CN103751030A - 具有抑制酪氨酸酶活性的白僵菌提取物的应用及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及具有抑制酪氨酸酶活性的白僵菌提取物的应用及制备方法。所述白僵菌提取物在制备防治色素沉着和黑色素瘤的酪氨酸酶抑制剂的应用；所述白僵菌提取物中的主要有效成分为6’-甲基-2’,4’-二羟基苯基-4-氧甲基-β-D-葡萄糖甙（6’-methyl-2’,4’-dihydroxyphenyl-4-O-methyl-β-D-glucopyranoside），含量5~99%；其活性特征在于：对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）为：37.6~638.5.μg/mL。具有酪氨酸酶抑制剂的白僵菌提取物用途广泛，可作为日用化学品添加剂，起增白、抗黑化、抗老化、防治色素沉着和黑色素瘤等作用。
Description
技术领域
本发明属于生物制品的提取制备和应用技术领域，涉及具有抑制酪氨酸酶活性的白僵菌提取物的应用及制备方法。
背景技术
白僵菌（Beauveria sp.）的分类:丝孢目（Hyphomycetales）丛梗孢科白僵菌属（Beauveria Vuillemin）的真菌；该属在我国常见的有三种，如：球孢白僵菌（Beauveria bassiana）、布氏白僵菌（Beauveria brongniartii）和多形白僵菌（Beauveriaamorpha）等，是重要的昆虫病原真菌，目前主要用来对害虫进行生物防治。其中蚕在感染白僵菌后被称为白僵蚕。白僵蚕在我国传统中药中的作用主要为“祛风解痉，化痰散结”。白僵蚕的主要活性成分被认为是草酸铵，但白僵菌本身尚无药用报道。
抑制酪氨酸酶活性：酪氨酸酶兼有加氧酶和氧化酶的双重功能，在黑色素合成过程中起关键作用。它能够把单酚催化成二酚，并把二酚氧化成醌；醌在非酶促条件下形成最终的反应产物黑色素。酪氨酸酶抑制剂就是通过抑制酪氨酸酶活性从而抑制黑色素生成，因而可用来预防和治疗色素沉着和黑色素瘤等，从而在医药、化妆品等领域有着广阔的应用前景，被广泛用于药品及日用化学品等中。
发明内容
为寻找新型天然高效天然酪氨酸酶抑制剂和抗氧化剂，发明人通过对中国的100余株昆虫病原真菌代谢物进行活性研究，发现了白僵菌的提取物具有很强的酪氨酸酶抑制活性。本发明旨在，提供具有抑制酪氨酸酶活性的白僵菌提取物的用途。
所述白僵菌提取物在制备增白、防治色素沉着和黑色素瘤的酪氨酸酶抑制剂的应用；
所述白僵菌提取物中的主要有效成分为6’-甲基-2’,4’-二羟基苯基-4-氧甲基-β-D-葡萄糖甙（6’-methyl-2’,4’-dihydroxyphenyl-4-O-methyl-β-D-glucopyranoside），含量5～99%；其化学结构见下式：
其活性特征在于：对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）为：37.6～638.5.μg/mL。
制备具有抑制酪氨酸酶活性的白僵菌提取物的具体操作步骤如下：
（1）白僵菌（Beauveria sp.）菌种选择和培养
所用的白僵菌（Beauveria sp.）为球孢白僵菌（Beauveria bassiana）或布氏白僵菌（Beauveria brongniartii）或多形白僵菌（Beauveriaamorpha）；
具体培养方法如下：
（1.1）斜面菌种培养
将白僵菌菌株接种于萨氏（SDAY）斜面培养基，于20～30℃恒温、培养4～7d，得到一级菌种；
（1.2）二级菌种培养
将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养，
液体摇瓶培养基：葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸出粉10g/L，蒸馏水定容；
在大于100ml三角瓶中加入30～50%三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种1～3支斜面菌种，接种后置于全温振荡培养箱，温度20～30℃、转速100～200rpm，培养3～7d，即得到二级菌种；
（1.3）三级菌种培养
将二级菌种接种到大于等于10L的发酵罐，装液量为罐体积的50～70%，接种量5～10%，通气量按体积比1:1（v/v），压力0.1MPa，20～30℃恒温通气培养2～5天，得到三级菌种；发酵罐中的培养基同液体摇瓶培养基；
（1.4）发酵罐发酵
将三级菌种压入100L以上发酵罐，发酵罐的初始装液量为按罐容积的50～70%装液，接种量为装液量的5～10%，通气量按体积比1:1（v/v），压力0.1MPa，20～30℃恒温通气培养5～15天，得到发酵物；发酵罐中的培养基同二级菌种培养基；
（2）发酵物中有效成分的提取和精制
（2.1）预处理
将发酵物在转速大于1000转/分钟条件下离心过滤；将上清液在低于100℃温度条件下，浓缩到原体积的1/2～1/10，得到浓缩液；
（2.2）去杂
在浓缩液中按体积比加入1～4倍乙醇，于0～40℃条件下静置沉淀5～24小时，然后在转速大于1000转/分钟离心过滤；去沉淀；将上清在温度小于100℃浓缩到原体积的1/2～ 1/10，得到浓缩脱醇液，同时回收乙醇；
将浓缩脱醇液按1:0.5～5的体积比，加入预处理剂，所述预处理剂为石油醚或己烷或轻汽油，混匀，萃取，去掉上层，下层的水相在温度小于100℃浓缩原体积1/2～1/10倍，得到去杂浓缩液；
（2.3）初步纯化
在去杂浓缩液中，按1:0.5～5的体积比加入萃取剂，萃取剂为丁醇或丁醇和乙酸乙酯混合物，丁醇和乙酸乙酯混合物的体积比为：2-0.5：0.5-2；萃取后去掉水层；有机相部分在低于100℃温度下浓缩到到原体积的1/2～1/10，将浓缩物在不高于170℃条件下干燥，得粗制产品；
粗制产品的性状：浅黄至棕色无定形粉末；
不同批次的粗制品对酪氨酸酶的半数抑制浓度IC50为278.4～638.5μg/ml；
主要有效成分为6’-甲基-2’,4’-二羟基苯基-4-氧甲基-β-D-葡萄糖甙（6’-methyl-2’,4’-dihydroxyphenyl-4-O-methyl-β-D-glucopyranoside），含量5～15%；其化学结构见下式：
其它成分有：糖类含量为5～20%；甾醇类化合物的含量为1～5%；核苷类的含量为5～15%；其它含量为84～45%；
（2.4）色谱法精制
将粗制产品用甲醇或乙醇溶解，溶液浓度为1～20%，用色谱法分离纯化，具体操作如下：
用键合相为固定相，用乙醇或甲醇和水按0～100：100～0配比进行梯度洗脱，总洗脱体积为色谱柱体积的50到200倍；收集活性洗脱物在低于100℃温度以下浓缩到粘稠状，在低于170℃条件下干燥，得精制品；
所述键合相填料为反相碳十八填料即RPC18，颗粒直径为5～50微米；
精制品性状：白色至浅棕红色粉末或结晶；
不同批次的精制品对酪氨酸酶的半数抑制浓度IC50为37.6～65.3μg/ml；
主要有效成分为：6’-甲基-2’,4’-二羟基苯基-4-氧甲基-β-D-葡萄糖甙（6’-methyl-2’,4’-dihydroxyphenyl-4-O-methyl-β-D-glucopyranoside），含量80～99%；其化学结构见 下式：
其它成分有：单糖和二糖的含量为3～0.1%；甾醇类化合物的含量为2～0.1%；核苷类的含量为3～0.1%；其它含量为12～0.7%。
研究发现白僵菌（Beauveria sp.）提取物（包括粗制品和精制品）有以下活性：
1.粗制品
对酪氨酸酶的抑制活性：配制粗制品浓度为0.05、0.10、0.20、0.40、0.80和1.60mg/ml甲醇溶液，以L-酪氨酸为底物，进行酪氨酸酶抑制试验，经计算得出不同批次粗制品对酪氨酸酶的半数抑制浓度IC50为278.4～638.5μg/ml；
2.精制品
对酪氨酸酶的抑制活性：配制精制品浓度为10、40、80、120、160、200μg/ml甲醇溶液，以L-酪氨酸为底物，进行酪氨酸酶抑制试验，经计算得出，不同批次的精制品对酪氨酸酶的半数抑制浓度IC5037.6-65.3μg/ml；
3.有效成分结构鉴定
经过核磁共振分析，发现有效成分为6’-甲基-2’,4’-二羟基苯基-4-氧甲基-β-D-葡萄糖甙（6’-methyl-2’,4’-dihydroxyphenyl-4-O-methyl-β-D-glucopyranoside），该化合物即本研究组曾经在Planta Medica中报道的化合物6-methyl-2,4-dihydroxyphenyl4-O-methyl-β-D-glucopyranoside（见结构式），但原来报道的命名中将6、2、4上的撇号漏掉，因此命名不准确。虽然该化合物的结构已报道，但其抑制酪氨酸酶活性系首次发现。
本发明的有益技术效果体现在下述几个方面：
1.本发明所述的具有抑制酪氨酸酶活性的白僵菌提取物，开拓了白僵菌及白僵菌提取物一个新的应用领域。精制品对酪氨酸酶的最低IC50为37.6μg/ml；
2.本发明所述的具有酪氨酸酶抑制剂的白僵菌提取物用途广泛，可作为日用化学品添加剂，起增白、抗黑化、抗老化、防治色素沉着和黑色素瘤等作用；
3.本发明所述的具有抑制酪氨酸酶活性的白僵菌提取物采取微生物发酵生产，不受环境和资源影响，易实现工业化、自动化，不受环境和自然资源的影响。
具体实施方式
所述白僵菌提取物在制备防治色素沉着和黑色素瘤的酪氨酸酶抑制剂的应用；
所述白僵菌提取物中的主要有效成分为6’-甲基-2’,4’-二羟基苯基-4-氧甲基-β-D-葡萄糖甙（6’-methyl-2’,4’-dihydroxyphenyl-4-O-methyl-β-D-glucopyranoside），含量5～99%；其化学结构见下式：
其活性特征在于：对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）为：37.6～638.5.μg/mL。
下面通过实施例，对本发明的具有抑制酪氨酸酶活性的白僵菌提取物的制备和用途作进一步地说明。
实施例1
白僵菌中具有酪氨酸酶抑制活性的提取物是从白僵菌发酵物中提取得到，具体的提取操作步骤如下：
1.白僵菌菌种选择和培养
所用的白僵菌为球孢白僵菌（Beauveria bassiana）；
具体培养方法如下：
1.1斜面菌种培养
将白僵菌菌株接种于萨氏（SDAY）斜面培养基，于20℃恒温、培养4d，得到一级菌种；
1.2二级菌种培养
将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养，
液体摇瓶培养基：葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸出粉10g/L，蒸馏水定容；
在大于100ml三角瓶中加入30%三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种1支斜面菌种，接种后置于全温振荡培养箱，温度20℃、转速100rpm，培养3d，即得到二级菌种；
1.3三级菌种培养
将二级菌种接种到10L发酵罐，装液量为罐体积的50%，接种量5%，通气量按体积比1:1（v/v），压力0.1MP，20℃恒温通气培养2天，得到三级菌种；
发酵罐中的培养基同液体摇瓶培养基；
1.4发酵罐发酵
将三级菌种压入100L发酵罐，发酵罐的初始装液量为按罐容积的50%装液，接种量为装液量的5%，通气量按体积比1:1（v/v），压力0.1MPa，20℃恒温通气培养5天，得到发酵 物；发酵罐中的培养基同二级菌种培养基。
发酵物中有效成分的提取和精制
2.1、预处理
将发酵物在转速4000转/分钟条件下离心过滤；将上清液在80℃温度条件下，浓缩到原体积的1/2，得到浓缩液；
2.2、去杂
在浓缩液中按体积比加入1倍乙醇，于0℃条件下静置沉淀24小时，然后在转速4000转/分钟离心过滤；去沉淀；将上清在温度80℃浓缩到原体积的1/2，得到浓缩脱醇液，同时回收乙醇；
将浓缩脱醇液按1:0.5的体积比，加入预处理剂，所述预处理剂为石油醚，混匀，萃取，去掉上层，下层的水相在温度小于100℃浓缩原体积的1/2，得到去杂浓缩液；
2.3、初步纯化
在去杂浓缩液中，按1:0.5的体积比加入萃取剂，萃取剂为丁醇；萃取后去掉水层；有机相部分在低于80℃温度下浓缩到到原体积的1/2，将浓缩物在150℃条件下干燥，得粗制产品；
粗制产品的性状：浅黄至棕色无定形粉末；
该粗制品对酪氨酸酶的半数抑制浓度IC50为638.5μg/ml；
主要有效成分为6’-甲基-2’,4’-二羟基苯基-4-氧甲基-β-D-葡萄糖甙（6’-methyl-2’,4’-dihydroxyphenyl-4-O-methyl-β-D-glucopyranoside），含量5%，其化学结构见下式：
其它成分有：糖类含量为20%；甾醇类化合物的含量为1%；核苷类的含量为5%；其它含量为69%；
2.4、色谱法精制
将粗制产品用甲醇或乙醇溶解，溶液浓度为1%，用色谱法分离纯化，具体操作如下：
用键合相为固定相，用乙醇或甲醇和水按0～100：100～0配比进行梯度洗脱，总洗脱体积为色谱柱体积的50倍；收集活性洗脱物在80℃温度以下浓缩到粘稠状，在130℃条件下干燥，得精制品。
所述键合相填料为反相碳十八填料即RPC18，颗粒直径为5微米。
精制品性状：白色至浅棕红色粉末或结晶；
精制品对酪氨酸酶的半数抑制浓度IC5065.3μg/ml；
主要有效成分为6’-甲基-2’,4’-二羟基苯基-4-氧甲基-β-D-葡萄糖甙（6’-methyl-2’,4’-dihydroxyphenyl-4-O-methyl-β-D-glucopyranoside），含量80%，其化学结构见下式：
其它成分有：单糖和二糖的含量为3%；甾醇类化合物的含量为2%；核苷类的含量为3%；其它含量为12%。
实施例2：
白僵菌中具有酪氨酸酶抑制活性的提取物是从白僵菌发酵物中提取得到，具体的提取操作步骤如下：
1.白僵菌菌种选择和培养
所用的白僵菌为布氏白僵菌（Beauveria brongniartii）；
具体培养方法如下：
1.1斜面菌种培养
将白僵菌菌株接种于萨氏（SDAY）斜面培养基，于30℃恒温、培养7d，得到一级菌种；
1.2二级菌种培养
将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养，
液体摇瓶培养基：葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸出粉10g/L，蒸馏水定容；
在1000ml三角瓶中加入50%三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种3支斜面菌种，接种后置于全温振荡培养箱，温度30℃、转速200rpm，培养7d，即得到二级菌种；
三级菌种培养
将二级菌种接种到50L发酵罐，装液量为罐体积的70%，接种量10%，通气量按体积比1:1（v/v），压力0.1MP，30℃恒温通气培养5天，得到三级菌种；
发酵罐中的培养基同液体摇瓶培养基；
1.4发酵罐发酵
将三级菌种压入500L发酵罐，发酵罐的初始装液量为按罐容积的70%装液，接种量为装液 量的10%，通气量按体积比1:1（v/v），压力0.1MP，30℃恒温通气培养15天，得到发酵物；
发酵罐中的培养基同二级菌种培养基；
2.发酵物中有效成分的提取和精制
2.1预处理
将发酵物在转速10000转/分钟条件下离心过滤；将上清液在50℃温度条件下，浓缩到原体积的1/10，得到浓缩液；
2.2去杂
在浓缩液中按体积比加入4倍乙醇，于40℃条件下静置沉淀5小时，然后在转速10000转/分钟离心过滤；去沉淀；将上清在50℃浓缩到原体积的1/10，得到浓缩脱醇液，同时回收乙醇；
将浓缩脱醇液按1:5的体积比，加入预处理剂，所述预处理剂为己烷，混匀，萃取，去掉上层，下层的水相在50℃浓缩1/10倍，得到去杂浓缩液；
2.3初步纯化
在去杂浓缩液中，按1:5的体积比加入萃取剂，萃取剂为丁醇和乙酸乙酯混合物，丁醇和乙酸乙酯混合物的体积比为：2：0.5；萃取后去掉水层；有机相部分在50℃温度下浓缩到到原体积的1/10倍，将浓缩物在-40℃条件下干燥，得粗制产品；
粗制产品的性状：浅黄至棕色无定形粉末；
粗制品对酪氨酸酶的半数抑制浓度IC50为278.4μg/ml；
主要有效成分为6’-甲基-2’,4’-二羟基苯基-4-氧甲基-β-D-葡萄糖甙（6’-methyl-2’,4’-dihydroxyphenyl-4-O-methyl-β-D-glucopyranoside），含量15%，其化学结构见下式：
其它成分有：糖类含量为5%；甾醇类化合物的含量为1%；核苷类的含量为5%；其它含量为74%；
2.4色谱法精制
将粗制产品用甲醇或乙醇溶解，溶液浓度为20%，用色谱法分离纯化，具体操作如下：
用键合相为固定相，用乙醇或甲醇和水按0～100：100～0配比进行梯度洗脱，总洗脱体积 为色谱柱体积的200倍；收集活性洗脱物在50℃温度以下浓缩到粘稠状，在-40℃条件下干燥，得精制品。
所述键合相填料为反相碳十八填料即RPC18，颗粒直径为50微米。
精制品性状：白色至浅棕红色粉末或结晶；
精制品对酪氨酸酶的半数抑制浓度IC50为37.6μg/ml；
主要有效成分为6’-甲基-2’,4’-二羟基苯基-4-氧甲基-β-D-葡萄糖甙（6’-methyl-2’,4’-dihydroxyphenyl-4-O-methyl-β-D-glucopyranoside），含量99%，其化学结构见下式：
其它成分有：单糖和二糖的含量为0.1%；甾醇类化合物的含量为0.1%；核苷类的含量为0.1%；其它含量为0.7%。
实施例3：
白僵菌中具有酪氨酸酶抑制活性的提取物是从白僵菌发酵物中提取得到，具体的提取操作步骤如下：
1.白僵菌菌种选择和培养
所用的白僵菌为多形白僵菌（Beauveriaamorpha）；
具体培养方法如下：
1.1斜面菌种培养
将白僵菌菌株接种于萨氏（SDAY）斜面培养基，于25℃恒温、培养5d，得到一级菌种；
1.2二级菌种培养
将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养，
液体摇瓶培养基：葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸出粉10g/L，蒸馏水定容；
在250ml三角瓶中加入40%三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种1支斜面菌种，接种后置于全温振荡培养箱，温度25℃、转速150rpm，培养4d，即得到二级菌种；
1.3三级菌种培养
将二级菌种接种到30L发酵罐，装液量为罐体积的60%，接种量8%，通气量按体积比1:1（v/v），压力0.1MPa，25℃恒温通气培养4天，得到三级菌种；
发酵罐中的培养基同液体摇瓶培养基；
1.4发酵罐发酵
将三级菌种压入300L发酵罐，发酵罐的初始装液量为按罐容积的60%装液，接种量为装液量的8%，通气量按体积比1:1（v/v），压力0.1MPa，25℃恒温通气培养10天，得到发酵物；
发酵罐中的培养基同二级菌种培养基。
发酵物中有效成分的提取和精制
2.1预处理
将发酵物在转速8000转/分钟条件下离心过滤；将上清液在60℃温度条件下，浓缩到原体积的1/6，得到浓缩液；
2.2去杂
在浓缩液中按体积比加入3倍乙醇，于15℃条件下静置沉淀18小时，然后在转速12000转/分钟离心过滤；去沉淀；将上清在温度60℃浓缩到原体积的1/4得到浓缩脱醇液，同时回收乙醇；
将浓缩脱醇液按1:2体积比，加入预处理剂，所述预处理剂为轻汽油，混匀，萃取，去掉上层，下层的水相在温度50℃浓缩到原体积1/3；
2.3初步精制
在去杂浓缩液中，按1:1的体积比加入萃取剂，萃取剂为丁醇和乙酸乙酯混合物，丁醇和乙酸乙酯混合物的体积比为：2：0.5；萃取后去掉水层；有机相部分在50℃温度下浓缩到到原体积的1/3，将浓缩物在60℃条件下干燥，得粗制产品；
粗制产品的性状：浅黄至棕色无定形粉末；
粗制品对酪氨酸酶的半数抑制浓度IC50为454.7μg/ml；
主要有效成分为6’-甲基-2’,4’-二羟基苯基-4-氧甲基-β-D-葡萄糖甙（6’-methyl-2’,4’-dihydroxyphenyl-4-O-methyl-β-D-glucopyranoside），含量10%，其化学结构见下式：
其它成分有：糖类含量为10%；甾醇类化合物的含量为2%；核苷类的含量为10%；其它含量为68%；
2.4色谱法精制
将粗制产品用甲醇或乙醇溶解，溶液浓度为10%，用色谱法分离纯化，具体操作如下：
用键合相为固定相，用乙醇或甲醇和水按0～100：100～0配比进行梯度洗脱，总洗脱体积为色谱柱体积的120倍；收集活性洗脱物在60℃温度以下浓缩到粘稠状，在-40℃条件下干燥，得精制品。
所述键合相填料为反相碳十八填料即RPC18，颗粒直径为10微米。
精制品性状：白色至浅棕红色粉末或结晶；
精制品对酪氨酸酶的半数抑制浓度IC5046.4μg/ml；
主要有效成分为6’-甲基-2’,4’-二羟基苯基-4-氧甲基-β-D-葡萄糖甙（6’-methyl-2’,4’-dihydroxyphenyl-4-O-methyl-β-D-glucopyranoside），含量90%，其化学结构见下式：
其它成分有：单糖和二糖的含量为2.0%；甾醇类化合物的含量为1.0%；核苷类的含量为1.0%；其它含量为6.0%。
Claims (2)
1.具有抑制酪氨酸酶活性的白僵菌提取物的应用，其特征在于：所述白僵菌提取物在制备增白、防治色素沉着和黑色素瘤的酪氨酸酶抑制剂的应用；
所述白僵菌提取物中的主要有效成分为6’-甲基-2’,4’-二羟基苯基-4-氧甲基-β-D-葡萄糖甙（6’-methyl-2’,4’-dihydroxyphenyl-4-O-methyl-β-D-glucopyranoside），含量5～99%；其化学结构见下式：
其活性特征在于：对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）为：37.6～638.5.μg/mL。
2.制备权利要求1所述的具有抑制酪氨酸酶活性的白僵菌提取物的方法，其特征在于：具体操作步骤如下：
（1）白僵菌（Beauveria sp.）菌种选择和培养所用的白僵菌（Beauveria sp.）为球孢白僵菌（Beauveria bassiana）或布氏白僵菌（Beauveria brongniartii）或多形白僵菌（Beauveriaamorpha）；
具体培养方法如下：
（1.1）斜面菌种培养
将白僵菌菌株接种于萨氏（SDAY）斜面培养基，于20～30℃恒温、培养4～7d，得到一级菌种；
（1.2）二级菌种培养
将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养，
液体摇瓶培养基：葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸出粉10g/L，蒸馏水定容；
在大于100ml三角瓶中加入30～50%三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种1～3支斜面菌种，接种后置于全温振荡培养箱，温度20～30℃、转速100～200rpm，培养3～7d，即得到二级菌种；
（1.3）三级菌种培养
将二级菌种接种到大于等于10L的发酵罐，装液量为罐体积的50～70%，接种量5～10%，通气量按体积比1:1（v/v），压力0.1MPa，20～30℃恒温通气培养2～5天，得到三级菌种；发酵罐中的培养基同液体摇瓶培养基；
（1.4）发酵罐发酵
将三级菌种压入100L以上发酵罐，发酵罐的初始装液量为按罐容积的50～70%装液，接种 量为装液量的5～10%，通气量按体积比1:1（v/v），压力0.1MPa，20～30℃恒温通气培养5～15天，得到发酵物；发酵罐中的培养基同二级菌种培养基；
（2）发酵物中有效成分的提取和精制
（2.1）预处理
将发酵物在转速大于1000转/分钟条件下离心过滤；将上清液在低于100℃温度条件下，浓缩到原体积的1/2～1/10，得到浓缩液；
（2.2）去杂
在浓缩液中按体积比加入1～4倍乙醇，于0～40℃条件下静置沉淀5～24小时，然后在转速大于1000转/分钟离心过滤；去沉淀；将上清在温度小于100℃浓缩到原体积的1/2～1/10，得到浓缩脱醇液，同时回收乙醇；
将浓缩脱醇液按1:0.5～5的体积比，加入预处理剂，所述预处理剂为石油醚或己烷或轻汽油，混匀，萃取，去掉上层，下层的水相在温度小于100℃浓缩原体积1/2～1/10倍，得到去杂浓缩液；
（2.3）初步纯化
在去杂浓缩液中，按1:0.5～5的体积比加入萃取剂，萃取剂为丁醇或丁醇和乙酸乙酯混合物，丁醇和乙酸乙酯混合物的体积比为：2-0.5：0.5-2；萃取后去掉水层；有机相部分在低于100℃温度下浓缩到到原体积的1/2～1/10，将浓缩物在不高于170℃条件下干燥，得粗制产品；粗制产品的性状：浅黄至棕色无定形粉末；
不同批次的粗制品对酪氨酸酶的半数抑制浓度IC50为278.4～638.5μg/ml；
主要有效成分为6’-甲基-2’,4’-二羟基苯基-4-氧甲基-β-D-葡萄糖甙（6’-methyl-2’,4’-dihydroxyphenyl-4-O-methyl-β-D-glucopyranoside），含量5～15%；其化学结构见下式：
其它成分有：糖类含量为5～20%；甾醇类化合物的含量为1～5%；核苷类的含量为5～15%；其它含量为84～45%；
（2.4）色谱法精制
将粗制产品用甲醇或乙醇溶解，溶液浓度为1～20%，用色谱法分离纯化，具体操作如下：用键合相为固定相，用乙醇或甲醇和水按0～100：100～0配比进行梯度洗脱，总洗脱体积 为色谱柱体积的50到200倍；收集活性洗脱物在低于100℃温度以下浓缩到粘稠状，在低于170℃条件下干燥，得精制品；
所述键合相填料为反相碳十八填料即RPC18，颗粒直径为5～50微米；
精制品性状：白色至浅棕红色粉末或结晶；
不同批次的精制品对酪氨酸酶的半数抑制浓度IC50为37.6～65.3μg/ml；
主要有效成分为：6’-甲基-2’,4’-二羟基苯基-4-氧甲基-β-D-葡萄糖甙（6’-methyl-2’,4’-dihydroxyphenyl-4-O-methyl-β-D-glucopyranoside），含量80～99%；其化学结构见下式：
其它成分有：单糖和二糖的含量为3～0.1%；甾醇类化合物的含量为2～0.1%；核苷类的含量为3～0.1%；其它含量为12～0.7%。
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Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107916227A (zh) * | 2016-10-10 | 2018-04-17 | 浙江泛亚生物医药股份有限公司 | 一种球孢白僵菌菌株对酪氨酸酶活性的抑制 |
| WO2019088402A1 (ko) * | 2017-11-02 | 2019-05-09 | 콜마비앤에이치 주식회사 | 뷔베리신 또는 뷔베리신 유도체를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물 |
| CN110151999A (zh) * | 2019-05-22 | 2019-08-23 | 中国人民解放军第四军医大学 | 用于抑制恶性黑色素瘤进展的靶向药物 |
| CN112778792A (zh) * | 2021-03-08 | 2021-05-11 | 安徽农业大学 | 一种木霉属真菌中天然绿色色素的提取方法 |
| CN112778797A (zh) * | 2021-02-22 | 2021-05-11 | 安徽农业大学 | 一种绿僵菌中的天然绿色色素的提取方法 |
| CN112939913A (zh) * | 2021-01-04 | 2021-06-11 | 中国科学院南海海洋研究所 | 化合物Cylindromicin及其制备方法和应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102329837A (zh) * | 2011-09-01 | 2012-01-25 | 安徽农业大学 | 具有酪氨酸酶抑制剂和抗氧化剂作用的白僵菌提取物的制备方法 |
-
2013
- 2013-12-12 CN CN201310672709.1A patent/CN103751030A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102329837A (zh) * | 2011-09-01 | 2012-01-25 | 安徽农业大学 | 具有酪氨酸酶抑制剂和抗氧化剂作用的白僵菌提取物的制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| FENGLIN HU ET AL.: "Radical Scavengers from the Entomogenous Deuteromycete Beauveria amorpha", 《PLANTA MEDICA》, vol. 68, 31 December 2002 (2002-12-31), pages 64 - 65 * |
| 胡丰林等: "虫草及相关真菌的次生代谢产物及其活性", 《菌物学报》, vol. 26, no. 4, 31 December 2007 (2007-12-31), pages 607 - 632 * |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107916227A (zh) * | 2016-10-10 | 2018-04-17 | 浙江泛亚生物医药股份有限公司 | 一种球孢白僵菌菌株对酪氨酸酶活性的抑制 |
| CN107916227B (zh) * | 2016-10-10 | 2021-02-09 | 浙江泛亚保健食品有限公司 | 一种球孢白僵菌菌株对酪氨酸酶活性的抑制 |
| WO2019088402A1 (ko) * | 2017-11-02 | 2019-05-09 | 콜마비앤에이치 주식회사 | 뷔베리신 또는 뷔베리신 유도체를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물 |
| CN111093612A (zh) * | 2017-11-02 | 2020-05-01 | 科玛美保株式会社 | 包含白僵菌素或白僵菌素衍生物作为有效成分的皮肤美白用组合物 |
| CN111093612B (zh) * | 2017-11-02 | 2022-11-18 | 科玛美保株式会社 | 包含白僵菌素或白僵菌素衍生物作为有效成分的皮肤美白用组合物 |
| CN110151999A (zh) * | 2019-05-22 | 2019-08-23 | 中国人民解放军第四军医大学 | 用于抑制恶性黑色素瘤进展的靶向药物 |
| CN112939913A (zh) * | 2021-01-04 | 2021-06-11 | 中国科学院南海海洋研究所 | 化合物Cylindromicin及其制备方法和应用 |
| CN112778797A (zh) * | 2021-02-22 | 2021-05-11 | 安徽农业大学 | 一种绿僵菌中的天然绿色色素的提取方法 |
| CN112778797B (zh) * | 2021-02-22 | 2022-04-29 | 安徽农业大学 | 一种绿僵菌中的天然绿色色素的提取方法 |
| CN112778792A (zh) * | 2021-03-08 | 2021-05-11 | 安徽农业大学 | 一种木霉属真菌中天然绿色色素的提取方法 |
| CN112778792B (zh) * | 2021-03-08 | 2022-11-11 | 安徽农业大学 | 一种木霉属真菌中天然绿色色素的提取方法 |
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