CN102080049B

CN102080049B - 人参内生莫勒接霉菌及利用其制备人参皂苷Rd的方法

Info

Publication number: CN102080049B
Application number: CN 201010572006
Authority: CN
Inventors: 吕国忠; 张薇; 孙晓东
Original assignee: Dalian Nationalities University
Current assignee: Dalian Minzu University
Priority date: 2010-12-03
Filing date: 2010-12-03
Publication date: 2013-01-09
Anticipated expiration: 2030-12-03
Also published as: CN102080049A

Abstract

一种人参内生莫勒接霉菌(CGMCC No.4315)，该菌具有转化底物人参皂苷Rb₁制备Rd的能力，并且具有很高的底物单一性和产物单一性。利用该菌制备人参皂苷Rd可以采用原位转化，将其点种至含有人参皂苷Rb₁的PDA培养基上，于25℃静置培养5～7天。或者采用微生物酶法，将其接种于产酶培养基上，于28℃培养5～7天；收集酶液并将其与人参皂苷Rb₁混合后，于40℃下反应24h。采用本发明的技术方案生产人参皂苷Rd，具有专一性强、简单方便、安全可靠、成本低且无副产物的特点。发酵产物Rd的纯度在90％以上，转化率可达到60％以上。

Description

人参内生莫勒接霉菌及利用其制备人参皂苷Rd的方法

技术领域

本发明涉及一株人参内生真菌，莫勒接霉菌Zygorhynchus moelleri，以及利用该菌专一性转化底物人参皂苷Rb₁为人参皂苷Rd的方法。

背景技术

人参皂苷Rd是一种很有应用前景的候选药物，它具有特异性阻断受体依赖性钙离子通道的功能，在肾功能保护、调节免疫、抑制HeLa细胞生长、诱导COX22产生、防辐射方面具有其他单体人参皂苷所没有的独特作用；在镇痛、神经保护作用方面，Rd相对于其他单体人参皂苷也较强。因此，人参皂苷Rd可开发成防辐射，治疗心血管疾病、炎症、创伤以及由损伤引起的体内外出血等方面的药物。然而，由于人参皂苷Rd在人参属植物中含量较低，而且结构复杂，化学合成至今尚未成功，目前只能通过从人参等药用植物的根、茎、叶中提取，但其效率低，成本高，从而限制了Rd的深入研究和应用。因此，获得大量、高纯度的人参皂苷Rd具有特别重要的科学研究意义和实际应用价值。

对于人参皂苷的转化，若采用传统的化学转化法，其选择性低，副产物多，而且容易对环境造成污染。相比较而言，生物转化法具有高度专一性和无污染性等优势，因此，具有很好的应用前景。Rd与Rb₁具有相同的糖苷配基，其结构差异仅在于C3和C20位上的糖基，而Rb₁在人参中的含量较高，因此，可以通过水解Rb₁去除其C-20位上的糖基而获得，转化途径如附图1所示。目前，很多研究者都在寻找能够将Rb₁转化成Rd的微生物或者是酶，然而，大多数微生物或酶都缺少高度的专一性，甚至会将Rd进一步转化成F2、Rg3或Rh2，而生成Rd的效率很低。

利用微生物来源的酶转化主要人参皂苷生产人参皂苷Rd普遍存在的问题有：转化过程中转化产物不专一；作为转化底物的主要人参皂苷浓度不能过高；底物对酶有抑制作用等。Kim等从70多株好气菌中筛选到12株产生的酶均可将人参皂苷Rb₁转化成人参皂苷Rd，底物质量浓度为0.47mg/mL；而能将人参皂苷Rb₁较完全转化的3株细菌，均有Compound K等副产物产生（Kim M K等，The Journal of Microbiology,2005,43:456-462）。Son等利用Thermuscaldophilus产生的β-葡萄糖苷酶，将人参皂苷Rb₁转化成Rd，底物质量浓度为1mg/mL，温度为75℃。但由于人参皂苷的抑制作用，该反应底物用人参总提取物替代时，反应时间比用纯Rb₁延长30倍；当人参总提取物质量浓度达到4.2mg/mL时，人参皂苷Rd的产率从80%降低到12%（Son J W等Biotechnology Letters,2008,30:713-716）。本发明人即试图寻找新的方案，来实现人参皂苷Rd的工业化生产，满足临床需要，同时可解决人参、三七等常用中药材的资源紧缺的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可用于生物转化生产稀有人参皂苷Rd的微生物，以及使用该菌专一性转化底物人参皂苷Rb₁生产Rd的方法。

本发明的人参内生菌是发明人从人参中分离得到的一株真菌，经传统方法鉴定为莫勒接霉菌Zygorhynchus moelleri。

上述本发明的莫勒接霉菌已于2010年11月8日提交保藏，具体保藏信息如下：

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；

保藏日期：2010年11月08日；

保藏编号：CGMCC No.4315。

本发明的所述的莫勒接霉菌（CGMCC No.4315）具有如下的特征：

SMA上20℃菌落生长较快，6天长满全皿，土灰色，边缘颜色较浅，棉絮状，似青霉药味；孢子囊球形，略扁，初浅黄色，成熟后黑褐色，直径30～75μm；囊轴多为扁平的球形、半球形，有的菌株为倒卵形，无色，壁光滑，大小为20～25×26～34（50）μm；孢囊孢子多为矩形或椭圆形，少数卵形，个别近球形，壁光滑，无色，大小2.5～3×3.5～5μm；在基础菌丝和侧生孢囊梗上生有接合孢子，近球形，表面具有许多疣状突起，初呈黄褐色，成熟为黑褐色；厚垣孢子在基础菌丝中很丰富。

发明人还发现，该菌在转化人参皂苷Rb₁制备Rd的反应中，能专一地作用于底物人参皂苷Rb₁，将其转化为人参皂苷Rd；并且产物只有Rd，无副产物生成。

基于上述研究结果，本发明进一步提供一种利用所述的莫勒接霉菌（CGMCC No.4315）转化底物人参皂苷Rb₁生产人参皂苷Rd的方法。

所述的制备人参皂苷Rd的方法，其一是原位转化法，即将活化的莫勒接霉菌（CGMCC No.4315）点种至含有人参皂苷Rb₁的PDA培养基上，于25℃静置培养5～7天。搜集培养基中的转化产物即可。该方法适用于小量生产人参皂苷Rd。

所述的制备人参皂苷Rd的方法之二是微生物酶转化法，是将活化的莫勒接霉菌（CGMCC No.4315）接种于产酶培养基上，于28℃培养5～7天；收集酶液并将其与人参皂苷Rb₁混合后，于40℃下反应24h；所述的产酶培养基是：每20mL去离子水中加入麦麸15g和豆粕5g，经121℃，1.0kPa高压灭菌30min。其中所述的酶液收集方法是：加入与产酶培养基等体积的pH 5.0醋酸-醋酸钠缓冲液，搅拌1～2h；纱布过滤，滤液在8000r/min下离心10min；取离心上清液，加入3倍产酶培养基体积的95%乙醇，优选0～4℃乙醇，4℃沉淀4h；8000r/min下离心10min，去掉上清液，沉淀溶于pH 5.0醋酸-醋酸钠缓冲液并在该缓冲液中透析，离心收集上清液即可。

采用本发明的技术方案生产人参皂苷Rd，具有专一性强、简单方便、安全可靠、成本低且无副产物的特点。发酵产物Rd的纯度在90%以上，转化率可达到60％以上。

附图说明

本发明附图3幅，

图1是人参皂苷Rb₁转化为Rd的转化途径示意图；

图2是本发明的莫勒接霉菌形态照片，其中：A是孢囊；B是囊轴；C是孢囊孢子；D、E是接合孢子；

图3是本发明的莫勒接霉菌转化不同底物单一性及产物单一性试验的TLC结果。

具体实施方式

下面以具体实施例的方式对本发明的技术方案作进一步的说明，但本发明不以任何形式受限于实施例的内容。无特殊说明，本发明所用的仪器和试剂包括：人参总皂苷、各种人参单体皂苷对照品，购自吉林大学基础医学院；薄层层析板Silica Gel-60F254，德国MERCK公司产品；高效液相色谱分析仪(岛津LC-20AD)，色谱柱为C18 kromasil ODS2 250mm×4.6mm，5μm，中科院大连化学物理研究所提供；其他试剂均为分析纯试剂。

如无特殊说明，本部分产物检测所采用的TLC及HPLC条件为：

TLC检测：薄层层析板Silica Gel-60F254；展开剂V（氯仿）：V（甲醇）：V（水）=7：3：0.5；10％H₂S0₄水溶液，于110℃下烘干显色。

HPLC检测：

（1）样品处理：将萃取液在10000r/min,离心1min，用直径为0.22μm的微孔滤膜过滤。

（2）HPLC条件：流速：0.6mL/min；检测波长：203nm；柱温35℃；流动相：A为乙腈，B为高纯水；梯度洗脱流动相的比例：0min，A为20％，B为80％；18min，A为40％，B为60％；38min，A为80％，B为20％；48min，A为100％，B为0％；58min，A为80％，B为20％；78min，A为40％，B为60％；78～90min，A为20％，B为80％。

在该HPLC条件下，底物Rb₁，出峰时间为23.139min；转化产物出峰时间为25.237min；Rd标准品出峰时间为25.506min，可以进一步确定转化产物为Rd。

实施例1：菌株的分离筛选

1、分离人参内生菌：选取新鲜健康的人参，用自来水冲洗干净，经滤纸吸干水分后，先用0.1%升汞浸泡1～1.5min，经无菌水冲洗4～5次；再用75%酒精浸泡1～1.5min，经无菌水冲洗3～4次。在无菌条件下，采用经灭菌的手术剪将人参根系剪成小块（2mm×2mm），分别置于直径9cm的PDA平板上。5～7d后观察组织块周围有无菌落形成，并挑取内生真菌菌丝接种到PDA斜面培养基上纯化和保存。

培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基）：马铃薯200g，葡萄糖18g，琼脂18g，1000mL。

本实施例所采用的人参（Panax ginseng C.A.Mey）通过自行采集的方式获得，由发明人于是2009年8月采自辽宁省桓仁县。

2、菌株筛选：

（1）初步筛选：制备固体转化培养基制备培养基小块

分别将已活化好的真菌点种至块状培养基上，于25℃静置培养5～7d，将菌块浸泡在0.5mL正丁醇中，取上清液进行TLC分析。

所述固体转化培养基是：每100mL培养基中含马铃薯20g，葡萄糖1.8g，琼脂1.8g，人参总皂苷20g；去离子水配制，121℃，1.0kPa高压灭菌30min。

（2）复筛：将已初步筛选出来的活性菌种接种于产酶培养基上，28℃培养5～7d。加入100mL pH 5.0醋酸-醋酸钠缓冲液，搅拌1～2h。用纱布过滤，滤液在8000r/min下离心10min，取上清液加入300mL 95%冰乙醇，4℃沉淀4h，8000r/min下离心10min，倒掉上清液，沉淀溶于10mL缓冲液中。在该缓冲液中透析，离心收集上清液即为酶液。取0.1mL与等体积的单体皂苷溶液（溶剂是上述醋酸-醋酸钠缓冲液，浓度10mg/ml）混合，40℃下反应24h，加入0.2mL正丁醇萃取1h，取上清液进行TLC检测。

所述产酶培养基是：麦麸15g，豆粕5g，20mL去离子水，经121℃，1.0kPa高压灭菌30min。

3、菌株保存及活化培养：

筛选出的菌株接种于PDA斜面培养基上，于4℃冰箱内短期保存。

需长期保存的菌株采用低温冷冻干燥法保存，使用前活化：SMA培养基：Dextrose10g，Asparagine 2g，KH₂PO₄ 0.5g，MgSO₄·7H2O 0.25g，Thiamine chloride0.5mg，琼脂15g，蒸馏水1000ml；温度：20℃。

经过鉴定，分离筛选到的真菌（CGMCC No.4315）是莫勒接霉菌，拉丁名Zygorhynchus moelleri，其形态学特征如附图2所示。

实施例2：转化单一性试验

采用实施例1步骤2（2）的方法，试验筛选得到的莫勒接霉菌（CGMCCNo.4315）对人参皂苷底物及产物的转化选择性，经TLC检测，结果如附图3所示：

可以看出，对原二醇类皂苷Rb₁、Rb₂、Rc、Rd为底物的转化反应中，本发明筛得的莫勒接霉菌（CGMCC No.4315）仅对底物Rb₁发生反应，且转化产物仅为一种，根据Rf值可以初步判断该产物为Rd。具有很好的底物选择性及产物单一性。

实施例3：固体转化法制备Rd

①配制固体转化培养基（PDA）：每100mL培养基中含马铃薯20g，葡萄糖1.8g，琼脂1.8g，人参皂苷Rb₁ 20g；去离子水配制，121℃，1.0kPa高压灭菌30min。

②将活化的莫勒接霉菌（CGMCC No.4315）点种至上述含有人参皂苷Rb₁的PDA培养基上，于25℃静置培养5～7天。

③产物提取分离：以正丁醇浸泡培养物，充分提取；提取液在10000r/min,离心1min，用直径为0.22μm的微孔滤膜过滤后，HPLC分离目标产物，

HPLC条件：流速：0.6mL/min；检测波长：203nm；柱温35℃；流动相：A为乙腈，B为高纯水；

梯度洗脱流动相的比例：

0min，A为20％，B为80％；

18min，A为40％，B为60％；

38min，A为80％，B为20％；

48min，A为100％，B为0％；

58min，A为80％，B为20％；

78min，A为40％，B为60％；

78～90min，A为20％，B为80％。

收集24～27min洗脱液，脱除溶剂即可得产物Rd。经检测，产物Rd的纯度93%，底物转化率64%。

实施例4：微生物酶法制备Rd

①配制产酶培养基：麦麸15g，豆粕5g，20mL去离子水，经121℃，1.0kPa高压灭菌30min。

②将活化的莫勒接霉菌（CGMCC No.4315）接种于产酶培养基上，于28℃培养5～7天；

③收集酶液：加入与产酶培养基等体积的pH 5.0醋酸-醋酸钠缓冲液，搅拌1～2h；纱布过滤，滤液在8000r/min下离心10min；取离心上清液，加入3倍产酶培养基体积的95%冰乙醇（0～4℃），4℃沉淀4h；8000r/min下离心10min，去掉上清液，沉淀溶于pH 5.0醋酸-醋酸钠缓冲液并在该缓冲液中透析，离心收集上清液即得酶液；

④将所得酶液与等体积人参皂苷Rb₁溶液混合，于40℃下反应24h，该人参皂苷Rb₁溶液溶剂为步骤③所述及的醋酸-醋酸钠缓冲液，浓度10mg/ml

⑤以正丁醇为溶剂萃取反应液中的产物，按照实施例3步骤③的操作提取分离产物。经检测，产物Rd的纯度92%，底物转化率70%。

Claims

1.一种人参内生莫勒接霉菌（拉丁文学名Zygorhynchus moelleri），其特征在于：其保藏编号为CGMCC No.4315，该菌具有转化底物人参皂苷Rb₁制备Rd的能力。

2.权利要求1所述的人参内生莫勒接霉菌CGMCC No.4315，其特征在于该菌专一性作用于底物人参皂苷Rb₁，将其转化为人参皂苷Rd。

3.权利要求2所述的人参内生莫勒接霉菌CGMCC No.4315，其特征在于该菌与人参皂苷Rb₁反应产物只有Rd，无副产物生成。

4.制备人参皂苷Rd的方法，其特征在于利用权利要求1、2或3所述的莫勒接霉菌CGMCC No.4315。

5.权利要求4所述的制备人参皂苷Rd的方法，其特征在于是将活化的莫勒接霉菌CGMCC No.4315点种至含有人参皂苷Rb₁的PDA培养基上，于25℃静置培养5～7天。

6.权利要求4所述的制备人参皂苷Rd的方法，其特征在于是将活化的莫勒接霉菌CGMCC No.4315接种于产酶培养基上，于28℃培养5～7天；收集酶液并将其与人参皂苷Rb₁混合后，于40℃下反应24h；

其中所述的产酶培养基是：每20mL去离子水中加入麦麸15g和豆粕5g，经121℃，1.0kPa高压灭菌30min。

7.权利要求6所述的制备人参皂苷Rd的方法，其特征在于所述的酶液收集方法是：加入与产酶培养基等体积的pH 5.0醋酸-醋酸钠缓冲液，搅拌1～2h；纱布过滤，滤液在8000r/min下离心10min；取离心上清液，加入3倍产酶培养基体积的95%乙醇，4℃沉淀4h；8000r/min下离心10min，去掉上清液，沉淀溶于pH 5.0醋酸-醋酸钠缓冲液并在该缓冲液中透析，离心收集上清液即可。

8.权利要求7所述的制备人参皂苷Rd的方法，其特征在于所述的乙醇温度0～4℃。