CN103667073B - 蛇足石杉内生真菌及其在制备吡咯类护肝药中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蛇足石杉内生真菌，是从蕨类植物蛇足石杉植株活体的茎部分离获得，分类命名为(Peyronellaea？glomerata)HS-ZJUT-XW12，该菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年10月28日，保藏编号为CCTCC？M2012434。本发明提供的菌株，是本发明人经多年创造性实验劳动发现的菌株，首次用该菌株发酵培养，制备具有护肝活性的化合物FPBA；该制备方法具有发酵条件简单、菌种易培养、工艺步骤少、生产周期短等优势，具有工业化规模生产的潜力；为寻找开发吡咯类护肝药的来源提供了新途径，可在一定程度上缓解临床用药短缺的局面。

Description

蛇足石杉内生真菌及其在制备吡咯类护肝药中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种蛇足石杉内生真菌及其在制备吡咯类护肝药中的应用，即涉及一种微生物发酵法制备吡咯类护肝药的应用。

背景技术

目前，病毒性肝炎、酒精及药物中毒性肝病、各种肝损伤以及随之而来的肝纤维化、肝硬化、肝功能衰竭等疾病，已严重危害人类健康，且危害程度正在日益升级。恰当、有效地遴选护肝药物，不仅可迅速改善病人的临床症状与预后，且可为进一步的病因治疗奠定基础。尽管近年国内外相继开发了许多新一代保肝药物及其疗法，但至今仍然缺少低毒、高效的肝病防治药物。

天然产物作为药物先导化合物的丰富来源，近年来在新药发现中的地位和作用不断提升。部分天然产物表现出了抗病毒、改善和恢复肝功能、调节免疫以及抗肝纤维化等疗效，因此，从天然产物中寻找护肝药物是新药开发研究的重要途径之一。

有学者研究发现，来源于药用植物枸杞子和东北土当归的吡咯衍生物类天然产物4-[Formy1-5-(methoxymethyl)-1H-pyrrol-1-y1]butanoicacid(简称FPBA)，具有显著的护肝活性，且由于从药用植物中提取分离而来，故该化合物毒性较低；因此可用于开发成一种低毒、高效的护肝药物。FPBA的分子式为C₁₁H₁₅O₄N，结构式如下所示：

如上所述，现有的FPBA化合物，其制备方法多为从药用植物中提取分离，该技术方案的不足之处在于：①提取分离的反应条件复杂，制备步骤较多；②FPBA类化合物在植物中含量较低，从植物来源制备该类化合物成本高。③植物生长周期长，且受气候、天气等环境不确定因素影响较大，产量无法保证工业化规模生产的需求。

微生物发酵，是指利用微生物，在适宜的条件下，将原料经过特定的代谢途径转化为人类所需要的产物的过程。植物内生真菌指的是生活于植物体内而不引起植物病变的一类微生物，在与宿主协同进化的过程中，内生真菌的代谢也会受到宿主的调节，从而形成特殊的代谢途径。近年来的研究已经表明，植物内生真菌能产生类型多样、结构新颖的代谢产物，且能产生某些植物的特有的化学成分，在植物资源的替代方面有着独特的优势。

综上，如何寻找到一种合适的微生物，使其能够高效、量产化的获取化合物FPBA，并应用于开发吡咯类护肝药，是本领域技术人员急需攻克的技术难题。

发明内容

本发明区别于现有的植物提取分离法，另辟蹊径，以蛇足石杉内生真菌为筛选对象，经过大量的创造性实验，筛选得到菌株HS-ZJUT-XW12(鉴定为Peyronellaeaglomerata)，发酵培养该菌株，萃取发酵液得到具有护肝活性的化合物FPBA，解决了上述现有技术的缺陷。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案提供了一种蛇足石杉内生真菌，是从蕨类植物蛇足石杉(Huperziaserrata)植株活体的茎部分离获得，其分类命名为(Peyronellaeaglomerata)HS-ZJUT-XW12，该菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年10月28日，保藏编号为CCTCCM2012434，保藏单位地址为中国，武汉，武汉大学。

本发明所述的蛇足石杉内生真菌，基因组的ITS碱基序列为：

TTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCTAGAGTTGTAGGCTTTGCCTGCTATCTCTTACCCATGTCTTTTGAGTACCTTACGTTTCCTCGGCGGGTCCGCCCGCCGATTGGACAATTTAAACCATTTGCAGTTGCAATCAGCGTCTGAAAAAACTTAATAGTTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCTTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGTGTTTGTCTCGCCTCTGCGTGTAGACTCGCCTCAAAACAATTGGCAGCCGGCGTATTGATTTCGGAGCGCAGTACATCTCGCGCTTTGCACTCALAACGACGACGTCCAAAAG1ACATTTTTACACTCTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGG。

本发明所述的蛇足石杉内生真菌，菌株的固体培养特征为：

在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上，于28℃下培养，菌丝呈白色絮状，生长较缓慢、与培养基结合紧密；培养4～7天，菌落即铺满整皿，菌落呈土灰色、干燥、不透明、边缘不平整，背面呈浅黄色。

上述PDA培养基，通过如下方法制得：取200g马铃薯去皮、切块后，加1L水煮沸约30分钟，双层纱布过滤，取滤液加20g葡萄糖、18g琼脂溶解后，加水补足1L。

本发明还提供了一种蛇足石杉内生真菌(CCTCCM2012434)制备吡咯类护肝化合物的方法，包括如下步骤：

(1)挑取菌丝体接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基，28℃培养，使菌株活化；

(2)将活化好的菌株悬液接种于马铃薯葡萄糖液体培养基，28℃发酵培养，得菌液，该马铃薯葡萄糖液体培养基预先于121℃灭菌；

(3)抽滤菌液，分别收集菌丝体和发酵液；发酵液用萃取剂萃取，减压蒸馏、回收溶剂，得发酵液的提取物；

(4)取发酵液的提取物，依次进行大孔树脂吸附柱层析、硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、凝胶柱层析，最终纯化、洗脱，得终产物，即吡咯类护肝化合物FPBA。

优选的，步骤(2)中发酵培养的条件为：温度28℃、180转/分钟的转速下振荡培养6天后静置培养14天。

优选的，步骤(3)中的萃取剂为乙酸乙酯。

本发明还提供了一种蛇足石杉内生真菌(CCTCCM2012434)在制备吡咯类护肝药中的应用，即用如前所述的蛇足石杉内生真菌，经微生物发酵，可制得具有护肝活性的吡咯类衍生物FPBA，用于开发吡咯类护肝药物。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供的保藏编号为CCTCCM2012434的蛇足石杉内生真菌，是本发明人经多年创造性实验劳动发现的一种菌株，还是世界上首次用该菌株发酵培养，制备具有护肝活性的化合物FPBA，并用于开发低毒、高效的吡咯类护肝药；该制备方法具有发酵条件简单、菌种易培养、工艺步骤少、生产周期短等优势，具有工业化规模生产的潜力；为寻找开发吡咯类护肝药的来源提供了新途径，可在一定程度上缓解临床用药短缺的局面。

附图说明

图1为本发明蛇足石杉内生真菌(Peyronellaeaglomerata)HS-ZJUT-XW12

的菌落形态。

图2为采用本发明方法制得的化合物FPBA的氢谱谱图。

图3为采用本发明方法制得的化合物FPBA的碳谱谱图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但不限定本发明。下列实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。

实施例1蛇足石杉内生真菌(Peyronellaeaglomerata)HS-ZJUT-XW12的分离

(1)样品的采集

样品为2007年9月自中科院云南西双版纳热带植物园采集的蛇足石杉(Huperziaserrata)植株。

(2)菌株的分离

用自来水将植物的表皮及根部洗净，将洗净的植物样品浸入装有75％乙醇的容器中，2min后取出，并以无菌水冲洗3-5次，再浸入装有0.1％升汞水溶液的容器中，维持一定时间1min后取出，用大量无菌水冲洗除去残留升汞溶液。在无菌操作条件下，用灭菌的镊子和刀片将蛇足石杉茎的外表皮剥去，再切成0.3cm×0.3cm大小的组织片种植于PDA培养基上，于28℃暗培养3-7天。同时将表面消毒过的蛇足石杉茎不做剥皮及切割，在PDA培养基上反复滚动数次后，同条件培养作为对照观察。

培养4天后，见组织片断面边缘有菌丝生长后，即挑取前端菌丝转入PDA平板培养基上培养，待菌落出现后，根据菌落的形态、颜色的差异及菌落长出时间的不同，分别挑取培养基边缘的菌丝接种于新的PDA培养基上进行分离培养，直至筛选出单一的菌落，接入PDA培养基斜面，28℃暗培养4-7天后，转至4℃冰箱内保存备用。

如图1所示，培养起初，菌丝呈白色絮状，生长较缓慢、与培养基结合紧密；培养4～7天，菌落即铺满整皿，菌落呈土灰色、干燥、不透明、边缘不平整，背面呈浅黄色。

实施例2蛇足石杉内生真菌(Peyronellaeaglomerata)HS-ZJUT-XW12的分子生物学鉴定

(1)DNA的提取

取培养6天的发酵液，离心收集菌丝体，将菌丝用液氮冷冻研磨后，用SK1375基因组DNA提取试剂盒(厂家：生工生物工程(上海)有限公司)提取基因组DNA，进行琼脂糖凝胶电泳。

(2)ITS区序列的PCR扩增

引物序列为：ITS1：5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’；ITS4：5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’。

PCR体系(50μL)构成为：Template(基因组)10pmo1，Primer1(10μM)1μL，Primer2(10μM)1μL，dNTPmix(10Mmeach)1μL，10×TaqreactionBuffer5μL，Taq(5U／μL)0.25μL，加水至50μL。

PCR程序设定为：98℃预变性5min，95℃变性35s，55℃复性35s，72℃延伸40s，35个循环，最后72℃延伸8min。由PCR产物电泳结果切割所需DNA目的条带，经UNIO-10柱式DNA凝胶回收试剂盒(厂家：生工生物工程(上海)有限公司)纯化。

纯化产物由生工生物工程(上海)有限公司测序，测得ITS碱基序列为：

TTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCTAGAGTTGTAGGCTTTGCCTGCTATCTCTTACCCATGTCTTTTGAGTACCTTACGTTTCCTCGGCGGGTCCGCCCGCCGATTGGACAATTTAAACCATTTGCAGTTGCAATCAGCGTCTGAAAAAACTTAATAGTTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCTTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGTGTTTGTCTCGCCTCTGCGTGTAGACTCGCCTCAAAACAATTGGCAGCCGGCGTATTGATTTCGGAGCGCAGTACATCTCGCGCTTTGCACTCATAACGACGACGTCCAAAAGTACATTTTTACACTCTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGG

(3)数据处理

序列数据在美国国立生物信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformationUSA，NCBI)的Genbank中进行同源序列搜索比对，分析其同源性。将上述序列与GenBank中的序列比较，鉴定该菌株为(Peyronellaeaglomerata)。

实施例3利用蛇足石杉内生真菌(Peyronellaeaglomerata)HS-ZJUT-XW12发酵制备FPBA

(1)菌株活化

马铃薯葡萄糖琼脂培养基：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，水1000mL，制成试管斜面，挑取菌丝体接种于试管斜面上，28℃培养7天；

(2)菌株发酵

马铃薯葡萄糖液体培养基：去皮马铃薯200g(切成约2cm²的小块)，放入烧杯中煮沸30min，然后用双层纱布过滤，取滤液加入20g葡萄糖，加水定容至1000mL。

将步骤(1)中制备好的蛇足石杉内生真菌(Peyronellaeaglomerata)HS-ZJUT-XW12菌株悬液(孢子浓度为1×10⁶个／mL)1mL接种于250mL三角瓶(瓶中装有125mL马铃薯葡萄糖液体培养基，已于121℃灭菌)中，于28℃、180转／分钟振荡培养6天后静置培养14天，得到菌液。

(3)菌液的提取

将菌液用抽滤器抽滤两次，分别收集菌丝体和发酵液。发酵液用等体积的乙酸乙酯(萃取剂)萃取，取萃取液；萃余液用等体积的乙酸乙酯(萃取液)萃取，取萃取液；反复萃取5次，合并萃取液，减压蒸馏、回收溶剂，得发酵液的乙酸乙酯提取物。

(4)发酵液提取物的分离纯化

发酵液提取物先以MCI大孔树脂进行柱层析(4.0×60em)，以甲醇：水＝1∶1→1：0洗脱，按份收集，通过薄层色谱检测，合并相同的流分，得S1(1.0g)，S2(438.6mg)，S3(746.9mg)，S4(6.5g)四个组分。S1以石油醚：丙酮：甲酸体系(6：1：0.01)进行硅胶柱层析(3.0×60cm，薄层层析硅胶)分离得S1A(256mg)；S1A继续进行反相柱层析(ODSC18)，以甲醇：水＝3：7→7：3梯度洗脱得S1A1(47.6mg)。S1A1以凝胶柱层析(toyopear1HW-40C)作最终纯化，以甲醇洗脱，得FPBA(10.6mg)。

产物FPBA呈白色粉末状，溶于甲醇，丙酮及氯仿。有紫外，硫酸乙醇显色剂显灰色。

薄层色谱中，以石油醚：丙酮：甲酸＝4：1∶0.01为展开剂，展开R_f值约为0.2。

(5)FPBA的结构鉴定

通过应用质谱、核磁共振波谱等技术，并与文献数据(ChinYW,LimSWKimAH，ShinDY，SuhTG，KimYB，KimYCandKimJ.Bioorg.Med.Chem.，2003，13，79-81)比对，确定化合物为FPBA。

如图2所示，本发明制得的FPBA，氢谱数据如下：δ_H2.06(2H，m，H-2′)，2.43(2H，t，J＝7.0，H-3′)，3.36(3H，s，OCH₃)，4.40(2H，t，J＝7.5Hz，H-1′)，4.45(2H，s，H-6)，6.24(1H，d，J＝4.0Hz，H-4)，6.88(1H，d，J＝4.0Hz，H-3)，9.50(1H，s，CHO)。

如图3所示，本发明制得的FPBA，碳谱数据如下：δ_C26.1(C-2′)，30.7(C-3′)，44.7(C-1′)，58.0(OCH₃)，65.5(C-6)，111.8(C-4)，124.4(C-3)，132.6(C-2)，138.9(C-5)，177.7(COOH)，179.6(CHO)。

此外，质谱显示其准分子离子峰为ESI-MSm/z：226.1[M+H]⁺，综合分析可知：本发明制得的FPBA分子式为C₁₁H₁₅O₄N，与文献一致。

Claims (8)

1.一种蛇足石杉内生真菌，是从蕨类植物蛇足石杉植株活体的茎部分离获得，其分类命名为PeyronellaeaglomerataHS-ZJUT-XW12，该菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年10月28日，保藏编号为CCTCCM2012434，保藏单位地址为中国，武汉，武汉大学。

2.根据权利要求1所述的蛇足石杉内生真菌，其特征在于，菌株的ITS碱基序列为：

TTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCTAGAGTTGTAGGCTTTGCCTGCTATCTCTTACCCATGTCTTTTGAGTACCTTACGTTTCCTCGGCGGGTCCGCCCGCCGATTGGACAATTTAAACCATTTGCAGTTGCAATCAGCGTCTGAAAAAACTTAATAGTTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCTTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGTGTTTGTCTCGCCTCTGCGTGTAGACTCGCCTCAAAACAATTGGCAGCCGGCGTATTGATTTCGGAGCGCAGTACATCTCGCGCTTTGCACTCATAACGACGACGTCCAAAAGTACATTTTTACACTCTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGG。

3.根据权利要求1所述的蛇足石杉内生真菌，其特征在于，菌株的固体培养为：在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上，于28℃下培养，菌丝呈白色絮状，生长较缓慢、与培养基结合紧密；培养4～7天，菌落即铺满整皿，菌落呈土灰色、干燥、不透明、边缘不平整，背面呈浅黄色。

4.根据权利要求3所述的蛇足石杉内生真菌，其特征在于，所述的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，通过如下方法制得：取200g马铃薯去皮、切块后，加1L水煮沸约30分钟，双层纱布过滤，取滤液加20g葡萄糖、18g琼脂溶解后，加水补足1L。

5.一种用如权利要求1～4任一项所述的蛇足石杉内生真菌制备护肝化合物FPBA的方法，包括如下步骤：

(1)挑取菌丝体接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基，28℃培养，使菌株活化；

(2)将活化好的菌株悬液接种于马铃薯葡萄糖液体培养基，28℃发酵培养，得菌液，该马铃薯葡萄糖液体培养基预先于121℃灭菌；

(3)抽滤菌液，分别收集菌丝体和发酵液；发酵液用萃取剂萃取，减压蒸馏、回收溶剂，得发酵液的提取物；

(4)取发酵液的提取物，依次进行大孔树脂吸附柱层析、硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、凝胶柱层析，最终纯化、洗脱，得终产物。

6.根据权利要求5所述的用蛇足石杉内生真菌制备护肝化合物FPBA的方法，其特征在于，步骤(2)中发酵培养的条件为：温度28℃、180转/分钟的转速下振荡培养6天后静置培养14天。

7.根据权利要求6所述的用蛇足石杉内生真菌制备护肝化合物FPBA的方法，其特征在于，步骤(3)中的萃取剂为乙酸乙酯。

8.一种如权利要求1～4任一项所述的蛇足石杉内生真菌在制备以FPBA为活性成分的吡咯类护肝药中的应用。