CN105039174B - 产丹皮酚的牡丹内生真菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种产丹皮酚的牡丹内生真菌及其应用，属于植物内生真菌技术领域。本发明从牡丹植株中分离出了一株能够产丹皮酚的内生真菌G1‑1，为镰刀菌属(Fusarium sp.)，保藏编号：CCTCC NO:M 2014662，保藏日期：2014年12月24日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学。该菌株能够合成丹皮中主要的有效成分丹皮酚，通过大规模发酵培养镰刀菌属G1‑1，即可在短时间内获得大量菌丝，从而获得丹皮酚，该方法可替代采挖植物药材获得丹皮酚，为生产丹皮酚提供新的思路。
Description
技术领域
本发明涉及一种产丹皮酚的牡丹内生真菌，以及该内生真菌在产丹皮酚和制备生防菌剂中的应用，属于植物内生真菌技术领域。
背景技术
植物内生真菌是指整个生活史或者生活史中的某一个阶段存在于植物组织内部或者组织间隙，且不会引起宿主出现明显病症或者没有对宿主造成明显伤害的一类真菌。国内外越来越多的研究表明，植物在与内生真菌相互作用的过程中，内生真菌能产生与植物相同或相似的活性物质。内生真菌次生代谢产物的种类繁多，包括生物碱类、醌类、酚、甾体类、萜类、肽类等，药理活性广泛，主要表现为抗肿瘤、抗菌、抗病毒、杀虫、抗结核等。目前，从药用植物中分离培养能产生活性物质的内生真菌已成为学者的研究趋势。
牡丹是我国特有的木本名贵花卉，在我国山东菏泽、安徽铜陵、重庆垫江、河南洛阳等地均有大规模商品化种植。丹皮又称为牡丹皮，为牡丹的干燥根皮，其性微寒，味苦、辛，归心、肝、肾经，具有清热凉血、活血化瘀的功效，为我国传统中药材。丹皮酚是牡丹丹皮中主要的有效药用活性成分，凤丹皮作为丹皮中的道地药材，其丹皮酚含量最高。丹皮酚具有解热、镇痛、抗真菌、抗病毒、抗癌等作用。从牡丹中分离出能产生丹皮酚的内生真菌，将为丹皮酚的生产提供有益帮助。
发明内容
本发明的目的是提供一种产丹皮酚的牡丹内生真菌。
同时，本发明还提供一种上述牡丹内生真菌在生产丹皮酚或制备生防菌剂中的应用。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
产丹皮酚的牡丹内生真菌，为镰刀菌属(Fusarium sp.)G1-1，保藏编号：CCTCCNO:M 2014662，保藏日期：2014年12月24日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学(湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)。
产丹皮酚的牡丹内生真菌(CCTCC NO:M 2014662)G1-1为镰刀菌属，镰刀菌属无性时期原属于半知菌类，丛梗孢目，瘤座孢科。在PDA培养基上生长5d后，菌落呈现白色，呈立体放射状生长，菌落直径达到7cm，几乎覆盖整个平板，菌丝生长高度达到0.5cm，培养基背面呈现红褐色，菌落质地疏松，继续培养到30d，菌落颜色一直呈现白色，培养基背面呈现的红褐色继续加深。继续培养到45d后，观察显微结构，发现分生孢子梗短粗，分生孢子无色，大型分生孢子两端尖，弯曲状，呈镰刀形。
产丹皮酚的牡丹内生真菌(CCTCC NO:M 2014662)在生产丹皮酚中的应用。
产丹皮酚的牡丹内生真菌(CCTCC NO:M 2014662)在制备生防菌剂中的应用。
本发明的有益效果：
本发明从牡丹植株中分离出了一株能够产丹皮酚的内生真菌G1-1，在PDA培养基上生长5d后，菌落呈现白色，呈立体放射状生长，菌落直径达到7cm，几乎覆盖整个平板，菌丝生长高度达到0.5cm，培养基背面呈现红褐色，菌落质地疏松，继续培养到30d，菌落颜色一直呈现白色，培养基背面呈现的红褐色继续加深。继续培养到45d后，观察显微结构，发现分生孢子梗短粗，分生孢子无色，大型分生孢子两端尖，弯曲状，呈镰刀形。ITS序列分析表明，内生真菌G1-1基因组扩增序列与序列编号FJ478128.1的序列相似性高达99％，结合形态学观察结果，鉴定该内生真菌G1-1为镰刀菌属(Fusarium sp.)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M 2014662。
本发明中牡丹内生真菌(CCTCC NO:M 2014662)能够合成丹皮中主要的有效成分丹皮酚，通过大规模发酵培养镰刀菌属G1-1，即可在短时间内获得大量菌丝，从而获得丹皮酚，该方法可替代采挖植物药材获得丹皮酚，为生产丹皮酚提供新的思路。
保藏证明和存活证明说明
保藏菌株：产丹皮酚的牡丹内生真菌，为镰刀菌属(Fusarium sp.)G1-1，保藏编号：CCTCC NO:M 2014662，保藏日期：2014年12月24日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学(湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)。
附图说明
图1为实施例1中供试品G1-1提取液的GC色谱图；
图2为对照品丹皮酚的GC色谱图；
图3为内生真菌G1-1的菌落形态图；
图4为内生真菌G1-1的孢子囊形态图；
图5为内生真菌G1-1基因组PCR扩增产物的电泳图；
图6为内生真菌G1-1的系统进化树；
图7为丹皮酚对照品的标准曲线。
具体实施方式
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1
一、牡丹内生真菌的分离培养
牡丹内生真菌(CCTCC NO:M 2014662)分离自健康的人工种植的洛阳凤丹的根、茎、叶，凤丹采自洛阳牡丹园种植基地，植株年龄五年，植株健壮，无病虫害(详见“遗传资源来源披露登记表”)。
具体的分离培养步骤如下：
1)将五年生牡丹植株的根和茎切成1.5cm左右的小段，叶切成2cm2左右的小片，在超净工作台内对其表面消毒：根和茎分别用75％的酒精浸泡1min，无菌水冲洗干净，再浸泡于5％次氯酸钠溶液4min，无菌水冲洗干净，在无菌水中漂洗；叶用75％的酒精浸泡20s，无菌水冲洗干净，在无菌水中漂洗，再浸泡于5％次氯酸钠溶液45s，无菌水冲洗干净，在无菌水中漂洗；
2)将消毒过的根和茎用无菌手术刀纵向剖开，叶剪成梳状，将根和茎的纵剖面平铺在加有庆大霉素(4万U/L)的PDA培养基平皿上，叶平铺在平皿中，各重复5次，同时取消毒过程中的前中后三个阶段的漂洗液滴在培养皿中做对照来验证表面消毒的状况；
3)将上述培养皿放入25℃恒温培养箱中培养，每天定时观察记录内生真菌的生长状况，在培养基上观察到有菌丝生成时，及时采用尖端菌丝挑取法，挑取形态不同的菌丝或菌落移种到新鲜PDA培养基上，继续培养，待长出菌丝后继续分离纯化，直到分离到单一菌株；
4)将单一菌株接种在PDA试管斜面培养基中，4℃保存备用。
PDA培养基制备方法如下：取新鲜马铃薯200g，切块，用蒸馏水煮沸30min，四层纱布过滤取滤液，之后加入葡萄糖20g，琼脂17g充分溶解后再用蒸馏水补足到1000mL。将配成的培养基在121℃下灭菌30min后，在超净工作台内分装至无菌培养皿中备用。
斜面PDA培养基为：取5mL PDA培养基装于试管中，121℃高压灭菌30min，铺成斜面冷却，以备保存菌种。
结果：从五年生洛阳凤丹的根，茎，叶中分离出内生真菌41株，并且对照组培养基上并未长菌，证明所消毒程序彻底，分离到的菌是植物内生真菌，而不是表面的附生菌。
二、牡丹内生真菌产丹皮酚能力的测定
将分离到的单一菌株进行扩大培养：分离到的每株内生真菌接种20个90mm的PDA培养皿，倒置在25℃恒温培养箱中培养25天，待菌丝成熟后，用无菌手术刀片刮取菌丝，将刮取的菌丝用无水甲醇进行研磨，研磨碎之后按照1g/20mL料液比用甲醇定容，在室温下进行超声浸提30分钟，取浸提液加入2mL离心管中，以8000r/min的转速离心10分钟，之后取上清液，用0.22μm的微孔滤膜进行过滤，取其滤液做成内生真菌提取物。同时，将市售的丹皮酚标准品晶体用甲醇溶解，做成标准品溶液。
取内生真菌提取物进行GC检测，丹皮酚的标准品同时也进行GC检测，GC检测条件：色谱柱为Agilent HP-5MS石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；载气为高纯氦气，流速为1mL·min-1；进样口温度250℃，气化温度280℃。电子能量70eV，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，扫描范围20～350aum。
将内生真菌提取物的GC检测结果和标准品GC检测结果进行比对，若提取物检测结果的出峰时间和标准品一致，则能判定内生真菌提取物中含有和标准品一致的化学物质。结果发现其中一株G1-1菌的检测结果在6.85分钟(见图1)有一处明显峰和丹皮酚标准品出峰时间：6.87分钟(见图2)一致，表明G1-1菌株产生了丹皮酚。注：图1、图2中字母A均表示丹皮酚。
三、菌落形态及孢子形态鉴定
取筛选的内生真菌G1-1，根据《真菌鉴定手册》进行形态学鉴定，其菌株的菌落特征和孢子形态与镰刀菌属极为相近，菌落形态以及孢子形态如图3、图4所示。图3中A为培养基正面，B为背面。
内生真菌G1-1在PDA培养基上生长5d后，菌落呈现白色，呈立体放射状生长，菌落直径达到7cm，几乎覆盖整个平板，菌丝生长高度达到0.5cm，培养基背面呈现红褐色，菌落质地疏松，继续培养到30d，菌落颜色一直呈现白色，培养基背面呈现的红褐色继续加深。继续培养到45d后，观察显微结构，发现分生孢子梗短粗，分生孢子无色，大型分生孢子两端尖，弯曲状，呈镰刀形。其生长温度为25℃，生长pH值自然。
四、分子鉴定
取适量真菌组织在研钵中加入液氮充分研磨成细粉，然后采用DN41真菌基因组DNA快速提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)提取基因组DNA，利用通用引物ITS1(如SEQ ID NO.1所示)和ITS4(如SEQ ID NO.2所示)，对目的片段进行扩增，PCR产物琼脂糖电泳后经DNA胶纯化试剂盒(AXYGEN公司)回收纯化，成像结果如图5所示，图中左边泳道表示Marker，右边泳道表示扩增产物。在550bp附近得到一扩增片段，证明已成功从G1-1菌株中提取其基因组DNA。纯化产物上海生工生物工程公司测序，测序结果的碱基序列如SEQ IDNO.3所示。
测得的ITS序列在NCBI数据库中应用BLAST分析进行同源性比较，结果发现该序列与序列编号FJ478128.1的序列(Fusarium solani strain xsd0808618S ribosomal RNAgene)相似性高达99％，与相似性较高几个序列建立进化树(见图6)，并结合形态学观察，确定内生真菌G1-1为镰刀菌属(Fusarium)。
将牡丹内生真菌G1-1交由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，名称为镰刀菌属(Fusarium sp.)G1-1，保藏编号：CCTCC NO:M 2014662，保藏日期：2014年12月24日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学(湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)。
试验例
牡丹内生真菌(CCTCC NO:M 2014662)G1-1菌丝中丹皮酚含量的测定：
一、马铃薯葡萄糖液体培养基发酵培养法培养G1-1
马铃薯葡萄糖液体培养基配制方法：取新鲜马铃薯200g，切块，用蒸馏水水煮沸30min，四层纱布过滤取滤液，之后加入葡萄糖20g，充分溶解后再用蒸馏水补足到1000mL。将配成的液体培养基在121℃下灭菌30min后，在超净工作台内分装至无菌的150mL的三角瓶内，每个三角瓶内装100mL。
从PDA平板上取直径为0.5cm的G1-1(25℃恒温培养7天)菌饼分别接种到盛有100mL液体培养基的4个150mL三角瓶中(8个/瓶)，放入25℃气浴摇床中，以150r/min的转速，震荡培养7天。培养7天后，用真空抽滤的方法得到新鲜菌丝，称取其重量；新鲜菌丝按照1g/20mL的比例用甲醇进行研磨，研磨后装入具塞三角瓶内在室温下进行超声浸提30min，浸提后静置，取上清液置于10mL离心管中，以12000r/min的转速离心5min，再次取上清液，放入10mL的离心管中得菌丝提取液，以供用紫外分光光度法检测菌丝中丹皮酚含量。
二、紫外分光光度法检测菌丝中丹皮酚含量
精密称取丹皮酚对照品4mg，置50mL的量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度为80μg/mL的对照品溶液，然后稀释成不同浓度梯度的丹皮酚标准溶液，浓度分别为0.8μg/mL、1.6μg/mL、3.2μg/mL、4.8μg/mL、6.4μg/mL、8μg/mL，每种浓度进样3mL。用紫外分光光度计检测对照品相应浓度的吸光值，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制丹皮酚对照品的标准曲线。不同浓度丹皮酚的吸光度见下表1，标准曲线见图7，线性方程：y＝0.0803x+0.004，R2＝0.9992，说明在0.8～8μg/mL的浓度范围内，线性关系良好。根据线性方程将菌丝提取液的试验样品进行丹皮酚含量测定，测定结果见下表2(数据以平均值的形式表示)。其中，菌丝中丹皮酚含量计算如下：
丹皮酚含量(μg/g)＝测得的丹皮酚含量(μg/mL)×菌丝提取液体积(mL)/菌丝鲜重(g)。
表1 丹皮酚对照品浓度(x)和吸光度(y)
表2 菌丝鲜重和菌丝中丹皮酚含量值
由表2可知，生长7天的G1-1菌丝中含量平均值可以达到373μg/g。
丹皮酚是牡丹丹皮中主要的有效药用活性成分，凤丹皮作为丹皮中的道地药材，其丹皮酚含量最高。本发明从牡丹植株中分离出一株能够产丹皮酚的内生真菌G1-1，通过7天的液体发酵培养，菌丝中丹皮酚含量可以达到373μg/g。由此可以推测，产丹皮酚的内生真菌G1-1对生产丹皮酚起到一定的积累或者调控作用，使凤丹更容易抗病虫害，从而成就其道地性品质。通过大规模发酵培养镰刀菌属G1-1，即可在短时间内获得大量菌丝，从而获得丹皮酚。该方法可替代采挖植物药材获得丹皮酚，从而有效保护中药材和自然环境。
实施例2
产丹皮酚的牡丹内生真菌在生产丹皮酚中的应用，具体为：取牡丹内生真菌(CCTCC NO:M 2014662)发酵培养，抽滤得新鲜菌丝，加入甲醇研磨后室温下超声浸提，静置，取上清液，回收甲醇，即得。
实施例3
牡丹内生真菌在制备生防菌剂中的应用，具体为：取牡丹内生真菌(CCTCC NO:M2014662)发酵培养，抽滤得新鲜菌丝，即得。
Claims (3)
1.产丹皮酚的牡丹内生真菌，其特征在于：其为镰刀菌属(Fusarium sp.)G1-1，保藏编号：CCTCC NO:M 2014662。
2.如权利要求1所述的牡丹内生真菌在生产丹皮酚中的应用。
3.如权利要求1所述的牡丹内生真菌在制备生防菌剂中的应用。
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