CN102943103B - 青霉属真菌m1及其在提高人参或西洋参发酵过程中皂苷类化合物产量中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株青霉属真菌M1及其在提高人参或西洋参发酵过程中皂苷类化合物产量中的应用，属于生物技术领域。本发明利用功能真菌对人参或西洋参药材进行发酵培养，并对发酵前后的皂苷类化合物的含量进行分析比较，最终得到了一株能够显著提高两种药材发酵过程中皂苷类化合物产量的菌株，经鉴定该菌株为青霉属真菌(Penicillium sp.)，命名为青霉属真菌M1，该菌株保藏编号为：CGMCCNO.6359。将该菌株用于人参或西洋参的发酵生产，结果发现接种该菌株的发酵产物中皂苷类化合物的含量得到很大提高，因此，本发明的提出使得青霉属真菌在提高人参或西洋参发酵过程中人参皂苷类化合物产量方面将有广阔的应用前景。

Description

青霉属真菌M1及其在提高人参或西洋参发酵过程中皂苷类化合物产量中的应用

技术领域

本发明涉及一种青霉属真菌及其在发酵领域的新用途，特别涉及其在提高人参或西洋参发酵过程中皂苷类化合物产量中的新用途。属于生物技术领域。

背景技术

人参系五加科(Araliaceae)人参属植物人参(Panax ginseng C.A.Mey)的干燥根及根茎，具有抗疲劳、延缓衰老、调节中枢神经系统、提高机体免疫力、改善心脑血管供血不足、抑制肿瘤细胞生长等多种作用。作为传统的名贵中药，人参中含有的人参皂苷类成分具有多方面显著的药理活性。西洋参为五加科人参属植物西洋参（Panax quinquefolium L.）的干燥根，原产于北美州的加拿大和美国，后经引种进入我国，具有补气养阴，清热生津的功效，用于气虚阴亏，内热，咳喘痰血，虚热烦倦，消渴，口燥咽干等症，能够降血糖、降血脂、强心、健胃及抗衰老等，在保健和治疗上应用广泛，其主要有效成分亦为人参皂苷类成分。

目前，人参皂苷主要从人参和西洋参等植物中分离获取，由于人参和西洋参二者自身的生理特性，无论野生还是栽培通常需要四到六年才能收获药用，并且容易受到气候、栽培条件及病虫害的影响，逐渐呈现栽培土地短缺、价格日趋昂贵的态势。应用微生物发酵法提高人参皂苷的产量，与化学法和酶法等相比，反应周期短，成本低，条件容易控制。

本研究利用功能真菌对人参与西洋参药材进行发酵培养，并对发酵前后的皂苷含量进行分析比较，能够显著提高两种药材发酵产物中皂苷类成分的含量，可为人参和西洋参药材资源的充分开发和综合利用提供新方法、新途径。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够提高人参或西洋参发酵过程中皂苷类化合物产量的方法，以及一株能够提高人参或西洋参发酵过程中皂苷类化合物产量的菌株，为此，本发明采用了以下技术手段：

本发明利用功能真菌对人参或西洋参药材进行发酵培养，并对发酵前后的皂苷类化合物的含量进行分析比较，最终得到了一株能够显著提高两种药材发酵过程中皂苷类化合物的产量的菌株，经鉴定该菌株为青霉属真菌(Penicillium sp.)，命名为青霉属真菌M1，分类命名为青霉(Penicillium sp.)，该菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC NO.6359，保藏日期为2012年7月13日。

将该菌株用于人参或西洋参的发酵生产，结果发现接种了该菌株的发酵产物中皂苷类化合物的产量相较于没有接种菌种之前药材中皂苷类化合物的含量得到了很大提高，因此，本发明提出了青霉属真菌(Penicillium sp.)在提高人参或西洋参发酵过程中皂苷类化合物产量中的应用。

在本发明中，优选的，所述的青霉属真菌为青霉属真菌M1，该菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCCNO.6359。

在本发明中，所述的人参或西洋参发酵产物是指人参的根发酵产物、根茎发酵产物、叶发酵产物或茎发酵产物；或西洋参的根发酵产物、根茎发酵产物、叶发酵产物或茎发酵产物。

进一步的，本发明还提出了一种提高人参或西洋参发酵过程中皂苷类化合物产量的方法，其特征在于包括以下步骤：

称取一定量的人参或西洋参药材粉末，置于锥形瓶中，加入蒸馏水润湿药材，湿热灭菌，冷却后接入青霉属真菌种子液，20-37℃无菌暗培养3-24天。

在本发明中，优选的，所述的一种提高人参或西洋参发酵过程中皂苷类化合物产量的方法，是按照以下步骤进行的：称取一定量的人参或西洋参药材粉末，置于锥形瓶中，按照每克人参或西洋参药材粉末加入0.5-1.5ml蒸馏水的量加入蒸馏水润湿药材（即加入的蒸馏水的体积（ml）与人参或西洋参药材粉末的重量（g）比为0.5-1.5:1），121℃湿热灭菌30分钟，冷却后按照每克人参或西洋参药材粉末（未加蒸馏水润湿之前的固体粉末）加入0.25-0.75ml的量接入青霉属真菌种子液，20℃无菌暗培养6-21天；

其中，所述的青霉属真菌种子液是按照以下方法制备得到：

无菌条件下将保存的青霉属真菌菌种从试管中接入PDA平板培养基，28℃暗培养4天，用直径6mm的无菌打孔器，在长势良好的菌落边缘处打孔，取菌饼接种于装有100ml PDA液体培养基的250mL锥形瓶中，置于恒温振荡培养箱120-130r/min，28℃培养2-5天，备用。

更优选的，所述的一种提高人参或西洋参发酵过程中皂苷类化合物产量的方法，是按照以下步骤进行的：称取一定量的人参或西洋参药材粉末，置于锥形瓶中，按照每克人参或西洋参药材粉末加入1ml蒸馏水的量加入蒸馏水润湿药材（即加入的蒸馏水的体积（ml）与人参或西洋参药材粉末的重量（g）比为1:1），121℃湿热灭菌30分钟，冷却后按照每克人参或西洋参药材粉末加入0.5ml的量接入青霉属真菌种子液，20℃无菌暗培养12天；

其中，所述的青霉属真菌种子液是按照以下方法制备得到：

无菌条件下将保存的青霉属真菌菌种从试管中接入PDA平板培养基，28℃暗培养4天，用直径6mm的无菌打孔器，在长势良好的菌落边缘处打孔，取菌饼接种于装有100ml PDA液体培养基的250mL锥形瓶中，置于恒温振荡培养箱120r/min，28℃培养5天，备用。

在本发明中，优选的，所述的青霉属真菌为青霉属真菌M1，该菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCCNO.6359。

在本发明中，优选的，所述的湿热灭菌为121℃湿热灭菌30min。

在本发明中，优选的，所述的人参或西洋参药材包括人参的根、根茎、叶以及茎，还包括西洋参的根、根茎、叶以及茎。

利用本发明的方法制备得到人参或西洋参的发酵产物，经检测其中所含有的总皂苷以及单体皂苷的产量相较于未接种青霉属真菌种子液的人参或西洋参的药材粉末都有极显著的提高。

附图说明

图1为青霉属真菌M1的菌落形态（正面）；

图2为青霉属真菌M1的菌落形态（反面）；

图3为显微镜下所观察到的青霉属真菌M1的菌丝形态图；

图4为显微镜下所观察到的青霉属真菌M1的分生孢子梗及孢子形态图；

图5为菌株M1扩增产物电泳图谱；

图6为青霉属真菌M1与其他菌株的聚类结果；

图7为人参总皂苷紫外吸收光谱扫描图；

图8为接种真菌M1后人参药材发酵产物中六种单体皂苷含量变化趋势图；

图9为人参药材接种M1菌后发酵产物中六种单体皂苷的HPLC色谱图；

注：a：M1菌第0天的发酵产物；b：M1菌第18天的发酵产物；1~6依次为：人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2和Rd；

图10为接种真菌M1后人参药材发酵产物单体皂苷含量测定结果；

图11为西洋参药材的M1菌发酵产物中人参总皂苷含量变化趋势图；

图12为西洋参药材的M1菌发酵产物中皂苷含量HPLC测定色谱图；

注：a-人参皂苷标准品；b-M1菌液；c-j依次为：M1菌第0、3、6、9、12、15、18、21天的发酵产物；1~6依次为：人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2和Rd；7-8号峰：只存在于M1菌发酵产物中的新物质；9号峰：只存在于西洋参药材和M1菌初期发酵产物中的物质；

图13为接种真菌M1后西洋参药材发酵产物中单体皂苷含量变化趋势图；

图14为西洋参叶的M1菌发酵产物中总皂苷含量变化趋势图；

图15为西洋参茎的M1菌发酵产物中总皂苷含量变化趋势图。

具体实施方式

下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。

实施例1真菌M1的分离纯化

1实验仪器及材料

1.1材料

人参药材购自哈药集团世一堂制药有限公司，经黑龙江中医药大学生药学教研室都晓伟教授鉴定为五加科植物人参（Panax ginseng C.A.Mey）的干燥根及根茎。

1.2仪器

AB204-N型电子分析天平（梅特勒-托利多上海有限公司）；手提式压力蒸汽消毒器（无锡市长江医疗器械有限公司）；100级洁净工作台（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；SPX-150C型恒温恒湿箱（上海博迅实业有限公司设备厂）。

1.3用具及试剂

用具：剪刀，镊子，纱布，滤纸，脱脂棉，培养皿，试管等。

试剂：蔗糖，分析纯，天津市化学试剂一厂；葡萄糖，分析纯，天津市化学试剂一厂；琼脂，分析纯，日本产；乙醇，分析纯，北京益利精细化学品有限公司；轻质液状石蜡，药用，吉林市吉化江城油脂化工有限责任公司。

1.4马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基(PDA)的制备

马铃薯(去皮)   200g，

葡萄糖         20g，

琼脂           20g，

蒸馏水         1000mL，

将马铃薯去皮，切成约2cm³的小块，放入1500mL的烧杯中，加入1000mL蒸馏水煮沸30min，注意用玻璃棒搅拌以防糊底，然后用双层纱布过滤，取其滤液加水补足至1000mL。分装后加葡萄糖和琼脂，121℃湿热灭菌30min。

2实验方法

2.1真菌的分离

将人参药材在28℃、80%湿度条件下进行发酵培养，取不同时期培养物，随机挑取少量菌丝接种于PDA平板培养基上，每个培养皿内接种3点，同时做3个平行样。接种好的培养皿置于28℃恒温培养箱中暗培养5天，每天观察记录。另取3个不接种菌丝的空白培养皿，置于28℃恒温培养箱中暗培养7天，每天观察记录，作为空白对照组。

2.2真菌的纯化

待接种点处长出新菌丝后，根据长出菌落的形态、大小、颜色的不同，挑取菌落边缘的菌丝，接于新的平板上进行培养，继续观察。采用三点法逐步纯化，培养数日后，观察菌落的形态及颜色是否均匀，边缘是否整齐，确定是否纯化。

2.3真菌菌种保存

将多次纯化的菌种，移至试管PDA斜面培养基上，28℃下暗培养5天，待观察没有污染后，加入无菌液体石蜡，液面高于培养基上缘1cm左右，对菌株编号后，放于4℃的冰箱中保存。

3实验结果与分析

从人参培养物中分离出的真菌，经初步纯化后，菌落表面形态颜色均一，边缘整齐。对照组无杂菌长出，其菌图见图1。

实施例2活性真菌的菌种鉴定

一、活性真菌的形态学鉴定

1实验材料

1.1实验材料：人参中分离得到的真菌M1。

1.2仪器试剂：Motic BA-400数码显微图像系统，麦克奥迪公司；乳酸，化学纯，天津市凯通化学试剂有限公司；苯酚，化学纯，吉林吉化公司；甘油，化学纯，吉林吉化公司；水溶苯胺兰，上海标本模型厂。

2实验方法

2.1菌株的形态学鉴定

2.1.1标本片的制备

2.1.1.1载片培养

取直径7cm左右圆形滤纸一张，铺放于一个直径9cm的平皿底部，上放一U形玻棒，其上再平放一张干净的载玻片与一张盖玻片，盖好平皿盖进行灭菌。挑取真菌孢子接入盛有灭菌水的试管中，摇振试管制成孢子悬液备用。用灭菌滴管吸取灭菌后融化的真菌固体培养基少许，滴于上述灭菌平皿内的载玻片中央，并以接种环将孢子悬液接种在培养基四周，加上盖玻片，并轻轻压贴一下。，在滤纸上滴加灭菌后的20％甘油液3～4ml，以防止培养过程中培养基干燥，然后盖上平皿盖，放在28℃的培养箱内培养，定期取出在显微镜下观察，记录孢子萌发、菌丝的生长、孢子囊柄与孢子囊孢形成的过程、孢子着生状态等。

2.1.3.2挑片观察

在载玻片上加一滴乳酸苯酚液棉兰染色液，用接种针从生长有真菌的平板中挑取带有孢子的真菌菌丝，放入载玻片上的液滴中，并且用针尖将其分散开，盖好盖玻片即得载片标本。（乳酸苯酚液制备：苯酚10g，乳酸10g，甘油20g，蒸馏水10ml，将水与苯酚混合直到溶解，然后加入乳酸和甘油）。

2.1.3.3插片培养

插片法：将真菌接种在琼脂平板上，将灭菌的盖玻片45度角插于固体培养基中，使真菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻片上。观察时，轻轻取出盖玻片，置于载玻片上直接镜检。

3实验结果与分析

3.1菌株M1形态特征

菌落形态：菌株M1接种到马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基上，28℃，暗培养4天，观察到整个菌落致密扁平，直径2.6cm，正面呈灰绿色短毛状，菌丝平伏，边缘整齐，表面具有放射状皱纹，背面暗黄色，见图1，图2。

个体形态：显微镜下显示，菌丝纤细分枝，有隔，无色透明；菌丝发生直立的分生孢子梗；梗的顶端具有指状分枝，每枝顶端生有一串孢子，形成扫帚状见图3，图4。

二、功能真菌的分子生物学鉴定

1实验材料

实验材料

人参发酵物中分离得到的真菌M1。

实验仪器：

Motic BA-400数码显微图像系统，麦克奥迪公司；XS105 Dual Range型电子分析天平，瑞士METTLER TOLEDO公司；Allegra^TM64R型高速冷冻离心机，美国BECKMAN COULTER公司；DK-S24型电热恒温水浴锅，上海森信实验仪器有限公司；NN-GT347H型微波炉，Panasonic公司；DYY11B型三恒电泳仪、DYCP-31A型电泳槽，北京市六一仪器厂；Thermal Cycler PCR扩增仪，德国eppendorf公司；WFH-201BT型可见反射透射仪，上海精科实业有限公司；微量移液枪，dragon-med。实验试剂：

引物W0508077ITS1(序列：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')，

W0508078ITS4(序列：5'-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3')，（三博远志）

6×DNA loadingbuffer、TE缓冲液、Marker TIANGEN

Taq酶、dNTP、10×Buffer、MgCl₂，上海生工生物工程技术服务有限公司

琼脂糖、EB(溴化乙锭)，北京鼎国生物技术有限公司。

Tris-饱和酚，生物级，哈尔滨市德美生物技术有限公司

2实验方法

2.1菌株基因组DNA的提取

（1）取活性真菌斜面培养的菌种，接种于PDA液体培养基，28℃，130r/min振荡培养3天。2层纱布过滤出菌丝，用无菌水洗2次，再用灭菌生理盐水洗2次，无菌滤纸吸去菌体表面水分，获得菌丝体；

（2）将收集的菌丝加液氮研磨，置于含有700μl DNA提取缓冲液[200mMTris-HCl(PH=8.0)，25mM EDTA(PH=8.0)，250mM NaCl，0.5%SDS（PH=7.5）]的1.5ml离心管中，用微量移液枪混匀，37℃水浴30min；

（3）12000r/min离心5min，将上清液移入新的离心管中；

（4）加入等体积酚-氯仿（1:1），混匀5min，12000r/min离心5min，将上清液移入新的离心管；

（5）加入等体积氯仿，混匀，12000r/min离心2min，将上层溶液移入新的离心管中；

（6）加入2倍体积冰乙醇，-20℃放置2小时；

（7）取放置后的DNA提取液，12000r/min离心5min，去上清液，加入70%乙醇，清洗沉淀2次，12000r/min离心2min；

（8）去上清液，挥干溶剂，加入75μl 1×TE溶解沉淀即为DNA模板。

（9）DNA模板置于-20℃保存备用。

2.2PCR扩增反应

在超净工作台内配制PCR扩增试剂，扩增的反应体系如下：

PCR反应程序如下：

1、起始变性94℃5min，

2、变性94℃30s，

3、退火55℃30s，

4、延伸72℃1min，

5、延伸72℃10min。

2-4步骤进行30个循环

PCR扩增后，取扩增产物5μL，用1.5%琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液(pH7.6，4mol/L Tris-HCl，2.5ml加0.05mol/L EDTA5ml，调pH8.0，定容至250ml)，在120V/cm下电泳，约45min后，在紫外分析仪上检测条带。

2.3PCR扩增产物的序列测定与数据处理

PCR扩增产物由上海英骏生物技术有限公司北京测序部纯化测序。将测序结果与GeneBank中已知序列进行比较分析，从Genebank数据库中获得相关种属的ITS序列信息，应用CLUSTAL X1.83软件进行多序列比对，将计算结果导入PHYLIP软件，构建系统进化树。

3实验结果与分析

3.1PCR扩增产物的电泳检测

采用PCR技术对M1真菌进行DNA中特异ITS序列扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后大约在700bp处可以看到清晰的条带,表明目的序列得到扩增，菌株M1扩增产物电泳图谱如图5所示。

3.2rDNA序列测定

电泳结果显示，提取的植物样本rDNA只有一个条带，纯度很高，经过纯化的基因组DNA的纯度也完全可以满足下一步的PCR扩增。

对菌株的基因组DNA的PCR纯化产物进行测序，序列如SEQ ID NO.1所示。

3.3序列分析

登陆hppt://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/网站，将测序结果与GeneBank中已知序列进行比较分析，从Genebank数据库中获得相关种属的ITS序列信息见表1。

表1本发明所使用的ITS序列的GeneBank登录号

应用CLUS TAL X1.83软件进行多序列比对，将计算结果导入

PHYLIP软件，构建系统进化树见图6。

采用形态学鉴定和分子生物学鉴定相结合的方式对真菌进行了鉴定，初步确定M1为青霉属(Penicillium sp.)真菌。该菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC NO.6359，保藏日期为2012年7月13日。

实施例3人参药材在M1真菌发酵过程中总皂苷及单体皂苷产量变化的研究

一、人参药材在真菌发酵过程中总皂苷产量变化的研究

1实验材料

1.1仪器

722型紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）

KQ-500DE型医用数控超声波提取器（昆山市超声仪器有限公司）

RE-52型旋转蒸发仪（上海博通科技有限公司）

SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）

AB204-N型电子分析天平（梅特勒-托利多上海有限公司）

SPX-150C型恒温恒湿箱（上海博迅实业有限公司设备厂）

1.2药品及试剂

人参皂苷对照品Re购于中国药品生物制品检定所(供含量测定用)。

香草醛：天津市化学试剂一厂，化学纯；

浓硫酸：北京化学试剂厂，分析纯；

甲醇：北京益利精细化学品有限公司，分析纯；

冰醋酸，正丁醇，氨水，均为分析纯。

1.3供试菌株

从人参培养物中分离得到的真菌M1（保藏编号CGMCC NO.6359）。

1.4固体发酵基质

人参药材粉末（过40目筛），来源同实施例1。

2实验方法及结果

2.1种子液的制备

无菌条件下将保存的菌种M1从试管中接入PDA平板培养基，28℃暗培养4天，用直径6mm的无菌打孔器，在长势良好的菌落边缘处打孔，取菌饼接种于装有100ml PDA液体培养基的250mL锥形瓶中，置于恒温振荡培养箱130r/min，28℃培养2天，备用。

2.2锥形瓶固体发酵

准确称取人参药材粉末若干份，每份5g，置于50ml锥形瓶中，加入5ml蒸馏水润湿药材，121℃湿热灭菌30min，冷却后接入上述种子液3.75ml（接种量为0.75ml/g），28℃无菌暗培养24天，期间每隔三天进行取样分析。

2.3发酵产物中总皂苷含量的测定

2.3.1标准曲线的制备

精密称定人参皂苷对照品Re适量，分别加甲醇制成浓度为0.75mg/ml，1.5mg/ml，2.25mg/ml，3mg/ml，3.75mg/ml，4.5mg/ml溶液，精确量取不同浓度对照品溶液各40μl，分别置带塞试管中，40℃水浴加热蒸干甲醇，冷后，加入新配制的5%香草醛冰醋酸（将5g香草醛溶于冰醋酸中并定容至100ml，即得）溶液0.5ml及70%（V/V）浓硫酸溶液5ml，轻轻振摇，置60℃水浴中加热15min，冷水浴急速冷却7min，充分摇匀，随行空白，经400~800nm范围全波长扫描，结果在535nm处产生最大吸收峰，紫外吸收图见图7。

将不同浓度的标准品溶液在535nm处测定吸收度，以人参总皂苷含量为横坐标，以吸收度为纵坐标，绘制标准曲线。得回归方程为y=5.7048x-0.0457，R2=0.9991，线性范围0.03-0.18mg，结果见表2。

表2人参总皂苷标准曲线数据表

2.2.2样品溶液的制备

取药材培养物，50℃烘干，70%甲醇超声提取3次，每次15min，合并提取液，回收甲醇，残渣以水饱和正丁醇50ml，分次转移到分液漏斗中，加氨试液振摇提取2次，每次5ml，弃去氨液，正丁醇液用正丁醇饱和水洗涤2次，每次10ml，弃去水液，取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇转移至10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.2.3精密度实验

精密吸取Re对照品溶液40μl，同标准曲线项下操作，在535nm处测定吸收度，五次实验所测得吸收度值A的RSD为0.04％，结果见表3。

表3总皂苷测定方法精密度实验结果

2.2.4重现性实验

取同一人参样品粉末，按照样品制备方法平行操作制备5份供试品溶液，再按照标准曲线项下测定吸收度值，用标准曲线法计算总皂苷含量，5次实验的RSD为1.88％，结果见表4。

表4总皂苷测定方法重现性实验结果

2.2.5显色剂稳定性考察

取样品溶液20μl，按标准曲线项下操作，显色后每10min间隔测定吸收度值，结果见表5，表明样品和标准品在显色后60min内稳定。

表5总皂苷测定方法显色剂稳定性实验结果

2.2.6加样回收率实验

精密称取已知含量的人参粉末5份，分别加入适量的人参皂苷Re对照品，按供试品溶液制备方法操作，按照标准曲线项下方法测定吸收度值，结果五次测得加样回收率平均值为99.74％，RSD为2.35%，结果见表6。

表6总皂苷测定方法加样回收率实验结果

2.2.7发酵物样品的测定

每隔3天取样，测定发酵产物中总皂苷含量变化。精密吸取培养物样品溶液20μl，分别置带塞试管中，按照标准曲线项下操作，测得各样品的吸收度值，根据标准曲线计算总皂苷含量。

采用SPSS18.0统计学软件进行数理统计，结果见表7，图8。

2.2.8发酵物样品测定结果

表7接种真菌M1后的发酵产物中总皂苷含量测定结果

注：与原药材比较有极显著性差异(**p<0.01)

由表7和图9可以看出，接种M1后的人参药材发酵产物中总皂苷含量变化显著，变化趋势为先升高，到达最高点后逐渐下降，统计表明第3天到第18天期间人参总皂苷含量与原药材比较均有极显著性差异(p<0.01)。根据曲线可知在第12天达到最高点，最高增长率达103.82%。

二、人参药材在真菌发酵过程中单体皂苷产量变化的研究

1实验仪器及材料

1.1仪器

Waters2695型四元液相色谱泵，2996型二极管阵列检测器；Millennium³²色谱工作站；其他仪器与试剂同实施例3第一节。

1.2试剂

乙腈：HPLC级，美国天地（TEDIA）试剂公司；

水：娃哈哈纯净水，杭州娃哈哈集团公司；

其他仪器与试剂同实施例3第一节。

1.3对照品

人参皂苷对照品Rg₁，Re，Rb₁购于中国药品生物制品检定所(供含量测定用)，Rc、Rb₂、Rd购自成都曼斯特生物技术有限公司（供含量测定用）

1.4供试菌株

从人参培养物中分离出的真菌M1（保藏编号CGMCC NO.6359）。

1.5固体发酵基质

人参药材粉末（过40目筛），来源实施例1.

2实验方法及结果

2.1培养方法

同前。

2.2发酵产物含量测定

2.2.1色谱条件

色谱柱：Diamonsil C₁₈色谱柱(250mm×4.6mm，7μm)(迪马科技)；

流动相：乙腈(A)－水(B)梯度洗脱：0~55min，18~43%A，82~57%B，

流速1.3ml/min，检测波长203nm，柱温40℃，进样量20μl。

2.2.2标准曲线的制备

精密称定人参皂苷对照品Rg₁，Re，Rb₁，Rc，Rb₂和Rd适量，加甲醇制成Rg₁，Re，Rb₁，Rc，Rb₂和Rd的浓度分别为0.03mg/ml，0.40mg/ml，0.20mg/ml，0.075mg/ml，0.02mg/ml和0.075mg/ml的对照品混和溶液。精确取对照品混合溶液5μl、10μl、15μl、20μl、40μl、60μl、80μl分别注入HPLC色谱仪，按照上述色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标，各单体皂苷含量为横坐标作标准曲线，线性回归方程、相关系数和线性范围见表8。

表86种单体皂苷的线性关系

Y：峰面积；X：人参皂苷含量（μg）；n=3

2.2.3精密度实验

精确吸取对照品混合溶液20μl，按照上述色谱条件测定，连续进样5次，测定人参皂苷Rg₁，Re，Rb₁，Rc，Rb₂和Rd峰面积，6种成分峰面积积分值RSD均小于或等于2.33%，结果见表9。

表9单体人参皂苷测定的精密度实验结果

2.2.4重现性实验

取人参粉末2g，按照样品溶液制备方法，最后甲醇定容至10ml，平行操作制备5份样品，进样20μl，用标准曲线法测定人参皂苷Rg₁，Re，Rb₁，Rc，Rb₂和Rd的含量，6种成分含量测定的RSD值均小于3％，结果见表10。

表10单体人参皂苷测定的重现性实验结果

2.2.5稳定性实验

精密称取人参药材粉末1g，按照样品溶液制备项下操作，平行操作制备5份样品溶液，测定样品溶液的峰面积积分值。室温条件下每4小时进样分析，样品溶液在12小时内稳定，结果见表11。

表11样品室温下稳定性实验结果

2.2.6加样回收率实验

精密称取已知含量的人参粉末5份，分别加入适量的人参皂苷Re对照品，按供试品溶液制备方法操作，进样20μl，用标准曲线法测定人参皂苷Re含量，结果五次测得加样回收率平均值为99.68％，RSD为0.85%，结果见表12。

表12单体人参皂苷测定方法加样回收率实验结果

2.2.7样品溶液的制备

分别取M1发酵后第0天、6天、12天、18天培养物，50℃烘干，按照供试品处理方法制备样品。

2.2.8人参皂苷HPLC含量测定

精密吸取各样品溶液20μl注入高效液相色谱仪，测定人参培养物中6种单体皂苷含量，液相色谱图见图9，测定结果见表13，图10。

表13M1发酵产物单体皂苷含量测定结果(mg/g)

注：*：与原药材比较有显著性差异(p<0.05)；

**：与原药材比较有极显著性差异(p<0.01)

由表13可看出，在接种真菌M1后的培养过程中，6种单体皂苷均呈现显著性变化，图10表明，人参皂苷Rg₁、Re、Rb₁呈现下降趋势，Rc、Rb₂为先升高后降低的趋势，Rd则明显上升，6种皂苷总含量变化趋势同总皂苷含量变化趋势相同，在第12天左右达到最高点，6种皂苷总含量的增长率最高为39.23%。

实施例4西洋参药材与M1真菌发酵过程中皂苷产量动态变化的研究

一、西洋参药材与M1真菌发酵过程中总皂苷产量动态变化研究

1.实验材料

西洋参药材来自黑龙江省方正林业局西洋参栽培场，经黑龙江中医药大学生药学教研室都晓伟教授鉴定为五加科植物西洋参（Panax quinquefolium L.）的干燥根及根茎，粉碎成西洋参干燥药材粉末(过40目筛)。

实验仪器、试剂及供试菌株同人参实验。

2.实验方法

2.1种子液的制备

无菌条件下将保存于试管中的M1菌种用灭过菌的接种针挑出，并接入PDA平板培养基中进行活化，置于恒温恒湿培养箱中培养，28℃条件下暗培养。待菌落生长良好并无其他杂菌污染时，用直径6mm的无菌打孔器，分别在长势良好的菌落边缘处打孔，然后将菌饼接于盛有100ml PD液体培养基的250mL锥形瓶中，置于恒温振荡培养箱中进行培养，120r/min，28℃培养5天，备用。

2.2锥形瓶固体发酵

准确称取西洋参药材干燥粉末若干份，每份2g，置于50ml锥形瓶中，加入2ml蒸馏水并用玻璃棒搅拌均匀，使药材湿润。盖上棉塞并用牛皮纸封口，放入蒸汽消毒器中进行湿热灭菌，121℃条件下灭菌30min，取出后放入无菌洁净台中，待冷却后在无菌条件下接入上述种子液1ml（接种量为0.5ml/g），并于恒温恒湿培养箱中进行培养，20℃条件下无菌暗培养21天，期间每隔三天进行一次取样分析。

2.3样品溶液的制备

取西洋参药材发酵物1g，50℃烘干，加入新配制的70%甲醇超声提取3次，每次15min，合并提取液，回收甲醇，残渣以水饱和正丁醇50ml，分次转移到分液漏斗中，振摇后静置，弃去下层水液，正丁醇液用正丁醇饱和水洗涤2次，每次10ml，弃去下层水液，取正丁醇液，回收正丁醇，残渣加甲醇转移至5ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.4发酵产物中总皂苷含量的测定

每隔3天随机取出西洋参药材发酵产物，并测定发酵产物中总皂苷的含量变化，测定方法同人参项下，测定结果见表14和图11。

3.实验结果

表14M₁菌与西洋参药材发酵产物中人参总皂苷含量测定结果（n=3）

注：**与原药材比较有极显著性差异(p<0.01)

由表14和图11可以看出，接种M1真菌后的西洋参药材的发酵产物中人参总皂苷含量变化显著，变化趋势为先升高到达最高点，然后逐渐下降，统计表明第6天到第18天期间人参总皂苷含量与西洋参原药材比较均有极显著性差异(p<0.01)。增长率数理统计结果表明，西洋参药材的M1菌发酵产物从3天至21天培养，于第12天达到最高点，最高增长率为28.18%。

二、西洋参药材与真菌M1发酵过程中单体皂苷产量动态变化研究

1.实验仪器及材料、试剂、对照品

1.1供试菌株

本实验室分离得到的真菌M1（保藏编号CGMCC NO.6359）

1.2固体发酵基质

西洋参干燥药材粉末(过40目筛)，来源同前。

实验仪器、试剂及对照品同人参药材发酵过程中单体皂苷含量动态变化研究。

2.实验方法

2.1西洋参药材发酵培养方法

同西洋参总皂苷含量测定项下方法。

2.2样品溶液的制备

同西洋参总皂苷含量测定项下方法。

2.3发酵产物中单体皂苷含量的测定

分别精密移取各样品溶液20μl注入高效液相色谱仪，测定西洋参药材发酵产物中6种单体皂苷的含量。液相色谱图见图12，测定结果见表15、表16和图13。

3实验结果

表15M1菌与西洋参药材发酵产物中单体皂苷含量测定结果(mg/g)n=3

注：*：与原药材比较有显著性差异(p<0.05)；

**：与原药材比较有极显著性差异(p<0.01)

表16接种M1菌的西洋参药材发酵产物中单体皂苷含量变化趋势的线性关系

表15中数理统计结果表明，接种M1菌的发酵产物中，6种单体皂苷与西洋参原药材相比均呈现显著性变化。由图13和表16可知，人参皂苷Rg₁呈现持续增高趋势，并于第21天达到最大值2.2116mg/g；Re呈现先升高后降低的趋势，于第12天达到最大值4.4531mg/g；Rb₁呈现持续下降的趋势，由8.5549mg/g降至0.2053mg/g；Rc呈现先升高后降低的趋势，于第12天达到最大值2.5343mg/g；Rb₂变化缓慢，于第12天达到最大值0.4735mg/g，随后逐渐降低；Rd呈现先升高后降低的趋势，于第12天达到最大值13.0642mg/g。6种单体皂苷含量总和与西洋参原药材相比呈现显著性变化，于第12天达到最大值23.8602mg/g，最高增长率为51.17%。

实施例5西洋参茎叶与M1真菌发酵过程中总皂苷产量动态变化研究

一、西洋参叶与接种M1真菌后发酵过程中总皂苷产量动态变化研究

1.实验仪器及材料

西洋参叶干燥粉末(过40目筛)，来源同西洋参药材。

供试菌株为本实验室分离得到的真菌M1（保藏编号CGMCC NO.6359）。

实验仪器、试剂及对照品均同西洋参药材发酵过程中总皂苷产量动态变化研究。

2.实验方法

2.1种子液制备

同实施例4。

2.2锥形瓶固体发酵

同实施例4，培养时间改为24天。

2.3发酵产物总皂苷含量测定

每隔3天随机取出西洋参叶发酵产物，样品溶液制备方法及总皂苷测定方法同西洋参药材。

3.实验结果

测定结果列于表17，发酵物中总皂苷含量变化趋势见图14。

表17接种M1菌后的西洋参叶发酵产物中人参总皂苷含量测定结果（n=3）

注：**与原药材比较有极显著性差异(p<0.01)

由表17和图14可以看出，接种M1菌的西洋参叶发酵产物中总皂苷含量变化显著，呈现先升高到达最高点，然后逐渐下降的趋势。统计结果表明，从第6天到第21天期间发酵产物中总皂苷含量与西洋参叶比较均有极显著性差异(p<0.01)。增长率数理统计结果表明，西洋参叶的M1菌发酵产物从6天至24天培养期间，于第12天达到最大值，最高增长率为43.46%。

二、西洋参茎与M1真菌发酵过程中总皂苷产量动态变化研究

1.实验仪器及材料

西洋参茎干燥粉末(过40目筛)，来源同西洋参药材。供试菌株为本实验室分离得到的真菌M1。实验仪器、试剂及对照品均同西洋参药材发酵过程中总皂苷产量动态变化研究。

2.实验方法

2.1种子液制备

同实施例4。

2.2锥形瓶固体发酵

同实施例4，培养时间改为24天。

2.3发酵产物总皂苷含量测定

每隔3天随机取出西洋参茎发酵产物，样品溶液制备方法及总皂苷测定方法同西洋参药材。

3实验结果

测定结果列于表18，发酵物中总皂苷含量变化趋势见图15。

表18接种M1菌的西洋参茎发酵产物中人参总皂苷含量测定结果（n=3）

注：**与原药材比较有极显著性差异(p<0.01)

由表18和图15可以看出，接种M1菌的西洋参茎发酵产物中总皂苷含量变化显著，呈现先升高到达最高点，然后逐渐下降的趋势。统计结果表明，从第6天到第24天期间发酵产物中总皂苷含量与西洋参茎比较均有极显著性差异(p<0.01)。增长率数理统计结果表明，西洋参茎的M₁菌发酵产物自6天至24天培养期间，于第12天达到最大值，最高增长率为27.83%。

实施例6影响西洋参药材与活性真菌M1发酵过程中总皂苷含量变化主要因素的考察

1.实验因素与水平

根据预实验结果及相关文献报道，选取培养温度(A)、接种量(B)、料液比(C)三个实验因素，每个因素三个水平进行优化实验设计，并以发酵产物中人参总皂苷含量作为考察的指标，采用L₉(3⁴)表安排设计实验，具体因素水平见表19。

表19正交设计因素水平

按照西洋参与M1真菌发酵物总皂苷含量测定项下方法（实施例4）进行种子液的制备及发酵培养，其中接种量为每克西洋参药材粉末（未加蒸馏水润湿之前的固体粉末）中所加入的青霉属真菌M1的种子液的体积（ml），料液比为加入固体物的质量(g)与所加入蒸馏水的体积(ml)的比例，固体发酵时间为6天。

2.实验结果与分析

2.1M1菌发酵产物中人参总皂苷含量变化影响因素考察

M1菌发酵产物中人参总皂苷含量变化影响因素正交实验结果见表20，影响因素方差分析结果见表21。

表20接入M1菌后发酵产物中人参总皂苷含量变化影响因素正交实验结果

表21接入M1菌后发酵产物中人参总皂苷含量变化影响因素方差分析表

F_0.05(2，2)=19.00

根据方差分析可以看出A因素对提取效果有显著影响，B、C因素对提取效果影响不明显。由极差分析的结果可知，影响M1菌发酵产物中人参总皂苷含量各因素的主次顺序为A>B>C，即温度>接种量>料液比。根据实验结果分析可知，最佳培养条件为A1B2C2，即20℃条件下，接种量为0.5ml/g，料液比为1∶1g/ml，在此条件下发酵产物中人参总皂苷含量最高。

Claims (8)

1.青霉属真菌(Penicillium sp.)在提高人参或西洋参发酵过程中皂苷类化合物产量中的应用，其中，所述的青霉属真菌为青霉属真菌M1，该菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC NO.6359。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的人参或西洋参发酵产物是指人参的根发酵产物、根茎发酵产物、叶发酵产物或茎发酵产物；或西洋参的根发酵产物、根茎发酵产物、叶发酵产物或茎发酵产物。

3.一株青霉属真菌，命名为青霉属真菌M1，所述菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC NO.6359。

4.一种提高人参或西洋参发酵过程中皂苷类化合物产量的方法，其特征在于包括以下步骤：

称取一定量的人参或西洋参药材粉末，置于锥形瓶中，加入蒸馏水润湿药材，湿热灭菌，冷却后接入青霉属真菌种子液，20-37℃无菌暗培养3-24天；所述的青霉属真菌为青霉属真菌M1，该菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC NO.6359。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于称取一定量的人参或西洋参药材粉末，置于锥形瓶中，按照每克人参或西洋参药材粉末加入0.5-1.5ml蒸馏水的量加入蒸馏水润湿药材，121℃湿热灭菌30分钟，冷却后按照每克人参或西洋参药材粉末加入0.25-0.75ml的量接入青霉属真菌种子液，20℃无菌暗培养6-21天；

其中，所述的青霉属真菌种子液是按照以下方法制备得到：

无菌条件下将保存的青霉属真菌菌种从试管中接入PDA平板培养基，28℃暗培养4天，用直径6mm的无菌打孔器，在长势良好的菌落边缘处打孔，取菌饼接种于装有100ml PDA液体培养基的250mL锥形瓶中，置于恒温振荡培养箱120-130r/min，28℃培养2-5天，备用。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于称取一定量的人参或西洋参药材粉末，置于锥形瓶中，按照每克人参或西洋参药材粉末加入1ml蒸馏水的量加入蒸馏水润湿药材，121℃湿热灭菌30分钟，冷却后按照每克人参或西洋参药材粉末加入0.5ml的量接入青霉属真菌种子液，20℃无菌暗培养12天；

其中，所述的青霉属真菌种子液是按照以下方法制备得到：

无菌条件下将保存的青霉属真菌菌种从试管中接入PDA平板培养基，28℃暗培养4天，用直径6mm的无菌打孔器，在长势良好的菌落边缘处打孔，取菌饼接种于装有100ml PDA液体培养基的250mL锥形瓶中，置于恒温振荡培养箱120r/min，28℃培养5天，备用。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述的湿热灭菌为121℃湿热灭菌30min。

8.如权利要求4-6任一项所述的方法，其特征在于所述的人参或西洋参药材包括人参的根、根茎、叶以及茎，还包括西洋参的根、根茎、叶以及茎。

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