CN104805146A - 一种从花椒内生耐寒短杆菌发酵液中制备l-酪氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从花椒内生耐寒短杆菌发酵液中制备L-酪氨酸的方法，其特点是将花椒内生耐寒短杆菌于温度30℃恒温培养活化24h后，接种到发酵培养基中，于温度28～37℃，120～180r/min水浴中恒温振荡发酵培养24～72h；将发酵液在常温下以4000～6000r/min的速度离心15min后除去菌体获得上清液冷冻干燥；按样品与Sephadex LH-20质量比1:20～50且上样量为柱体积的20％将发酵液过Sephadex LH-20层析柱，用100mL纯水等度洗脱，按每份收集量20mL等份收集洗脱液F1～F5；将组分F3用制备型液相色谱仪进行分离纯化，冷冻干燥即得到L-酪氨酸，得率为8～15mg/L发酵液。
Description
技术领域
本发明涉及一种从花椒内生耐寒短杆菌发酵液中制备L-酪氨酸的方法。
本发明得到的菌株已于2013年9月14日在中国典型培养物保藏中心保藏，编号：CCTCC M 2013422，分类名称耐寒短杆菌属GH-HJZ2(Brevibacterium frigoritolerans GH-HJZ2)。
背景技术
L-酪氨酸是一种芳香族氨基酸，属于条件必须氨基酸，适量补充酪氨酸可刺激大脑神经，改善记忆力，还可辅助改善焦虑、烦躁等情绪，增强身体抵抗力。此外，L-酪氨酸还是合成L-多巴和黑色素的主要原料，L-多巴是临床上治疗帕金森氏病的常用药物。传统的L-酪氨酸合成法是采用酸、碱或酶对含蛋白质的原料进行水解，但随着环境问题的出现及资源的短缺，许多学者开始关注通过微生物发酵来制备L-酪氨酸(Hagino H,Nakayama K.L-Tyrosine production by analogresistant mutants derived from a phenylalanine auxotroph of Corynebacterium glutamicum[J].Agricultural and Biological Chemistry,1973,39:2013-2023.Ito H,Sakurai S,Tanaka T.Genetic breeding of L-tyrosine producer Brevibacterium lactofermentum[J].Agricultural and Biological Chemistry.1990.54:699-705)。本发明人研究发现，花椒内生耐寒短杆菌属Brevibacterium frigoritolerans GH-HJZ2(保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M2013422)液体发酵产物经Sephadex LH-20层析柱初步分离，高效液相色谱(HPLC)分析后，对发酵产物进行进一步的分离纯化，并采用电喷雾电离质谱(ESI-MS)及核磁共振(NMR)等方法鉴定出发酵产物中含有L-酪氨酸。
目前，未见从花椒内生耐寒短杆菌发酵产物中分离制备L-酪氨酸的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种从花椒内生耐寒短杆菌发酵液中制备L-酪氨酸的方法。
本发明的目的由以下技术措施实现：
从花椒内生耐寒短杆菌发酵液中制备L-酪氨酸的方法包括以下步骤：
(1)微生物菌种及培养基
菌种：由中国典型培养物保藏中心保藏的一株花椒内生耐寒短杆菌属GH-HJZ2(Brevibacterium frigoritolerans GH-HJZ2，保藏编号为：CCTCC M2013422)菌株，培养条件为划线接种到斜面培养基上，于温度30℃恒温培养箱中培养24h后，将获得的菌落接种一个单菌落到150mL发酵培养基中，在温度28～37℃下，120～180r/min的水浴恒温振荡器上振荡培养24～72h。
耐寒短杆菌斜面培养基为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，初始pH值7.2～7.4。
发酵培养基为：1％可溶性淀粉，3.5％黄豆粉，1％NaCl，初始pH值7.0。
(2)发酵生产
用上述菌种及培养方法将花椒内生耐寒短杆菌属GH-HJZ2(Brevibacterium frigoritolerans GH-HJZ2，保藏编号为：CCTCC M2013422)发酵获得发酵液。
(3)发酵产物预处理
将上述发酵液用低速离心机在常温下以4000～6000r/min的速度离心15min后除去菌体，然后收集上清液，真空冷冻干燥后备用；
(4)Sephadex LH-20柱分离
将上述发酵液过Sephadex LH-20层析柱，按样品与Sephadex LH-20质量比1:20～50的比例上样，上样量为柱体积的20％；用100mL纯水进行等梯度洗脱，洗脱流速为2～6mL/min；按每份收集量20mL等份收集洗脱液，编号F1～F5备用；
(5)物质纯化
将组分F3用制备型液相色谱仪(pre-HPLC)进行分离纯化，条件如下：GL-science色谱柱(20×250mm,5μm)，流速18.9mL/min，柱温25℃，紫外检测波长280nm，进样量2mL，20％甲醇溶液洗脱30min，收集保留时间为3.8min的色谱峰，冷冻干燥即得L-酪氨酸，得率为8～15mg/L，其结构式如下：
性能测试与结构表征
1、采用电喷雾电离质谱(ESI-MS)对L-酪氨酸的结构测试得到了证实，得到其ESI-MS图谱详见图1所示。
2、采用核磁共振(NMR)对L-酪氨酸的结构测试得到了证实，得到其1H-NMR图谱详见图2所示。
本发明具有如下优点：
从花椒内生耐寒短杆菌发酵制备L-酪氨酸的方法，通过微生物发酵培养来获取含L-酪氨酸的发酵液，然后将发酵液过Sephadex LH-20层析柱粗分，将所得组分进行自由基清除活性考察及HPLC分析后，用pre-HPLC进一步分离纯化获得L-酪氨酸。
上述花椒内生耐寒短杆菌Brevibacterium frigoritolerans GH-HJZ2，保藏编号为：CCTCC M2013422，于2013年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心。
附图说明
图1：花椒内生耐寒短杆菌发酵产的L-酪氨酸的ESI-MS谱图。
结果表明该化合物的分子量为m/z 181。
图2：花椒内生耐寒短杆菌发酵产的L-酪氨酸的1H-NMR谱图。
结果表明1H-NMR分析如下：1H-NMRδ(600MHz,DMSO-d6/D2O＝1:4):2.96(1H,dd,J＝8.0,14.5),3.14(1H,dd,J＝4.6,14.5),3.76(1H,t,J＝4.8),6.84(2H,d,J＝8.4),7.17(2H,d,J＝8.4).
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容，对本发明作出一些非本质的改进和调整。
实施例1：
1、一种从花椒内生耐寒短杆菌发酵液中制备L-酪氨酸的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
(1)微生物菌种及培养基
菌种：由中国典型培养物保藏中心保藏的一株花椒内生耐寒短杆菌属GH-HJZ2(Brevibacterium frigoritolerans GH-HJZ2，保藏编号为：CCTCC M2013422)菌株，培养 条件为划线接种到斜面培养基上，于温度30℃恒温培养箱中培养24h后，将获得的菌落接种一个单菌落到150mL发酵培养基中，在温度28℃下，120r/min的水浴恒温振荡器上振荡培养24h。
耐寒短杆菌斜面培养基为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，初始pH值7.2～7.4。发酵培养基为：1％可溶性淀粉，3.5％黄豆粉，1％NaCl，初始pH值7.0。
(2)发酵生产
用上述菌种及培养方法将花椒内生耐寒短杆菌属GH-HJZ2(Brevibacterium frigoritolerans GH-HJZ2，保藏编号为：CCTCC M2013422)发酵获得发酵液。
(3)发酵产物预处理
将上述发酵液用低速离心机在常温下以4000r/min的速度离心15min后除去菌体，收集上清液，真空冷冻干燥得固体物质2.62g，保存备用。
(4)Sephadex LH-20柱分离
将上述发酵液过Sephadex LH-20层析柱，按样品与Sephadex LH-20质量比1:20的比例上样，上样量为柱体积的20％；用100ml纯水进行等梯度洗脱，洗脱流速为2mL/min；按每份收集量20mL等份收集洗脱液，编号F1～F5备用。
(5)物质纯化
将组分F3用制备型液相色谱仪(pre-HPLC)进行分离纯化，条件如下：GL-science色谱柱(20×250mm,5μm)；流速18.9mL/min；柱温25℃；紫外检测波长280nm；进样量2mL；20％甲醇溶液洗脱30min。收集保留时间为3.8min的色谱峰，冷冻干燥即得L-酪氨酸1.25mg，纯度为98.91％，得率为8.3mg/L。
实施例2：
(1)微生物菌种及培养基
菌种：由中国典型培养物保藏中心保藏的一株花椒内生耐寒短杆菌属GH-HJZ2(Brevibacterium frigoritolerans GH-HJZ2，保藏编号为：CCTCC M2013422)菌株，培养条件为划线接种到斜面培养基上，于温度30℃恒温培养箱中培养24h后，将获得的菌落接种一个单菌落到150mL发酵培养基中，在温度30℃下，140r/min的水浴恒温振荡器上振荡培养48h。
耐寒短杆菌斜面培养基为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，初始pH值7.2～7.4。发酵培养基为：1％可溶性淀粉，3.5％黄豆粉，1％NaCl，初始pH值7.0。
(2)发酵生产
用上述菌种及培养方法将花椒内生耐寒短杆菌属GH-HJZ2(Brevibacterium frigoritolerans GH-HJZ2，保藏编号为：CCTCC M2013422)发酵获得发酵液。
(3)发酵产物预处理
将上述发酵液用低速离心机在常温下以5000r/min的速度离心15min除去菌体，然后收集上清液，真空冷冻干燥后得固体物质2.87g，保存备用。
(4)Sephadex LH-20柱分离
将上述发酵液过Sephadex LH-20层析柱，按样品与Sephadex LH-20质量比1:25的比例上样，上样量为柱体积的20％；用100mL纯水进行等梯度洗脱，洗脱流速为3mL/min；按每份收集量20mL等份收集洗脱液，编号F1～F5备用。
(5)物质纯化
将组分F3用制备型液相色谱仪(pre-HPLC)进行分离纯化，条件如下：GL-science色谱柱(20×250mm,5μm)；流速18.9mL/min；柱温25℃；紫外检测波长280nm；进样量2mL；20％甲醇溶液洗脱30min。收集保留时间为3.8min的色谱峰，冷冻干燥即得L-酪氨酸1.47mg，纯度为97.36％，得率为9.8mg/L。
实施例3：
(1)微生物菌种及培养基
菌种：由中国典型培养物保藏中心保藏的一株花椒内生耐寒短杆菌属GH-HJZ2(Brevibacterium frigoritolerans GH-HJZ2，保藏编号为：CCTCC M2013422)菌株，培养条件为划线接种到斜面培养基上，于温度30℃恒温培养箱中培养24h后，将获得的菌落接种一个单菌落到150mL发酵培养基中，在温度37℃下，180r/min的水浴恒温振荡器上振荡培养72h。
耐寒短杆菌斜面培养基为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，初始pH值7.2～7.4。发酵培养基为：1％可溶性淀粉，3.5％黄豆粉，1％NaCl，初始pH值7.0。
(2)发酵生产
用上述菌种及培养方法将花椒内生耐寒短杆菌属GH-HJZ2(Brevibacterium frigoritolerans GH-HJZ2，保藏编号为：CCTCC M2013422)发酵获得发酵液。
(3)发酵产物预处理
将上述发酵液用低速离心机在常温下以6000r/min的速度离心15min后除去菌体，收集上清液，真空冷冻干燥后得固体物质3.13g，保存备用。
(4)Sephadex LH-20柱分离
将上述发酵液过Sephadex LH-20层析柱，按样品与Sephadex LH-20质量比1:50的比例上样，上样量为柱体积的20％；用100mL纯水进行等梯度洗脱，洗脱流速为6mL/min；按每份收集量20mL等份收集洗脱液，编号F1～F5备用。
(5)物质纯化
将组分F3用制备型液相色谱仪(pre-HPLC)进行分离纯化，条件如下：GL-science色谱柱(20×250mm,5μm)；流速18.9mL/min；柱温25℃；紫外检测波长280nm；进样量2mL；20％甲醇溶液洗脱30min。收集保留时间为3.8min的色谱峰，冷冻干燥即得L-酪氨酸1.94mg，纯度为98.42％，得率为12.9mg/L。
Claims (1)
1.一种从花椒内生耐寒短杆菌发酵液中制备L-酪氨酸的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
(1)微生物菌种及培养基
菌种：由中国典型培养物保藏中心保藏的一株花椒内生耐寒短杆菌属GH-HJZ2(Brevibacterium frigoritolerans GH-HJZ2，保藏编号为：CCTCC M2013422)菌株，培养条件为划线接种到斜面培养基上，于温度30℃恒温培养箱中培养24h后，将获得的菌落接种一个单菌落到150mL发酵培养基中，在温度28～37℃下，120～180r/min的水浴恒温振荡器上振荡培养24～72h；
其中，耐寒短杆菌斜面培养基为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，初始pH值7.2～7.4；
发酵培养基为：1％可溶性淀粉，3.5％黄豆粉，1％NaCl，初始pH值7.0；
(2)发酵生产
用上述菌种及培养方法将花椒内生耐寒短杆菌属GH-HJZ2(Brevibacterium frigoritolerans GH-HJZ2，保藏编号为：CCTCC M2013422)发酵获得发酵液；
(3)发酵产物预处理
将上述发酵液用低速离心机在常温下以4000～6000r/min的速度离心15min后除去菌体，然后收集上清液，真空冷冻干燥后备用；
(4)Sephadex LH-20柱分离
将上述发酵液过Sephadex LH-20层析柱，按样品与Sephadex LH-20质量比1:20～50的比例上样，上样量为柱体积的20％；用100mL纯水进行等梯度洗脱，洗脱流速为2～6mL/min；按每份收集量20mL等份收集洗脱液，编号F1～F5备用；
(5)物质纯化
将组分F3用制备型液相色谱仪(pre-HPLC)进行分离纯化，条件如下：GL-science色谱柱(20×250mm,5μm)，流速18.9mL/min，柱温25℃，紫外检测波长280nm，进样量2mL，20％甲醇溶液洗脱30min，收集保留时间为3.8min的色谱峰，冷冻干燥即得L-酪氨酸，得率为8～15mg/L，其结构式如下：
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|---|---|
| CN (1) | CN104805146A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109706096A (zh) * | 2019-01-04 | 2019-05-03 | 广东博沃特生物科技有限公司 | 一株具有脱氮和高效絮凝能力的耐寒短杆菌及其应用 |
| CN111424024A (zh) * | 2020-05-22 | 2020-07-17 | 扬州大学 | 一种低温纤维素酶的制备及使用方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101235401A (zh) * | 2007-02-02 | 2008-08-06 | 上海祥韦思化学品有限公司 | 发酵制备l-氨基酸的方法 |
| CN101243177A (zh) * | 2004-01-30 | 2008-08-13 | 味之素株式会社 | 生产l-氨基酸的微生物和生产l-氨基酸的方法 |
| CN103849581A (zh) * | 2013-12-27 | 2014-06-11 | 四川大学 | 一种花椒内生短杆菌及其筛选纯化方法和用途 |
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2014
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101243177A (zh) * | 2004-01-30 | 2008-08-13 | 味之素株式会社 | 生产l-氨基酸的微生物和生产l-氨基酸的方法 |
| CN101235401A (zh) * | 2007-02-02 | 2008-08-06 | 上海祥韦思化学品有限公司 | 发酵制备l-氨基酸的方法 |
| CN103849581A (zh) * | 2013-12-27 | 2014-06-11 | 四川大学 | 一种花椒内生短杆菌及其筛选纯化方法和用途 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 邓毛程: "《氨基酸发酵生产技术》", 31 January 2007 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109706096A (zh) * | 2019-01-04 | 2019-05-03 | 广东博沃特生物科技有限公司 | 一株具有脱氮和高效絮凝能力的耐寒短杆菌及其应用 |
| CN109706096B (zh) * | 2019-01-04 | 2023-04-14 | 广东博沃特生物科技有限公司 | 一株具有脱氮和高效絮凝能力的耐寒短杆菌及其应用 |
| CN111424024A (zh) * | 2020-05-22 | 2020-07-17 | 扬州大学 | 一种低温纤维素酶的制备及使用方法 |
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