CN103655215A - 具有抑制酪氨酸酶活性和清除自由基活性的拟青霉提取物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及具有抑制酪氨酸酶活性和清除自由基活性的拟青霉提取物及其用途。所述拟青霉提取物中含有30.0-99.0%拟青霉酮，拟青霉酮包括拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C。拟青霉提取物对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）为13.5～37.7μg/mL；对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）为105.5～196.1μg/mL。拟青霉提取物纯化品抑制酪氨酸酶的活性和清除自由基的活性都远强于目前广泛用于化妆品的熊果苷，拟青霉提取物纯化品作为日用化学品的添加剂，具有增白、抗氧化、抗老化、保鲜、杀菌、消炎作用。
Description
技术领域
本发明属于生物制品的提取制备技术领域，涉及具有酪氨酸酶抑制活性和自由基清除活性的拟青霉酮（包括拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C）提取、纯化和应用。
背景技术
拟青霉酮是从一种拟青霉(Paecilomyces sp.)培养物中分离制备得到的具有抑制酪氨酸酶活性和清除自由基活性的生物活性物质。
拟青霉(Paecilomyces sp.)为麦角菌科(Clavicipitaceae)虫草属（Cordyceps）的真菌；在我国常见的有蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae)、细脚拟青霉（Paecilomyces tenuip）、古尼拟青霉（Paecilomyces gunnii）和蛹拟青霉（Paecilomyces militari）等。其中蛹拟青霉感染昆虫后形成的虫菌复合体为蛹虫草（Cordyceps militari）被称作北虫草，并作为冬虫夏草的代用品，具有重要经济价值。上述菌种都可从被拟青霉感染的昆虫上分离得到或从土壤中分离得到。抑制酪氨酸酶活性：酪氨酸酶兼有加氧酶和氧化酶的双重功能，在黑色素合成过程中起关键作用。它能够把单酚催化成二酚，并把二酚氧化成醌；醌在非酶促条件下形成最终的反应产物黑色素。具有抑制酪氨酸酶活性的生物活性物质可通过抑制酪氨酸酶活性而抑制黑色素生成，因而可用来预防和治疗色素沉着和黑色素瘤等，在医药和日用化学品等领域有着广阔的应用前景。
清除自由基活性：自由基（free radical），从化学结构上看是指含未配对电子的基团、原子或分子。自由基具有高度化学活性。对于生命体来说，自由基是生命活动中多种生化反应的中间产物。在正常情况下，人体内的自由基是处于产生与清除的动态平衡之中。自由基是机体有效的防御系统，如不能维持一定水平的自由基则会对机体生命活动带来不利影响。但自由基产生过多或清除过慢，它通过攻击生命大分子物质及各种细胞器，会造成机体分子水平、细胞水平及组织器官水平的各种损伤，加速机体的衰老进程并诱发各种疾病。最新的研究表明，人类的衰老及许多疾病都与自由基损伤有关。具有清除自由基活性的物质能与自由基反应并使之还原成非自由基化合物，可清除机体代谢过程中产生的过多的自由基，是一种可增进人体健康的重要活性物质。自由基清除剂在非生命体系中有抗氧化作用，能够有效地阻止物质的氧化败坏，对于延长物品的保质期有着重要作用，被广泛用于食品、药品、日用化学品等中。
发明内容
为寻找新型天然高效的具有酪氨酸酶抑制活性和清除自由基活性的物质，发明人通过对中国 的100余株昆虫病原真菌代谢物进行活性研究，发现了从拟青霉中提取的拟青霉提取物具有很强的抑制酪氨酸酶活性和清除自由基活性的作用。
本发明所述拟青霉提取物中含有30.0-99.0%拟青霉酮，所述拟青霉酮包括拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C，三者的结构式见下式：
所述拟青霉酮中拟青霉酮A的含量为10.0～20.0%，拟青霉酮B的含量为10.0～30.0%，拟青霉酮C的含量为50.0～80.0%。
具有抑制酪氨酸酶活性和清除自由基活性的拟青霉提取物的用途：所述拟青霉提取物在制备具有抑制酪氨酸酶活性和清除自由基活性的日用化学品中的应用。
所述拟青霉提取物具有以下特性：（1）对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）为：13.5～37.7μg/mL；对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）为：105.5～196.1μg/mL；（2）从拟青霉提取物中纯化出来的拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）分别为：13.3～29.1μg/mL、16.8～40.6μg/mL和10.3～20.2μg/mL；拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）分别为：93.5～165.3μg/mL、161.4～265.5μg/mL和61.5～113.6μg/mL。
制备所述拟青霉提取物方法的具体操作步骤如下：
1）拟青霉（Paecilomyces sp.）菌种选择
所用的拟青霉（Paecilomyces sp.）为蝉拟青霉（Paecilomyces cicadae）或古尼拟青霉（Paecilomyces gunnii）或蛹拟青霉（Paecilomyces militari）；
2）菌株培养
培养方法为液固混合培养，具体工序如下：
2.1）斜面种子培养
将保藏的拟青霉菌株接种于萨氏（SDAY）斜面培养基，于20～30℃恒温、培养4～7d，得到一级菌种；
2.2）二级液体种子培养
将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养；
液体摇瓶培养基：葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸出粉10g/L，蒸馏水定容；
在大于等于100ml三角瓶中加入30～50%三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种1～3支斜面菌种，接种后置于全温振荡培养箱，温度20～30℃、转速100～200rpm，培养3～7d，即得到二级菌种；
2.3）三级液体种子培养
将二级菌种接种到大于等于10L的发酵罐，装液量为罐体积的50～80%，接种量5～10%，通气量按体积比1:1（v/v），压力0.1MPa，20～30℃恒温通气培养2～5天，得到三级菌种；发酵罐中的培养基同液体摇瓶培养基；
2.4）固体培养
将三级液体菌种拌入固体培养基中，接种量为固体料量的5～10%，20～30℃恒温通气培养10～20天，得到发酵物；所述固体培养基为蒸煮过的大米或小麦，蒸煮后的大米或小麦含水率为40～80%；
3）培养物中有效成分的提取和精制
3.1）培养物的预处理
将固体培养物在30～150℃干燥到含水率小于等于20%，然后粉碎到20～120目，用乙醇提取；料液比为1:1～5、提取时间为1～48小时；提取结束后在转速大于等于1000转/分钟条件下离心，或真空抽滤；滤液在温度小于等于100℃浓缩到原体积的1/2～1/10，得到浓缩脱醇液，同时回收乙醇，浓缩液用于进一步的色谱法精制；
3.2）提取物的制备和精制
3.2.1）拟青霉提取物的制备
将前述乙醇提取物经过逆流色谱法初步纯化，得到拟青霉提取物；逆流色谱法的溶剂系统按体积比为正己烷：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=3～5：4～6：2～4：0～1：4～6；每5分钟收集一管；合并含有拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C的收集管；在小于等于100℃温度下将收集物浓缩到到原体积的1/2～1/10，并将浓缩物在不高于170℃条件下干燥得到拟青霉提取物；
不同批次拟青霉提取物外观为浅黄绿色到棕黄色；经高效液相分析发现各批次拟青霉提取物中含拟青霉酮30.0～99.0%；总拟青霉酮中，拟青霉酮A占10.0～20.0%，拟青霉酮B占10.0～30.0%，拟青霉酮C占50.0～80.0%；各成分的结构式如下：
活性测定结果显示不同批次提取物对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）为：13.5～37.7μg/mL；对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）为：105.5～196.1μg/mL；
3.2.2）拟青霉提取物的进一步纯化
逆流色谱方法纯化
具体步骤如下：采用两次分离法，第一次的溶剂系统按体积比为正己烷：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=3～5：4～6：2～4：0～1：4～6，此时只可单独按峰收集拟青霉酮C峰，得到纯度较高的拟青霉酮C溶液；将该组分在小于等于100℃温度下浓缩到到原体积的1/2～1/10，并将浓缩物在不高于170℃条件下干燥得到黄色拟青霉酮C粉末；经高效液相分析发现各批次拟青霉酮C的纯度为80.0～99.9%；拟青霉酮C结构如下：
活性测定结果显示不同批次拟青霉酮C对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）为：10.3～20.2μg/mL；对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）为：61.5～113.6μg/mL；
在收集拟青霉酮C峰的同时，收集拟青霉酮C峰前后5～20min内的峰及拟青霉酮A和拟青霉酮B峰，合并收集物并浓缩到原进样体积后进行第二次分离，第二次分离的溶剂体系按体积比为：正己烷：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=2～4：4～6：2～3：0～1：4～6，此时可以收集到纯度较高的拟青霉酮A和拟青霉酮B溶液；将收集的目标组分在小于等于100℃温度下浓缩到到原体积的1/2～1/10，并将浓缩物在不高于170℃条件下干燥，得到拟青霉酮A和拟青霉酮B，拟青霉酮A为浅黄绿色到黄色粉末，拟青霉酮B为黄色粉末；经高效液相分析发现各 批次拟青霉酮B和C的纯度分别都为80.0～99.9%；其结构见下式：
拟青霉酮A和拟青霉酮B对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）分别为：13.3～29.1μg/mL和16.8～40.6μg/mL；
拟青霉酮A和拟青霉酮B对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）分别为：93.5～165.3μg/mL和161.4～265.5μg/mL；
反相色谱方法纯化
固定相为键合相填料，所述键合相填料为反相碳十八填料即RPC18，颗粒直径为5～50微米,色谱柱直径和流动相流速可视生产规模来定；用乙醇或甲醇和水按0～100：100～0配比进行梯度洗脱，总洗脱体积为色谱柱体积的50到200倍；按峰收集拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C；收集物在小于等于100℃温度以下浓缩到粘稠状，在低于170℃条件下干燥；分别可得到：拟青霉酮A黄绿色粉末、拟青霉酮B黄色粉末和拟青霉酮C黄色粉末；其纯度都为80.0～99.9%；其结构如下：
从拟青霉提取物中纯化出来的拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）分别为：13.3～29.1μg/mL、16.8～40.6μg/mL和10.3～20.2μg/mL；拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）分别为：93.5～165.3μg/mL、161.4～265.5μg/mL和61.5～113.6μg/mL；这些拟青霉提取物纯化品抑制酪氨酸酶的活性和清除自由基的活性都远强于目前广泛用于化妆品的熊果苷，拟青霉提取物纯化品作为日用化学 品的添加剂，具有增白、抗氧化、抗老化、保鲜、杀菌、消炎作用。
本发明的分析研究说明如下：
1、筛选研究发现一株拟青霉（Paecilomyces sp.）菌丝的乙醇提取物具有较强的酪氨酸酶抑制活性和清除自由基清活性：
（1）乙醇提取物对酪氨酸酶的抑制活性测定：配制提取物浓度为0.03、0.06、0.12、0.24、0.48和0.96mg/ml甲醇溶液，以L-酪氨酸为底物，进行酪氨酸酶抑制试验，经计算得出提取物对酪氨酸酶的半数抑制浓度IC50小于150.0μg/ml；
（2）乙醇提取物的清除自由基活性测定：配制提取物样品浓度为0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mg/ml甲醇溶液，于517nm下测定其对1mmol/L的DPPH自由基的清除活性，经计算得出其DPPH自由基的半数清除浓度小于800μg/ml；
但是，由于乙醇提取物有效成分含量较低，其生物活性低于目前市场上常用的熊果苷（Arbutin），熊果苷对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）为53.8μg/mL，对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）为326.5μg/mL。因此乙醇提取物没有实际应用价值，需要进行有效成分的进一步提取和纯化。
2、用逆流色谱的方法对乙醇提取物进行了进一步处理，得到权利要求中所说的拟青霉提取物，和三个具有生物活性的纯化物，即拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C，其生物活性如下：
（1）拟青霉提取物及其纯化物对酪氨酸酶的抑制活性测定：配制拟青霉提取物及其纯化物样品浓度为10.0、20.0、40.0、80.0和160.0μg/mL甲醇溶液，以L-酪氨酸为底物，进行酪氨酸酶抑制试验，经计算得出：不同批次拟青霉提取物对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）为：13.5～37.7μg/mL。提取物纯化得到的拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）分别为：13.3～29.1μg/mL、16.8～40.6μg/mL和10.3～20.2μg/mL。拟青霉提取物及其纯化物对酪氨酸酶的抑制活性都远强于目前广泛用于化妆品的熊果苷（Arbutin）。在同样条件下熊果苷纯品对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）为53.8μg/mL。
（2）拟青霉提取物及其纯化物的清除自由基活性测定：配制拟青霉提取物及其纯化物样品浓度为25.0、50.0、100.0、200.0、400.0μg/mL甲醇溶液，于517nm下测定其对1mmol/L的DPPH自由基的清除活性，经计算得出：不同批次拟青霉提取物对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）为：105.5～196.1μg/mL。提取物纯化得到的拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）分别为：93.5～165.3μg/mL、161.4～265.5μg/mL和61.5～113.6μg/mL。
拟青霉提取物及其纯化物的清除自由基活性都强于目前广泛用于化妆品的熊果苷（Arbutin）。在同样条件下熊果苷纯品对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）为326.5μg/mL。
3、活性化合物的化学结构分析
高分辨液质联用分析显示化合物1（拟青霉酮A）正离子288.08624(M+H)、负离子286.07516(M-H)，计算出的分子式为C15H13NO5；化合物2（拟青霉酮B）正离子287.05486(M+H)、负离子285.04307(M-H)，计算出的分子式为C15H10O6；化合物3（拟青霉酮C）正离子289.07083(M+H)、负离子287.05868(M-H)，计算出的分子式为C15H12O6。
核磁共振分析数据见下表。
综合液质联用分析和核磁共振分析得出拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C的化学结构见下式：
本发明的有益技术效果体现在下述几个方面：
1、本发明方法制备的拟青霉提取物及其纯化物具有抑制酪氨酸酶和清除自由基活性，开拓了拟青霉的一个新的应用领域。本发明制备的具有酪氨酸酶抑制和清除自由基活性的拟青霉提取物及其纯化物，包括拟青霉提取物和拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C单体，它们对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）平均分别为：25.6μg/mL、21.2μg/mL、28.7μg/mL和15.3μg/mL；它们对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）平均分别为：158.3μg/mL、129.4μg/mL、213.5μg/mL和87.6μg/mL。本发明的拟青霉提取物及其纯化物对酪氨酸酶的抑制活性和清除自由基活性都远强于目前广泛用于化妆品的熊果苷（Arbutin）。
2、本发明制备的酪氨酸酶抑制剂和自由基清除剂用途广泛，可作为日用化学品添加剂，起增白、抗氧化、抗老化、保鲜、杀菌、消炎等作用。由于拟青霉提取物及其纯化物对酪氨酸酶的抑制活性和清除自由基活性远强于目前广泛用于化妆品的熊果苷，因此以之代替熊果苷应用于化妆品会有更好的增白、抗氧化和抗老化效果。
3、本发明由于采取微生物发酵生产，不受环境和资源影响，易实现工业化、自动化，不受环境和自然资源的影响。而目前广泛用于化妆品的熊果苷是从杜鹃花科植物熊果中提取，成本高，生产受自然环境影响大，可见本发明具有很多优势。
4、按本发明工艺方法生产的产品成本低，工艺简便、工艺稳定、易调控、成功率高。
5、本发明生产设备投资可大可小，生产灵活，适合多种规模的企业投资。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步地描述。
实施例1：
包括以下操作步骤：
1.1拟青霉菌种选择
所选用的拟青霉为蝉拟青霉（Paecilomyces cicadae）。
1.2菌株培养
养方法采用液固混合培养工艺。具体工艺方法如下：
1.2.1斜面种子培养
将保藏的拟青霉菌株接种于萨氏（SDAY）斜面培养基，于20℃恒温、培养4d，得到一级菌种；
1.2.2二级液体种子培养
将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养。
液体摇瓶培养基：葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸出粉10g/L，蒸馏水定容；
在100ml三角瓶中加入30%三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种1支斜面菌种，接种后置于全温振荡培养箱，温度20℃、转速100rpm，培养3d，即得到二级菌种。
1.2.3三级液体种子培养
将二级菌种接种到10L的发酵罐，装液量为罐体积的50%，接种量5%，通气量按体积比1:1（v/v），压力0.1MPa，20℃恒温通气培养2天，得到三级菌种；
发酵罐中的培养基同液体摇瓶培养基；
1.2.4固体培养
将三级液体菌种拌入固体培养基中，接种量为固体料量的5%，20℃恒温通气培养10天，得到发酵物；
培养基为蒸煮过的大米或小麦。蒸煮后的大米或小麦含水率为40%。
1.3培养物中有效成分的提取和精制
1.3.1、培养物预处理
将固体培养物在30℃干燥到含水率10%，然后粉碎到20目，用乙醇提取。料液比为1:1。提取时间为1小时。提取结束后在转速1000转/分钟条件下离心，或真空抽滤。滤液在温度40℃浓缩到原体积的1/2，得到浓缩脱醇液，同时回收乙醇，浓缩液用于进一步的色谱法精制；
1.3.2提取物的制备
将前述乙醇提取物经过逆流色谱法初步纯化，得到拟青霉提取物。逆流色谱法的溶剂系统为正己烷：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=3：4：2：0：4(V/V/V//V/V)；每5分钟收集一管；合并含有拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C的收集管；在40℃温度下将收集物浓缩到到原体积的1/2，并将浓缩物在30℃条件下干燥，得到拟青霉提取物。
拟青霉提取物外观为黄色。经高效液相分析发现各批次拟青霉提取物中含拟青霉酮总量为30.0%；总拟青霉酮中，拟青霉酮A占10.0%，拟青霉酮B占10.0%，拟青霉酮C占80.0%。各成分的结构式如下：
活性测定结果显示提取物对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）为：13.5μg/mL。对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）为：105.5μg/mL。该拟青霉提取物对酪氨酸酶的抑制活性和清除自由基活性都远强于目前广泛用于化妆品的熊果苷，可以用于日用化学品添加剂，起增白、抗氧化、抗老化、保鲜、杀菌、消炎等作用。
1.3.3拟青霉提取物的进一步纯化
逆流色谱方法纯化
具体步骤如下：采用两次分离法。第一次的溶剂系统为正己烷：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=3：4：2：0：4(V/V/V//V/V)，此时只可单独按峰收集拟青霉酮C峰，得到纯度较高的拟青霉酮C溶液。将该组分在40℃温度下浓缩到到原体积的1/2，并将浓缩物在4℃条件下干燥得到黄色拟青霉酮C粉末。经高效液相分析发现各批次拟青霉酮C的纯度为80.0%。拟青霉酮C结构如下：
活性测定结果显示拟青霉酮C对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）为：10.3μg/mL；对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）为：61.5μg/mL。该拟青霉提取物纯化品对酪氨酸酶的抑制活性和清除自由基活性都远强于目前广泛用于化妆品的熊果苷，可以用于日用化学品添加剂，起增白、抗氧化、抗老化、保鲜、杀菌、消炎等作用。
在收集拟青霉酮C峰的同时，收集拟青霉酮C峰前后20min内的峰（包含拟青霉酮A峰和拟青霉酮B峰及部分拟青霉酮C峰），浓缩到原进样体积后进行第二次分离，第二次分离选择的溶剂体系为：正己烷：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=2：4：2：0：4(V/V/V//V/V)，此时可以收集到纯度较高的拟青霉酮A和拟青霉酮B溶液。将收集的目标组分在40℃温度下浓缩到到原体积的1/2，并将浓缩物在30℃条件下干燥，得到拟青霉酮A和拟青霉酮B。拟青霉酮A为浅黄绿色到黄色粉末。拟青霉酮B为黄色粉末。经高效液相分析发现拟青霉酮B和拟青霉酮C的纯度分别都为80.0%。其结构见下式：
拟青霉酮A和拟青霉酮B对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）分别为：13.3μg/mL和16.8μg/mL。拟青霉酮A和拟青霉酮B对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）分别为：93.5μg/mL和161.4μg/mL。这些拟青霉提取物纯化品对酪氨酸酶的抑制活性和清除自由基活性都远强于目前广泛用于化妆品的熊果苷，可以用于日用化学品添加剂，起增白、抗氧化、抗老化、保鲜、杀菌、消炎等作用。
反相色谱方法纯化
固定相为键合相填料，所述键合相填料为反相碳十八填料即RPC18，颗粒直径为5微米,色谱柱直径和流动相流速可视生产规模来定。用乙醇或甲醇和水按0～100：100～0配比进行梯度洗脱，总洗脱体积为色谱柱体积的50倍；按峰收集拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C；收集物在40℃温度以下浓缩到粘稠状，在30℃条件下干燥；分别可得到：拟青霉酮A黄绿色粉末、拟青霉酮B黄色粉末和拟青霉酮C黄色粉末。其纯度都为80.0%。其结构如下：
从拟青霉提取物中纯化出来的拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）分别为：13.3μg/mL、16.8μg/mL和10.3μg/mL；拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）分别为：93.5μg/mL、161.4μg/mL和61.5μg/mL。这些拟青霉提取物纯化品对酪氨酸酶的抑制活性和清除自由基活性都远强于目前广泛用于化妆品的熊果苷，可以用于日用化学品添加剂，起增白、抗氧化、抗老化、保鲜、杀菌、消炎等作用。
实施例2：
包括以下操作步骤：
2.1拟青霉菌种选择
所用的拟青霉为古尼拟青霉（Paecilomyces gunnii）。
2.2拟青霉菌株培养
培养方法为液固混合培养，具体工序如下：
2.2.1斜面种子培养
将保藏的拟青霉菌株接种于萨氏（SDAY）斜面培养基，于30℃恒温、培养7d，得到一级菌种；
2.2.2二级液体种子培养
将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养；
液体摇瓶培养基：葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸出粉10g/L，蒸馏水定容；
在1000ml三角瓶中加入50%三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种3支斜面菌种，接种后置于全温振荡培养箱，温度30℃、转速200rpm，培养7d，即得到二级菌种。
2.2.3三级液体种子培养
将二级菌种接种到100L的发酵罐，装液量为罐体积的80%，接种量10%，通气量按体积比1:1（v/v），压力0.1MP，30℃恒温通气培养5天，得到三级菌种；
发酵罐中的培养基同液体摇瓶培养基；
2.2.4固体培养
将三级液体菌种拌入固体培养基中，接种量为固体料量的10%，30℃恒温通气培养20天，得到发酵物；所述固体培养基为蒸煮过的大米或小麦，蒸煮后的大米或小麦含水率为80%；
2.3培养物中有效成分的提取和精制
2.3.1培养物的预处理
将固体培养物在150℃干燥到含水率20%，然后粉碎到120目，用乙醇提取。料液比为1:5。提取时间为48小时。提取结束后在转速10000转/分钟条件下离心，或真空抽滤。滤液在温度100℃浓缩到原体积的1/10，得到浓缩脱醇液，同时回收乙醇，浓缩液用于进一步的色谱法精制；
2.3.2提取物的制备
将前述乙醇提取物经过逆流色谱法初步纯化，得到权利要求1所述拟青霉提取物。逆流色谱法的溶剂系统为正己烷：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=5：6：4：1：6(V/V/V//V/V)；每5分钟收集一管；合并含有青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C的收集管；在100℃温度下将收集物浓缩到到原体积的1/10，并将浓缩物在170℃条件下干燥得到权利要求1所述拟青霉提取物。
不同批次提取物外观为浅黄绿色到棕黄色。经高效液相分析发现各批次提取物中含拟青霉酮99.0%；总拟青霉酮中，拟青霉酮A占20.0%，拟青霉酮B占30.0%，拟青霉酮C占50.0%。各成分的结构式如下：
活性测定结果显示不同批次提取物对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）为：37.7μg/mL。对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）为：196.1μg/mL。该拟青霉提取物对酪氨酸酶的抑制活性和清除自由基活性都远强于目前广泛用于化妆品的熊果苷，可以用于日用化学品添加剂，起增白、抗氧化、抗老化、保鲜、杀菌、消炎等作用。
2.3.3拟青霉提取物的进一步纯化
逆流色谱方法纯化
具体步骤如下：采用两次分离法。第一次的溶剂系统为正己烷：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=5：6：4：1：6(V/V/V//V/V)，此时只可单独按峰收集拟青霉酮C峰，得到纯度较高的拟青霉酮C溶液。将该组分在100℃温度下浓缩到到原体积的1/10，并将浓缩物在170℃条件下干燥得到黄色拟青霉酮C粉末。经高效液相分析发现各批次拟青霉酮C的纯度为99.9%。拟青霉酮C结构如下：
活性测定结果显示不同批次拟青霉酮C对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）分别为：20.2μg/mL；对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）分别为：113.6μg/mL。该拟青霉提取物纯化品对酪氨酸酶的抑制活性和清除自由基活性都远强于目前广泛用于化妆品的熊果苷，可以用于日用化学品添加剂，起增白、抗氧化、抗老化、保鲜、杀菌、消炎等作用。
在收集拟青霉酮C峰的同时，收集拟青霉酮C峰前后5～20min内的峰及拟青霉酮A和拟青霉酮B峰，合并收集物并浓缩到原进样体积后进行第二次分离，第二次分离选择的溶剂体系为：正己烷：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=4：6：3：1：6(V/V/V//V/V)，此时可以收集到纯度较高的拟青霉酮A和拟青霉酮B溶液。将收集的目标组分在低于100℃温度下浓缩到到原体积的1/10，并将浓缩物在160℃条件下干燥，得到拟青霉酮A和拟青霉酮B。拟青霉酮A为浅黄绿色到黄色粉末。拟青霉酮B为黄色粉末。经高效液相分析发现各批次拟青霉酮B和C的纯度分别都为99.9%。其结构见下式：
拟青霉酮A和拟青霉酮B对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）分别为：29.1μg/mL和40.6μg/mL。拟青霉酮A和拟青霉酮B对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）分别为：165.3μg/mL和265.5μg/mL。这些拟青霉提取物纯化品对酪氨酸酶的抑制活性和清除自由基活性都远强于目前广泛用于化妆品的熊果苷，可以用于日用化学品添加剂，起增白、抗氧化、抗老化、保鲜、杀菌、消炎等作用。
反相色谱方法纯化
固定相为键合相填料，所述键合相填料为反相碳十八填料即RPC18，颗粒直径为50微米,色谱柱直径和流动相流速可视生产规模来定。用乙醇或甲醇和水按0～100：100～0配比进行梯度洗脱，总洗脱体积为色谱柱体积的200倍；按峰收集拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C；收集物在100℃温度以下浓缩到粘稠状，在160℃条件下干燥；分别可得到：拟青霉酮A黄绿色粉末、拟青霉酮B黄色粉末和拟青霉酮C黄色粉末。其纯度都为99.9%。其结构如下：
从拟青霉提取物中纯化出来的拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）分别为：29.1μg/mL、40.6μg/mL和20.2μg/mL；拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）分别为：165.3μg/mL、265.5μg/mL和113.6μg/mL。这些拟青霉提取物纯化品对酪氨酸酶的抑制活性和清除自由基活性都远强于目前广泛用于化妆品的熊果苷，可以用于日用化学品添加剂，起增白、抗氧化、抗老化、保鲜、杀菌、消炎等作用。
实施例3：
包括以下操作步骤：
3.1拟青霉菌种选择
所选用的菌种为蛹拟青霉（Paecilomyces militari）；
3.2菌株培养
培养方法为液固混合培养，具体工序如下：
3.2.1斜面种子培养
将保藏的拟青霉菌株接种于萨氏（SDAY）斜面培养基，于25℃恒温、培养5d，得到一级菌种；
3.2.2二级液体种子培养
将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养；
液体摇瓶培养基：葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸出粉10g/L，蒸馏水定容；
在250ml三角瓶中加入40%三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种2支斜面菌种，接种后置于全温振荡培养箱，温度25℃、转速150rpm，培养5d，即得到二级菌种。
3.2.3三级液体种子培养
将二级菌种接种到50L的发酵罐，装液量为罐体积的65%，接种量7%，通气量按体积比1:1（v/v），压力0.1MP，25℃恒温通气培养3天，得到三级菌种；
发酵罐中的培养基同液体摇瓶培养基；
3.2.4固体培养
将三级液体菌种拌入固体培养基中，接种量为固体料量的6%，25℃恒温通气培养15天，得到发酵物；所述固体培养基为蒸煮过的大米或小麦，蒸煮后的大米或小麦含水率为60%；
3.3培养物中有效成分的提取和精制
3.3.1培养物的预处理
将固体培养物在100℃干燥到含水率15%，然后粉碎到60目，用乙醇提取。料液比为1:3。提取时间为24小时。提取结束后在转速5000转/分钟条件下离心，或真空抽滤。滤液在温度60℃浓缩到原体积的1/5，得到浓缩脱醇液，同时回收乙醇，浓缩液用于进一步的色谱法精制；
3.3.2提取物的制备和精制
将前述乙醇提取物经过逆流色谱法初步纯化，得到权利要求1所述拟青霉提取物。逆流色谱法的溶剂系统为正己烷：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=4：5：3：0.5：5(V/V/V//V/V)；每5分钟收集一管；合并含有拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C的收集管；在60℃温度下将收集物浓缩到到原体积的1/5，并将浓缩物在100℃条件下干燥得到权利要求1所述拟青霉提取物。
不同批次提取物外观为浅黄绿色到棕黄色。经高效液相分析发现各批次提取物中含拟青霉酮60.0%；总拟青霉酮中，拟青霉酮A占15.0%，拟青霉酮B占20.0%，拟青霉酮C占65.0%。各成分的结构式如下：
活性测定结果显示提取物对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）为：25.6μg/mL。对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）为：158.3μg/mL。该拟青霉提取物对酪氨酸酶的抑制活性和清除自由基活性都远强于目前广泛用于化妆品的熊果苷，可以用于日用化学品添加剂，起增白、抗氧化、抗老化、保鲜、杀菌、消炎等作用。
3.3.3拟青霉提取物的进一步纯化
逆流色谱方法纯化
具体步骤如下：采用两次分离法。第一次的溶剂系统为正己烷：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=4：5：3：0.5：5(V/V/V//V/V)，此时只可单独按峰收集拟青霉酮C峰，得到纯度较高的拟青霉酮C溶液。将该组分在60℃温度下浓缩到到原体积的1/5，并将浓缩物在120℃条件下干燥得到黄色拟青霉酮C粉末。经高效液相分析发现各批次拟青霉酮C的纯度为90.0%。拟青霉酮C结构如下：
活性测定结果显示拟青霉酮C对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）为：15.3μg/mL；对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）为：87.6μg/mL。该拟青霉提取物纯化品对酪氨酸酶的抑制活性和清除自由基活性都远强于目前广泛用于化妆品的熊果苷，可以用于日用化学品添加 剂，起增白、抗氧化、抗老化、保鲜、杀菌、消炎等作用。
在收集拟青霉酮C峰的同时，收集拟青霉酮C峰前后10min内的峰及拟青霉酮A峰和拟青霉酮B峰，合并收集物并浓缩到原进样体积后进行第二次分离，第二次分离选择的溶剂体系为：正己烷：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=3：5：2.5：0.5：5(V/V/V//V/V)，此时可以收集到纯度较高的拟青霉酮A和拟青霉酮B溶液。将收集的目标组分在60℃温度下浓缩到到原体积的1/6，并将浓缩物在100℃条件下干燥，得到拟青霉酮A和拟青霉酮B。拟青霉酮A为浅黄绿色到黄色粉末。拟青霉酮B为黄色粉末。经高效液相分析发现各批次拟青霉酮B和C的纯度分别都为90.0%。其结构见下式：
拟青霉酮A和拟青霉酮B对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）分别为：21.2μg/mL、28.7μg/mL。拟青霉酮A和拟青霉酮B对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）分别为：129.4μg/mL、213.5μg/mL。这些拟青霉提取物纯化品对酪氨酸酶的抑制活性和清除自由基活性都远强于目前广泛用于化妆品的熊果苷，可以用于日用化学品添加剂，起增白、抗氧化、抗老化、保鲜、杀菌、消炎等作用。
反相色谱方法纯化
固定相为键合相填料，所述键合相填料为反相碳十八填料即RPC18，颗粒直径为25微米,色谱柱直径和流动相流速可视生产规模来定。用乙醇或甲醇和水按0～100：100～0配比进行梯度洗脱，总洗脱体积为色谱柱体积的100倍；按峰收集拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C；收集物在60℃温度以下浓缩到粘稠状，在100℃条件下干燥；分别可得到：拟青霉酮A黄绿色粉末、拟青霉酮B黄色粉末和拟青霉酮C黄色粉末。其纯度都为90.0%。其结构如下：
从拟青霉提取物中纯化出来的拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）分别为：21.2μg/mL、28.7μg/mL和15.3μg/mL；它们对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）分别为：129.4μg/mL、213.5μg/mL和87.6μg/mL。这些拟青霉提取物纯化品对酪氨酸酶的抑制活性和清除自由基活性都远强于目前广泛用于化妆品的熊果苷，可以用于日用化学品添加剂，起增白、抗氧化、抗老化、保鲜、杀菌、消炎等作用。
实施例4：
包括以下操作步骤：
4.1拟青霉菌种选择
所选用的菌种为蛹拟青霉（Paecilomyces militari）；
4.2菌株培养
培养方法为液固混合培养，具体工序如下：
4.2.1斜面种子培养
将保藏的拟青霉菌株接种于萨氏（SDAY）斜面培养基，于21℃恒温、培养4d，得到一级菌种；
4.2.2二级液体种子培养
将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养；
液体摇瓶培养基：葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸出粉10g/L，蒸馏水定容；
在500ml三角瓶中加入55%三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种1支斜面菌种，接种后置于全温振荡培养箱，温度21℃、转速160rpm，培养4d，即得到二级菌种。
4.2.3三级液体种子培养
将二级菌种接种到30L的发酵罐，装液量为罐体积的70%，接种量6%，通气量按体积比1:1（v/v），压力0.1MPa，22℃恒温通气培养4天，得到三级菌种；
发酵罐中的培养基同液体摇瓶培养基；
4.2.4固体培养
将三级液体菌种拌入固体培养基中，接种量为固体料量的7%，24℃恒温通气培养14天，得到发酵物；所述固体培养基为蒸煮过的大米或小麦，蒸煮后的大米或小麦含水率为60%；
4.3培养物中有效成分的提取和精制
4.3.1培养物的预处理
将固体培养物在80℃干燥到含水率12%，然后粉碎到50目，用乙醇提取。料液比为1:4。提取时间为36小时。提取结束后在转速6000转/分钟条件下离心，或真空抽滤。滤液在温度50℃浓缩到原体积的1/6，得到浓缩脱醇液，同时回收乙醇，浓缩液用于进一步的色谱法精制；
4.3.2提取物的制备和精制
将前述乙醇提取物经过逆流色谱法初步纯化，得到权利要求1所述拟青霉提取物。逆流色谱法的溶剂系统为正己烷：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=4.5：5.5：3.5：1：5.5(V/V/V//V/V)；每5分钟收集一管；合并含有拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C的收集管；在50℃温度下将收集物浓缩到到原体积的1/6，并将浓缩物在80℃条件下干燥得到权利要求1所述拟青霉提取物。
不同批次提取物外观为浅黄绿色到棕黄色。经高效液相分析发现各批次提取物中含拟青霉酮70.0%；总拟青霉酮中，拟青霉酮A占16.0%，拟青霉酮B占21.0%，拟青霉酮C占63.0%。各成分的结构式如下：
活性测定结果显示提取物对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）为：23.7μg/mL。对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）为：143.5μg/mL。该拟青霉提取物对酪氨酸酶的抑制活性和清除自由基活性都远强于目前广泛用于化妆品的熊果苷，可以用于日用化学品添加剂，起增白、抗氧化、抗老化、保鲜、杀菌、消炎等作用。
4.3.3拟青霉提取物的进一步纯化
逆流色谱方法纯化
具体步骤如下：采用两次分离法。第一次的溶剂系统为正己烷：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=4.5：5.5：3.5：1：4(V/V/V//V/V)，此时只可单独按峰收集拟青霉酮C峰，得到纯度较高的拟青霉酮C溶液。将该组分在45℃温度下浓缩到到原体积的1/4，并将浓缩物70℃条件下干燥得到黄色拟青霉酮C粉末。经高效液相分析发现各批次拟青霉酮C的纯度为85.0%。拟青霉酮C结构如下：
活性测定结果显示拟青霉酮C对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）为：17.8μg/mL；对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）为：95.4μg/mL。该拟青霉提取物纯化品对酪氨酸酶的抑制活性和清除自由基活性都远强于目前广泛用于化妆品的熊果苷，可以用于日用化学品添加剂，起增白、抗氧化、抗老化、保鲜、杀菌、消炎等作用。
在收集拟青霉酮C峰的同时，收集拟青霉酮C峰前后10min内的峰及拟青霉酮A和拟青霉酮B峰，合并收集物并浓缩到原进样体积后进行第二次分离，第二次分离选择的溶剂体系为：正己烷：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=3.5：5。5：2：0.5：6(V/V/V//V/V)，此时可以收集到纯度较高的拟青霉酮A和拟青霉酮B溶液。将收集的目标组分在50℃温度下浓缩到到原体积的1/5，并将浓缩物在90℃条件下干燥，得到拟青霉酮A和拟青霉酮B。拟青霉酮A为浅黄绿色到黄色粉末。拟青霉酮B为黄色粉末。经高效液相分析发现各批次拟青霉酮B和C的纯度分别都为93.0%。其结构见下式：
拟青霉酮A和拟青霉酮B对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）分别为：22.5μg/mL、27.5μg/mL。拟青霉酮A和拟青霉酮B对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）分别为：120.5μg/mL、210.5μg/mL。这些拟青霉提取物纯化品对酪氨酸酶的抑制活性和清除自由基活性都远强于目前广泛用于化妆品的熊果苷，可以用于日用化学品添加剂，起增白、抗氧化、抗老化、保鲜、杀菌、消炎等作用。
反相色谱方法纯化
固定相为键合相填料，所述键合相填料为反相碳十八填料即RPC18，颗粒直径为25微米,色谱柱直径和流动相流速可视生产规模来定。用乙醇或甲醇和水按0～100：100～0配比进行梯度洗脱，总洗脱体积为色谱柱体积的110倍；按峰收集拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C；收集物在65℃温度以下浓缩到粘稠状，在110℃条件下干燥；分别可得到：拟青霉酮A黄绿色粉末、拟青霉酮B黄色粉末和拟青霉酮C黄色粉末。其纯度都为88.0%。其结构如下：
从拟青霉提取物中纯化出来的拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）分别为：24.3μg/mL、30.2μg/mL和18.7μg/mL；它们对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）分别为：135.0μg/mL、218.5μg/mL和91.5μg/mL。这些拟青霉提取物纯化品对酪氨酸酶的抑制活性和清除自由基活性都远强于目前广泛用于化妆品的熊果苷，可以用于日用化学品添加剂，起增白、抗氧化、抗老化、保鲜、杀菌、消炎等作用。
实施例5：
包括以下操作步骤：
5.1拟青霉菌种选择
所选用的拟青霉为蝉拟青霉（Paecilomyces cicadae）。
5.2菌株培养
养方法采用液固混合培养工艺。具体工艺方法如下：
5.2.1斜面种子培养
将保藏的拟青霉菌株接种于萨氏（SDAY）斜面培养基，于27℃恒温、培养4d，得到一级菌种；
5.2.2二级液体种子培养
将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养。
液体摇瓶培养基：葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸出粉10g/L，蒸馏水定容；
在1500ml三角瓶中加入40%三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种2支斜面菌种，接种后置于全温振荡培养箱，温度22℃、转速160rpm，培养4d，即得到二级菌种。
5.2.3三级液体种子培养
将二级菌种接种到80L的发酵罐，装液量为罐体积的55%，接种量6%，通气量按体积比1:1（v/v），压力0.1MPa，22℃恒温通气培养5天，得到三级菌种；
发酵罐中的培养基同液体摇瓶培养基；
5.2.4固体培养
将三级液体菌种拌入固体培养基中，接种量为固体料量的8%，26℃恒温通气培养14天，得到发酵物；
培养基为蒸煮过的大米或小麦。蒸煮后的大米或小麦含水率为50%。
5.3培养物中有效成分的提取和精制
5.3.1、培养物预处理
将固体培养物在70℃干燥到含水率12%，然后粉碎到40目，用乙醇提取。料液比为1:3。提取时间为12小时。提取结束后在转速4000转/分钟条件下离心，或真空抽滤。滤液在温度60℃浓缩到原体积的1/4，得到浓缩脱醇液，同时回收乙醇，浓缩液用于进一步的色谱法精制；
5.3.2提取物的制备
将前述乙醇提取物经过逆流色谱法初步纯化，得到权利要求1所述拟青霉提取物。逆流色谱法的溶剂系统为正己烷：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=3.5：4.5：2.5：0.3：4.5(V/V/V//V/V)；每5分钟收集一管；合并含有拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C的收集管；在40℃温度下将收集物浓缩到到原体积的1/4，并将浓缩物在50℃条件下干燥，得到权利要求1所述拟青霉提取物。
提取物外观为黄色。经高效液相分析发现各批次提取物中含拟青霉酮总量为40.0%；总拟青霉酮中，拟青霉酮A占15.0%，拟青霉酮B占15.0%，拟青霉酮C占70.0%。各成分的结构式如 下：
活性测定结果显示提取物对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）为：15.6μg/mL。对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）为：135.8μg/mL。该拟青霉提取物对酪氨酸酶的抑制活性和清除自由基活性都远强于目前广泛用于化妆品的熊果苷，可以用于日用化学品添加剂，起增白、抗氧化、抗老化、保鲜、杀菌、消炎等作用。
5.3.3拟青霉提取物的进一步纯化
逆流色谱方法纯化
具体步骤如下：采用两次分离法。第一次的溶剂系统为正己烷：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=3.5：4.5：2.5：0.5：5(V/V/V//V/V)，此时只可单独按峰收集拟青霉酮C峰，得到纯度较高的拟青霉酮C溶液。将该组分在65℃温度下浓缩到到原体积的1/6，并将浓缩物在20℃条件下干燥得到黄色拟青霉酮C粉末。经高效液相分析发现各批次拟青霉酮C的纯度为85.0%。拟青霉酮C结构如下：
活性测定结果显示拟青霉酮C对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）为：15.6μg/mL；对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）为：85.1μg/mL。该拟青霉提取物纯化品对酪氨酸酶的抑制活性和清除自由基活性都远强于目前广泛用于化妆品的熊果苷，可以用于日用化学品添加 剂，起增白、抗氧化、抗老化、保鲜、杀菌、消炎等作用。
在收集拟青霉酮C峰的同时，收集拟青霉酮C峰前后30min内的峰（包含拟青霉酮A和拟青霉酮B峰及部分拟青霉酮C峰），浓缩到原进样体积后进行第二次分离，第二次分离选择的溶剂体系为：正己烷：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=3：4.5：2.5：0.4：5(V/V/V//V/V)，此时可以收集到纯度较高的拟青霉酮A和拟青霉酮B溶液。将收集的目标组分在70℃温度下浓缩到到原体积的1/8，并将浓缩物在250℃条件下干燥，得到拟青霉酮A和拟青霉酮B。拟青霉酮A为浅黄绿色到黄色粉末。拟青霉酮B为黄色粉末。经高效液相分析发现拟青霉酮B和C的纯度分别都为91.0%。其结构见下式：
拟青霉酮A和拟青霉酮B对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）分别为：14.7μg/mL和19.5μg/mL。拟青霉酮A和拟青霉酮B对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）分别为：102.5μg/mL和183.5μg/mL。这些拟青霉提取物纯化品对酪氨酸酶的抑制活性和清除自由基活性都远强于目前广泛用于化妆品的熊果苷，可以用于日用化学品添加剂，起增白、抗氧化、抗老化、保鲜、杀菌、消炎等作用。
反相色谱方法纯化
固定相为键合相填料，所述键合相填料为反相碳十八填料即RPC18，颗粒直径为20微米,色谱柱直径和流动相流速可视生产规模来定。用乙醇或甲醇和水按0～100：100～0配比进行梯度洗脱，总洗脱体积为色谱柱体积的120倍；按峰收集拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C；收集物在30℃温度以下浓缩到粘稠状，在70℃条件下干燥；分别可得到：拟青霉酮A黄绿色粉末、拟青霉酮B黄色粉末和拟青霉酮C黄色粉末。其纯度都为92.0%。其结构如下：
从拟青霉提取物中纯化出来的拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）分别为：15.2μg/mL、17.5μg/mL和13.5μg/mL；拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）分别为：99.5μg/mL、170.5μg/mL和70.9μg/mL。这些拟青霉提取物纯化品对酪氨酸酶的抑制活性和清除自由基活性都远强于目前广泛用于化妆品的熊果苷，可以用于日用化学品添加剂，起增白、抗氧化、抗老化、保鲜、杀菌、消炎等作用。
Claims (3)
1.一种拟青霉提取物，其特征在于：所述拟青霉提取物中含有30.0-99.0%拟青霉酮，所述拟青霉酮包括拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C，三者的结构式见下式：
所述拟青霉酮中拟青霉酮A的含量为10.0～20.0%，拟青霉酮B的含量为10.0～30.0%，拟青霉酮C的含量为50.0～80.0%。
2.具有抑制酪氨酸酶活性和清除自由基活性的拟青霉提取物的用途，其特征在于：根据权利要求1所述的拟青霉提取物在制备具有抑制酪氨酸酶活性和清除自由基活性的日用化学品中的应用；所述拟青霉提取物具有以下特性：（1）对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）为：13.5～37.7μg/mL；对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）为：105.5～196.1μg/mL；（2）权利要求1所述的拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）分别为：13.3～29.1μg/mL、16.8～40.6μg/mL和10.3～20.2μg/mL；拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）分别为：93.5～165.3μg/mL、161.4～265.5μg/mL和61.5～113.6μg/mL。
3.制备权利要求1或2所述的拟青霉提取物方法，其特征在于：具体操作步骤如下：
1）拟青霉（Paecilomyces sp.）菌种选择
所用的拟青霉（Paecilomyces sp.）为蝉拟青霉（Paecilomyces cicadae）或古尼拟青霉（Paecilomyces gunnii）或蛹拟青霉（Paecilomyces militari）；
2）菌株培养
培养方法为液固混合培养，具体工序如下：
2.1）斜面种子培养
将保藏的拟青霉菌株接种于萨氏（SDAY）斜面培养基，于20～30℃恒温、培养4～7d，得到一级菌种；
2.2）二级液体种子培养
将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养；
液体摇瓶培养基：葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸出粉10g/L，蒸馏水定容；
在大于等于100ml三角瓶中加入30～50%三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种1～3支斜面菌种，接种后置于全温振荡培养箱，温度20～30℃、转速100～200rpm，培养3～7d，即得到二级菌种；
2.3）三级液体种子培养
将二级菌种接种到大于等于10L的发酵罐，所装液量为罐体积的50～80%，接种量5～10%，通气量按体积比1:1（v/v），压力0.1MPa，20～30℃恒温通气培养2～5天，得到三级菌种；发酵罐中的培养基同液体摇瓶培养基；
2.4）固体培养
将三级液体菌种拌入固体培养基中，接种量为固体料量的5～10%，20～30℃恒温通气培养10～20天，得到发酵物；所述固体培养基为蒸煮过的大米或小麦，蒸煮后的大米或小麦含水率为40～80%；
3）培养物中有效成分的提取和精制
3.1）培养物的预处理
将固体培养物在30～150℃干燥到含水率小于等于20%，然后粉碎到20～120目，用乙醇提取；料液比为1:1～5、提取时间为1～48小时；提取结束后在转速大于等于1000转/分钟条件下离心，或真空抽滤；滤液在温度小于等于100℃浓缩到原体积的1/2～1/10，得到浓缩脱醇液，同时回收乙醇，浓缩液用于进一步的色谱法精制；
3.2）提取物的制备和精制
3.2.1）拟青霉提取物的制备
将前述乙醇提取物经过逆流色谱法初步纯化，得到权利要求1所述拟青霉提取物；逆流色谱法的溶剂系统按体积比为正己烷：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=3～5：4～6：2～4：0～1：4～6；每5分钟收集一管；合并含有拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C的收集管；在小于等于100℃温度下将收集物浓缩到到原体积的1/2～1/10，并将浓缩物在不高于170℃条件下干燥得到权利要求1所述拟青霉提取物；
不同批次拟青霉提取物外观为浅黄绿色到棕黄色；经高效液相分析发现各批次拟青霉提取物中含拟青霉酮30.0～99.0%；总拟青霉酮中，拟青霉酮A占10.0～20.0%，拟青霉酮B占10.0～30.0%，拟青霉酮C占50.0～80.0%；各成分的结构式如下：
活性测定结果显示不同批次提取物对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）为：13.5～37.7μg/mL；对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）为：105.5～196.1μg/mL；
3.2.2）拟青霉提取物的进一步纯化
逆流色谱方法纯化
具体步骤如下：采用两次分离法，第一次的溶剂系统按体积比为正己烷：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=3～5：4～6：2～4：0～1：4～6，此时只可单独按峰收集拟青霉酮C峰，得到纯度较高的拟青霉酮C溶液；将该组分在小于等于100℃温度下浓缩到到原体积的1/2～1/10，并将浓缩物在不高于170℃条件下干燥得到黄色拟青霉酮C粉末；经高效液相分析发现各批次拟青霉酮C的纯度为80.0～99.9%；拟青霉酮C结构如下：
活性测定结果显示不同批次拟青霉酮C对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）为：10.3～20.2μg/mL；对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）为：61.5～113.6μg/mL；
在收集拟青霉酮C峰的同时，收集拟青霉酮C峰前后5～20min内的峰及拟青霉酮A和拟青霉酮B峰，合并收集物并浓缩到原进样体积后进行第二次分离，第二次分离的溶剂体系按体积比为：正己烷：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=2～4：4～6：2～3：0～1：4～6，此时可以收集到纯度较高的拟青霉酮A和拟青霉酮B溶液；将收集的目标组分在小于等于100℃温度下浓缩到到原体积的1/2～1/10，并将浓缩物在不高于170℃条件下干燥，得到拟青霉酮A和拟青霉酮B，拟青霉酮A为浅黄绿色到黄色粉末，拟青霉酮B为黄色粉末；经高效液相分析发现各 批次拟青霉酮B和C的纯度分别都为80.0～99.9%；其结构见下式：
拟青霉酮A和拟青霉酮B对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）分别为：13.3～29.1μg/mL和16.8～40.6μg/mL；
拟青霉酮A和拟青霉酮B对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）分别为：93.5～165.3μg/mL和161.4～265.5μg/mL；
反相色谱方法纯化
固定相为键合相填料，所述键合相填料为反相碳十八填料即RPC18，颗粒直径为5～50微米,色谱柱直径和流动相流速可视生产规模来定；用乙醇或甲醇和水按0～100：100～0配比进行梯度洗脱，总洗脱体积为色谱柱体积的50到200倍；按峰收集拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C；收集物在小于等于100℃温度以下浓缩到粘稠状，在低于170℃条件下干燥；分别可得到：拟青霉酮A黄绿色粉末、拟青霉酮B黄色粉末和拟青霉酮C黄色粉末；其纯度都为80.0～99.9%；其结构如下：
从拟青霉提取物中纯化出来的拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）分别为：13.3～29.1μg/mL、16.8～40.6μg/mL和10.3～20.2μg/mL；拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）分别为：93.5～165.3μg/mL、161.4～265.5μg/mL和61.5～113.6μg/mL；这些拟青霉提取物纯化品抑制酪氨酸酶的活性和清除自由基的活性都远强于目前广泛用于化妆品的熊果苷，拟青霉提取物纯化品作为日用化学品的添加剂，具有增白、抗氧化、抗老化、保鲜、杀菌、消炎作用。
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