2O0.2g，尿素0.5g，酵母膏0.5g，pH＝7.2～7.5，水1L，115℃灭菌20min。
实施例二
富集和纯化
富集：称取土样10g加入到含有玻璃珠的无菌生理盐水中，摇匀半个小时，将土样充分打散，静止澄清，吸取上清液按照10％加入到由90mL富集培养基和10ml水样组成的培养基中。将富集液在30℃、160rpm的摇床中培养1天。然后将富集液进行梯度稀释，即把上清液分部稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8。在无菌操作下，用移液器分别吸取0.1mL上述样品悬浊液，用涂布棒分别涂布于YPD培养基、高氏Ⅰ号培养基和PDA培养基上，将稀释液涂布均匀。将平板倒置培养，30℃条件下培养24～48h。
纯化：将富集得到的具有不同菌落形态的菌株进行划线分离纯化，挑选单菌落，重复划线2～3次，最后将得到的纯化菌落斜面在4℃冰箱中保存。
实施例三
筛选
初筛：将初筛培养基分装在50mL的三角瓶中，装液量为20mL，将筛选的菌种，从斜面接种于初筛培养基，在30℃、160rpm的恒温摇床中培养2d，8000rpm离心5min，测定上清液中的絮凝活性。
复筛：将初筛中具有絮凝活性的菌株，接种于产絮培养基中，在复筛培养基中培养1d。按照4％的接种量接入相同的培养基中，按照初筛的方法培养2d，8000rmp离心5min，测定上清液的絮凝活性。最后得到一株絮凝活性较高的菌株BFX-01。
于2017年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏编号：14619；分类命名为：克雷伯氏菌，Klebsiellasp.。
实施例四
菌株培养和观察
菌株培养：将斜面培养基上的BFX-01接种于细菌培养基上，在30℃的恒温培养箱中进行培养，12～24h观察菌落形态(如图1所示)，利用光学显微镜观察单独个体的形态(如图2所示)。
菌株生理生化特征为：菌落湿润、光滑、球形、粘稠、白色、容易挑起，革兰氏阴性菌，短杆状、不运动、有荚膜，可以降解明胶，产过氧化氢酶，不产氧化酶，吲哚实验为阳性，不产H2S气体。
菌悬液的配制：将斜面保存的菌株BFX-01接种于富集培养基，将进入对数期的种子液8000rpm离心5min获得菌体细胞，用无菌纯水洗涤两次，得到菌悬液。
生长曲线的绘制：将斜面保存的菌株接入到细菌培养基中，在30℃，160rpm的摇床中进行培养，以比浊法对培养液在600nm处测定吸光值，由于菌体量较大，培养液进行适当稀释(如图3所示)。
实施例五
对菌株BFX-01进行分子生物学鉴定
(1)基因组DNA的提取：将得到的BFX-01菌株菌悬液，通过细菌基因组DNA提取试剂盒(TianGen生物公司)获得细菌基因组DNA。
(2)PCR扩增：利用细菌基因组DNA作为模板，采用细菌16S rDNA通用引物作为扩增引物(包括前导引物和反向引物)，进行PCR扩增反应。
正向引物27F:5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇
反向引物1492R:5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇
PCR反应体系总体积为50ul，具体如表1所示：
表1PCR反应体系
试剂 体积(微升)
模板 2
2×Taq PCR MasterMix 25
正向引物 1.6
反向引物 1.6
双蒸水H<sub>2</sub>O 21.8
PCR循环体系如表2所示：
表2PCR循环体系
Figure GDA0001521021230000061
Figure GDA0001521021230000071
(3)PCR序列测定：将PCR产物送至上海生物工程公司测定。
(4)系统发育树的构建：将所得序列提交到GenBank数据库，运用Blast软件进行identify分析，分析结果采用Clustal W软件进行多序列比对。序列比对的地址为：http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。
测序得到BFX-01菌株基因的核苷酸序列：SEQ ID NO 1。
将上述序列提交Genbank数据库进行BLAST对比并将序列提交保存，菌株BFX-01的PCR产物测序可得到1190bp序列，经NCBI分析菌株BFX-01为克雷伯氏菌属(Klebsiellasp.)，同源性为99％。
实施例六
生物絮凝剂MBFX-01的一般生化性质测定
(1)生物絮凝剂MBFX-01的制备：将所述BFX-01菌悬液培养48h，在6000rpm下离心20min，去除菌体，加入3倍体积的冷乙醇，4℃冰箱过夜。在6000rpm下离心10min，冷冻干燥得到。
(2)pH耐受性研究
将上述生物絮凝剂MBFX-01溶液调节至不同的pH(3，4，5，6，7，8，9，10，11，12)，在4℃冰箱中放置24h，在室温下测定MBFX-01的絮凝活性。每个pH水平取0.25mL加入装有20mL高岭土悬液(5g/L)和1mL CaCl2(1％w/v)的混合液中，轻轻摇匀静止5min，在550nm处测定吸光值。
试验中涉及的絮凝率的计算公式如下所示：
絮凝率(FA)＝(A-B)/A*100％，其中，A表示在550nm处空白的吸光值，B表示550nm处样品的吸光值。
结果如图5所示：生物絮凝剂MBFX-01在pH＝3～12范围内效果较稳定，在pH＝7～10之间絮凝效果最好。说明BFX-01对极端的酸碱溶液有较好的耐受性，具有应用于用于酸性、中性和碱性污水处理的潜力。
(2)温度耐受性研究
将生物絮凝剂MBFX-01溶液调节至不同的水浴锅下中(20℃，40℃，60℃，80℃，100℃,120℃)放置30min，然后迅速将絮凝剂溶液冷却至室温，在室温下测定MBFX-01的絮凝活性。每个温度水平取0.25mL加入装有20mL高岭土悬液(5g/L)和1mL CaCl2(1％w/v)的混合液中，轻轻摇匀静止5min，在550nm处测定吸光值。
结果如图6：生物絮凝剂MBFX-01具有较高的温度耐受性，说明BFX-01的温度稳定性非常好，具有很好的保藏稳定性。
实施例七
生物絮凝剂MBFX-01的絮凝效果测定
(1)MBFX-01对高岭土的絮凝特性研究：
用上述生物絮凝剂MBFX-01溶液分别配置成不同浓度的溶液(0.1mg/mL，0.3mg/mL，0.5mg/mL，1.0mg/mL，1.5mg/mL，2.0mg/mL，3.0mg/mL，4.0mg/mL，6.0mg/mL)，每种水平取0.25mL加入到装有20mL高岭土悬液(5g/L)和1mL CaCl2(1％w/v)的混合液中，轻轻摇匀静止5min，在550nm处测定吸光值。
试验中涉及的絮凝率的计算公式如下所示：
絮凝率(FA)＝(A-B)/A*100％，其中，A表示在550nm处空白的吸光值，B表示550nm处样品的吸光值。
结果如图4所示：浓度0.3-3.0mg/mL的絮凝效果保持相对稳定，且在浓度为0.5mg/mL时絮凝效果最好。
(2)生物絮凝剂MBFX-01溶液和其它种类絮凝剂的絮凝效果比较1)、对高岭土悬液的絮凝效果比较
将阳性PAM、中性PAM、阴性PAM、聚合氯化铝铁、聚合氯化铝和生物絮凝剂MBFX-01六种不同絮凝剂分别按照各自最适的添加浓度和添加量(0.1％阳PAM 1.5mL，0.1％中PAM0.2mL，0.1％阴PAM 0.2mL，1％聚合氯化铝铁1.5mL，1％聚合氯化铝无效果，0.6％MBFX-010.8mL)，与高岭土悬液(5g/L)混合均匀，倒入100mL的量筒中，分别记录不同时间(1min，3min，5min，10min，20min)沉淀的体积。
结果如表3所示：
表3不同絮凝剂对高岭土悬液的絮凝效果
Figure GDA0001521021230000091
从表3可以看出：MBFX-01和阳性PAM的絮凝效果相当，比聚合氯化铝铁的效果好，而阳性PAM、中PAM和聚合氯化铝(聚铝)几乎无效果，因此MBFX-01与其它絮凝剂相比，具有较好的应用潜力。
2)、对泥浆水的絮凝效果比较
将10g土壤在100mL的自来水中高速旋转30min，静止1h，去除下面泥土的沉淀物，得到人造泥浆水。
将泥浆水调至中性偏弱碱性的pH值，加入各絮凝剂最适浓度及最适体积(0.1％阳PAM 1.6mL，0.1％中PAM 1.4mL，0.1％阴PAM 0.8mL，1％聚合氯化铝铁3mL，1％聚合氯化铝3mL，0.6％CBF-BFX-01 2.66mL)，在100mL量筒中测定各自沉淀的体积。
结果如表4：
表4不同絮凝剂对泥浆水的絮凝效果
Figure GDA0001521021230000092
Figure GDA0001521021230000101
从表4可知：MBFX-01和阳性PAM、中性PAM的效果相当，比聚合氯化铝(聚铝)、聚合氯化铝铁(聚铝铁)和阴性PAM的絮凝效果好，由此可以看出MBFX-01在泥浆水处理方面具有非常好的应用前景。
上述对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，对于本发明做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Figure GDA0001521021230000111
Figure GDA0001521021230000121
序列表
<110> 中国科学院成都生物研究所
<120> 高产生物絮凝剂的BFX-01菌株及获得的生物絮凝剂
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1190
<212> DNA
<213> 克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)
<400> 1
cgcagcatca agtggtagcg ccctcccgaa ggttaagcta cctacttctt ttgcaaccca 60
ctcccatggt gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gtagcattct 120
gatctacgat tactagcgat tccgacttca tggagtcgag ttgcagactc caatccggac 180
tacgacatac tttatgaggt ccgcttgctc tcgcgaggtc gcttctcttt gtatatgcca 240
ttgtagcacg tgtgtagccc tggtcgtaag ggccatgatg acttgacgtc atccccacct 300
tcctccagtt tatcactggc agtctccttt gagttcccgg ccggaccgct ggcaacaaag 360
gataagggtt gcgctcgttg cgggacttaa cccaacattt cacaacacga gctgacgaca 420
gccatgcagc acctgtctca cagttcccga aggcaccaat ccatctctgg aaagttctgt 480
ggatgtcaag accaggtaag gttcttcgcg ttgcatcgaa ttaaaccaca tgctccaccg 540
cttgtgcggg cccccgtcaa ttcatttgag ttttaacctt gcggccgtac tccccaggcg 600
gtcgatttaa cgcgttagct ccggaagcca cgcctcaagg gcacaacctc caaatcgaca 660
tcgtttacag cgtggactac cagggtatct aatcctgttt gctccccacg ctttcgcacc 720
tgagcgtcag tctttgtcca gggggccgcc ttcgccaccg gtattcctcc agatctctac 780
gcatttcacc gctacacctg caattctacc cccctctaca gactctagcc tgccagtttc 840
gaatgcagtt cccaggttga gcccggggat ttcacatccg acttgacaga ccgcctgcgt 900
gcgctgtacg cccagtattc cgattacgct tgcacccgtc cgtattaccg cgctgctgca 960
cgagtagcgt gctgctctgc ggctacgtca tcgatgagta gtagctcacg ctcttccctg 1020
ctgacgtgca ttagcagcct gaagctcata gaccacgcag catgactgca tcaggcctgc 1080
gccatggcat atgcccaatg actgcttccg tagatctgac aggttcgatc cattgactgc 1140
aatgccctcc tgaaccttag aaatccgtcg cgcctagttg agtcgcttag 1190

Claims (10)

1.一株微生物絮凝剂生产菌株BFX-01，其特征在于：于2017年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏编号：CGMCC NO.14619；分类命名为：克雷伯氏菌，Klebsiella sp.。
2.一株微生物絮凝剂生产菌株BFX-01，其特征在于：其16S rDNA序列如SEQ ID NO. 1。
3.根据权利要求2所述的微生物絮凝剂生产菌株BFX-01，其特征在于：克雷伯氏菌属，Klebsiellasp.，生理生化特征为：菌落湿润、光滑、球形、粘稠、白色、容易挑起，革兰氏阴性菌，短杆状、不运动、有荚膜，可以降解明胶，产过氧化氢酶，不产氧化酶，吲哚实验为阳性，不产H2S气体。
4.利用权利要求1-3中任意一项所述的菌株BFX-01制得的生物絮凝剂。
5.根据权利要求4所述的生物絮凝剂，其特征在于：所述生物絮凝剂的适用pH范围为3～12。
6.根据权利要求5所述的生物絮凝剂，其特征在于：所述生物絮凝剂的适用pH范围为7～10。
7.根据权利要求4所述的生物絮凝剂，其特征在于：所述生物絮凝剂的适用浓度为0.3～3.0mg/mL。
8.根据权利要求7所述的生物絮凝剂，其特征在于：所述生物絮凝剂的适用浓度为0.5mg/mL。
9.权利要求4-8中任意一项所述生物絮凝剂的制备方法，其特征在于：将BFX-01菌株菌悬液培养48h，在6000rpm下离心20min，去除菌体，加入3倍体积的冷乙醇，4℃ 冰箱过夜，在6000rpm下离心10min，冷冻干燥得到。
10.根据权利要求9所述生物絮凝剂的制备方法，其特征在于：所述BFX-01菌株菌悬液是将菌株BFX-01接种于富集培养基，将进入对数期的种子液8000rpm离心5min获得菌体细胞，用无菌纯水洗涤两次得到的。
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