CN107904177B - 一种铁皮石斛内生真菌菌株及其产生的胞外多糖以及该胞外多糖的提取方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种铁皮石斛内生真菌菌株及其产生的胞外多糖以及该胞外多糖的提取方法与应用。该铁皮石斛内生真菌菌株属于甘蔗镰孢霉菌。本发明铁皮石斛内生真菌菌株产生的胞外多糖对包括金黄色葡萄球菌以及枯草芽孢杆菌的致病菌具有很好的抑制活性作用。本发明通过如下流程提取所述胞外多糖：菌株活化‑种子液培养‑发酵培养‑发酵液真空抽滤‑抽滤液真空浓缩‑浓缩液醇沉‑沉淀离心‑沉淀水溶后透析‑透析液真空冷冻干燥‑获得所述胞外多糖。本发明的提取方法为大规模提取铁皮石斛内生真菌菌株产生的胞外多糖提供了新路径，同时为通过改进内生真菌与宿主植物的相互作用提高胞外多糖产量提供新的思路。

Description

一种铁皮石斛内生真菌菌株及其产生的胞外多糖以及该胞外 多糖的提取方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种铁皮石斛内生真菌菌株及其产生的胞外多糖以及该胞外多糖的提取方法与应用。

背景技术

二十一世纪以来内生真菌的研究重点在于对植物内生真菌的研究与开发利用。我国的药用植物资源丰富多样，利用内生菌资源库，发掘出代谢产物中低毒、高效、低廉的抗癌药物、抗菌药物、杀虫剂、抗氧化剂、植物激素、免疫抑制剂等具有非常重要的意义。

铁皮石斛为兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)多年生附生草本植物，分布于安徽、浙江、江西、广东、广西、云南、贵州等省区，既是名优花卉又是传统名贵中药材，秦汉时期的《神农本草经》一记载铁皮石斛“主伤中、除痹、下气、补五脏虚劳赢瘦、强阴、久服厚肠胃”；成书于一千多年前的道家医学经典《道藏》将铁皮石斛列为“中华九大仙草”之首；为千百年来历代帝皇梦寐以来的宝物，素有“千金草”之称，驰名中外，被国际药用植物界称为“药界大熊猫”。民间称其为“救命仙草”。一般生长在人迹罕至的深山老林和悬崖峭壁上的阴面崖缝间。铁皮石斛通过风及虫传播繁殖,从种子萌发进入到商品阶段需2-3 年才能采收。由于铁皮石斛特殊的生长环境和自身繁殖极为困难，以及人们的过度采挖，目前铁皮石斛的野生资源已日趋减少，至1987年，被列为国家重点保护野生植物，在《中国植物红皮书》中被列为濒危种，现己成为国家二级保护植物。

此外，铁皮石斛的主要活性成分为多糖，药理药效研究也显示其主要药用成分为多糖化合物，目前已在其中分离得到近30种多糖化合物，但是至今仍鲜有关铁皮石斛内生真菌及其相关活性的报道。

利用植物内生真菌这一尚未深入挖掘的宝库，同时植物内生真菌在筛选活性物质方面，表现出的巨大潜力，合成的次生代谢产物不但化学成分丰富。而且也具有多种多样的生物活性的特点，选取传统药用植物铁皮石斛(Dendrobium Officinale)作为宿主植物分离内生真菌，针对从铁皮石斛根部筛选的内生真菌进行形态和分子生物学鉴定，并对其产生的胞外多糖的抗菌活性进行研究。发掘铁皮石斛内生真菌中具有高活性的宝贵天然药物资源，以期为人类健康发展做出应有的贡献。

发明内容

本发明的目的在于提供一种铁皮石斛内生真菌菌株，该菌株属于甘蔗镰孢霉菌(Fusarium sacchari)，是采用内生真菌分离纯化技术从铁皮石斛 (DendrobiumoffiCinale Kimura et Migo)植物活体中分离、纯化得到。

本发明的目的还在于提供所述的一种铁皮石斛内生真菌菌株产生的胞外多糖，该胞外多糖具有良好的抑制病原菌的效果。

本发明的目的还在于提供一种提取所述的铁皮石斛内生真菌菌株产生的胞外多糖的方法，该方法包括如下流程：菌株活化-种子液培养-发酵培养-发酵液真空抽滤-抽滤液真空浓缩-浓缩液醇沉-沉淀离心-沉淀水溶后透析-透析液真空冷冻干燥-获得冻干粉，即为所述胞外多糖。

本发明的目的还在于提供所述的一种铁皮石斛内生真菌菌株产生的胞外多糖在抑制病原菌中的应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现。

一种铁皮石斛内生真菌菌株，属于甘蔗镰孢霉菌，命名为Fusarium sacchariSCUT951，于2017年6月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市武昌路珞珈山武汉大学，邮编430072)，保藏号为CCTCC NO.M2017299。

进一步地，所述铁皮石斛内生真菌菌株Fusarium sacchari SCUT951的核糖体内转录间隔区(ITS)和5.8S核糖体RNA编码基因(5.8SrDNA)如SEQ ID NO.1 所示。

一种由上述所述的铁皮石斛内生真菌菌株产生的胞外多糖的提取方法，包括如下步骤：

(1)将所述铁皮石斛内生真菌菌株活化培养后，进行种子液培养，再将得到的种子液进行发酵培养；

(2)将步骤(1)发酵培养后得到的发酵液真空抽滤，得到的抽滤液进行真空浓缩、醇沉、离心，将离心得到的沉淀脱水处理、干燥后，溶于去离子水中进行透析，对透析液进行真空冷冻干燥，得到所述铁皮石斛内生真菌菌株产生的胞外多糖。

进一步地，步骤(1)中，所述活化培养是采用试管斜面培养方法，于28±1℃活化培养48～72小时，培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(固体PDA)。

进一步地，步骤(1)中，所述种子液培养是采用马铃薯葡萄糖水培养基 (PDB)，于28±1℃、120rpm摇床培养48～72小时。

进一步地，步骤(1)中，所述发酵培养是按5v％～15v％的接种量将种子液接种于马铃薯葡萄糖水培养基中，于28±1℃、120rpm摇床发酵培养7～14天。

进一步地，步骤(2)中，所述真空浓缩是采用旋转蒸发仪于45℃将抽滤液浓缩为原液的1/10体积。

进一步地，步骤(2)中，所述醇沉是采用浓缩液：95vol％乙醇＝1：4的体积比混合均匀，4℃静置12～24小时。

进一步地，步骤(2)中，所述离心是在8000rpm离心15分钟。

进一步地，步骤(2)中，所述脱水处理是依次采用无水乙醇、丙酮和石油醚洗涤进行脱水处理。

进一步地，步骤(2)中，所述干燥是在温度50～55℃下进行干燥。

进一步地，步骤(2)中，经脱水处理、干燥后的沉淀在溶于去离子水后的浓度为0.05～0.2g/mL。

进一步地，步骤(2)中，所述透析是采用截留分子量3500Da透析袋蒸馏水透析24～72小时。

由上述任一项所述的提取方法提取得到的一种铁皮石斛内生真菌菌株产生的胞外多糖。

提取得到的胞外多糖具有良好的抑菌活性，对包括金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的病原菌具有明显的抑制作用，将所述的一种铁皮石斛内生真菌菌株产生的胞外多糖应用于抑制病原菌。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

(1)本发明铁皮石斛内生真菌菌株产生的胞外多糖对包括金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的病原菌具有明显的抑制活性作用，能很好地应用于抑制病原菌；

(2)本发明的提取方法工艺简单易行，条件温和、易于控制，为大规模提取铁皮石斛内生真菌菌株产生的胞外多糖提供了新路径，同时为通过改进内生真菌与宿主植物的相互作用提高胞外多糖产量提供新的思路。

附图说明

图1为实施例1中的铁皮石斛内生真菌菌株Fusarium sacchari SCUT951于 PDA培养基上培养5天在100倍显微镜下观察到的菌丝形态图；

图2a和图2b为实施例1中的铁皮石斛内生真菌菌株Fusarium sacchari SCUT951于PDA培养基上培养5天在不同倍率下扫描电镜下观察到的菌丝形态图；

图3a和图3b为实施例1中的铁皮石斛内生真菌菌株Fusarium sacchari SCUT951于PDA培养基上培养5天在不同倍率下扫描电镜下观察到的孢子形态图。

具体实施方式

以下结合具体实施例以及附图对本发明的技术方案作进一步阐述，但本发明不限于此。

以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件、实验室手册中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件。

本发明具体实施例的一种铁皮石斛内生真菌菌株，属于甘蔗镰孢霉菌，命名为Fusarium sacchari SCUT951，于2017年6月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市武昌路珞珈山武汉大学，邮编430072)，保藏号为CCTCC NO.M2017299；

铁皮石斛内生真菌菌株Fusarium sacchari SCUT951的核糖体内转录间隔区(ITS)和5.8S核糖体RNA编码基因如SEQ ID No.1所示。

本发明具体实施例的一种铁皮石斛内生真菌菌株产生的胞外多糖，通过如下方法流程提取得到：

菌株活化-种子液培养-发酵培养-将发酵液真空抽滤-将抽滤液真空浓缩-将浓缩液醇沉-沉淀离心-沉淀水溶后透析-透析液真空冷冻干燥-冻干粉，即为所述胞外多糖；

将得到的胞外多糖用蒸馏水溶解后，胞外多糖含量参照《2010版中国药典一部》中的苯酚—硫酸比色法测定。

本发明具体实施例的一种铁皮石斛内生真菌菌株产生的胞外多糖对包括金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的病原菌具有明显的抑制作用，抑菌活性评价包括如下方法流程：

病原菌菌株活化-种子液培养-平板涂布-含所述菌株胞外多糖滤纸片接种-培养-抗菌结果观察；

具体抑菌活性评价，包括如下步骤：

(1)病原菌菌株采用试管斜面培养方法，培养基为牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(固态LB培养基)，于37±1℃活化培养24小时；

(2)活化培养后的菌种转移至牛肉膏蛋白胨液体培养基(液态LB培养基) 中，于37±1℃摇床160rpm种子液培养24小时，得到种子液；

(3)将得到的种子液接种于涂布平板培养基(以牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或牛肉膏蛋白胨液体培养基为涂布平板培养基)中，凝结后于37±1℃培养24 小时；

(4)滤纸片采用6mm直径打孔器获取，滤纸片灭菌后浸泡在浓度0.05g/l 的胞外多糖溶液中，风干后，置于培养好测试菌株的培养皿中，平板37℃倒置培养24～48小时。

实施例1

铁皮石斛内生真菌菌株Fusarium sacchari SCUT951的固体培养特征为：

在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上于28±1℃培养4～7天，最初其生菌丝为无色，渐变为红色；菌落呈浅白绒毛状，边缘不整齐；菌丝体白色，发达，背面最初白色，渐变为红色。

铁皮石斛内生真菌菌株Fusarium sacchari SCUT951的液体培养特征为：

(1)培养基PDB，摇瓶培养7天，培养温度为28±1℃；

(2)发酵培养特征：培养第1-2天，未见明显生长现象；培养第三天，有深红色菌丝出现；

培养第4-5天，菌丝增多，培养5天于100倍显微镜下观察到的菌丝形态图如图1所示，由图1可见，菌丝缠绕在一起，形成树干状菌丝簇，而孢子散落在菌丝簇周围或附着在菌丝体上；培养5天于不同倍率下扫描电镜下观察到的菌丝形态图如图2a和图2b所示，在由图2a和图2b可见，菌丝体亦是缠绕在一起成簇状，孢子附着在菌丝体不同位置；而培养5天于不同倍率下扫描电镜下观察到的孢子形态图如图3a和图3b所示，由图3a和图3b可见，孢子形态呈现梭状或者棒球棒状；

培养第6天，培养瓶瓶壁黏附有深红色菌丝，培养液中有1-2mm深红色菌丝球；

培养地7天，菌丝球增大到2-4mm。

铁皮石斛内生真菌菌株Fusarium sacchari SCUT951的形态特征为：

(1)无性繁殖，菌丝体密集，成树枝状，侧生大量带梗孢子囊，孢子囊中最多可含22个孢子；

(2)有性世代，未发现。

实施例2

铁皮石斛内生真菌菌株产生的胞外多糖的提取，包括如下方法流程：

菌株活化-种子液培养-发酵培养-将发酵液真空抽滤-将抽滤液真空浓缩-将浓缩液醇沉-沉淀离心-沉淀水溶后透析-透析液真空冷冻干燥-冻干粉，即为所述胞外多糖；

具体提取过程包括如下步骤：

(1)取铁皮石斛内生真菌菌株Fusarium sacchari SCUT951菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的固体PDA培养基试管，于28±1℃活化培养72小时；

(2)取活化培养后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体PDB种子培养基中，于28±1℃、120rpm摇床培养72小时，得种子液；

(3)在无菌条件下，将种子液按10v％(体积百分比)接种量接入500ml 液体培养基中，于28±1℃、120rpm摇床培养7天；

(4)将发酵液真空抽滤，抽滤液于45℃下旋蒸浓缩至1/10体积，然后添加4倍体积于浓缩液的95vol％乙醇，剧烈震荡后，4℃静置24小时，得到醇沉液；

(5)将醇沉液8000rpm离心15分钟，弃去上清液，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、石油醚洗涤脱水，50℃烘干后，采用去离子水溶解，溶解后的浓度为0.2 g/mL；

(6)溶解于去离子水后的沉淀采用3500Da截留分子量透析袋蒸馏水透析 24小时，得到透析液；

(7)对得到的透析液进行冷冻干燥，得到冻干粉，即为铁皮石斛内生真菌菌株Fusarium sacchari SCUT951产生的胞外多糖。

获取的胞外多糖产量为1.75g/L。

实施例3

铁皮石斛内生真菌菌株产生的胞外多糖的抑菌效果测试

(1)取选用的4种常见病原菌：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量病原菌菌落，接入已灭菌的固体LB培养基试管，于37±1℃活化24小时；

(2)取活化培养后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体LB种子培养基中，于37±1℃、160rpm摇床培养24小时，得种子液；

(3)在无菌条件下，按2v％(体积百分比)接种量接入10ml液体LB平板培养基中，晃动平板，使种子液和LB液体培养基混合均匀，超净工作台中待其凝固后于37±1℃培养24小时；

(4)将实施例2获取的铁皮石斛内生真菌胞外多糖冻干粉采用去离子水配成0.05g/l的胞外多糖溶液；

(5)实验组吸取0.05g/l的胞外多糖溶液20ul于滤纸片(Φ＝0.6cm，已灭菌)上，而空白对照组则于无菌滤纸片上添加20ul无菌水，略微风干后，置于含有测试菌的培养皿中，一种测试菌的培养皿中放3个滤纸片；

(6)将制好后的测试菌培养皿置于37℃的培养箱中恒温培养24h后观察，测其抑菌圈的大小。

抑菌圈的观察结果如表1所示。

表1实施例2提取得到的菌株产生的胞外多糖的抗菌活性结果

注：“－”表示无抑制效果。

由表1结果知，铁皮石斛内生真菌菌株产生的胞外多糖对包括金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的两种病原的抑菌圈半径均大于空白对照组，说明铁皮石斛内生真菌菌株Fusarium sacchari SCUT951产生的胞外多糖具有明显的抑制金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的作用。而所产生的胞外多糖对于大肠杆菌及沙门氏菌仅有微弱的抑制作用。

应当理解，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而不用于限制本发明的范围。此外，应当理解，在阅读了本发明的内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些各种改动或修改的等价形式同样落于本申请所附权利要求所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南理工大学

<120> 一种铁皮石斛内生真菌菌株及其产生的胞外多糖以及该胞外多糖的提取方法与应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 572

<212> DNA

<213> 铁皮石斛内生真菌（Fusarium sacchari）

<400> 1

tttcctccgg cctttgatat gcttaagttc agcgggtatt cctacctgat ccgaggtcaa 60

cattcagaag ttggggttta acggcgtggc cgcgacgatt accagtaacg agggttttac 120

tactacgcta tggaagctcg acgtgaccgc caatcaattt ggggaacgcg aattaacgcg 180

agtcccaaca ccaagctgtg cttgagggtt gaaatgacgc tcgaacaggc atgcccgcca 240

gaatactggc gggcgcaatg tgcgttcaaa gattcgatga ttcactgaat tctgcaattc 300

acattactta tcgcattttg ctgcgttctt catcgatgcc agaaccaaga gatccgttgt 360

tgaaagtttt gatttattta tggttttact cagaagttac atatagaaac agagtttagg 420

ggtcctctgg cgggccgtcc cgttttaccg ggagcgggct gatccgccga ggcaacaagt 480

ggtatgttca caggggtttg ggagttgtaa actcggtaat gatcctccgc tggttcacca 540

acggagacct tgttacgatt tttttacttc ca 572

Claims (7)

1.一株铁皮石斛内生真菌菌株，其特征在于，所述菌株为甘蔗镰刀霉菌（Fusarium solani ） SCUT951，其于2017年6月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO.M2017299。

2.一种由权利要求1所述的铁皮石斛内生真菌菌株产生的胞外多糖的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将所述铁皮石斛内生真菌菌株活化培养后，进行种子液培养，再将得到的种子液进行发酵培养；所述活化培养是采用试管斜面培养方法，于28±1℃条件下培养48~72小时；

其中，所述活化培养基限定为马铃薯葡萄糖琼脂培养基；所述种子液培养是限定为马铃薯葡萄糖水培养基，培养条件为：28±1℃、120 rpm和48~72小时；所述发酵培养是指按体积比为5%～15%的接种量将种子液接种于马铃薯葡萄糖水培养基中，于28±1℃、120 rpm摇床发酵培养7~14天，其中发酵培养基限定为马铃薯葡萄糖水培养基；

（2）将步骤（1）发酵培养后得到的发酵液采用布氏漏斗真空抽滤，收集抽滤液进行真空浓缩、醇沉、离心，将离心得到的沉淀脱水、干燥后，溶于去离子水中进行透析，对透析液进行真空冷冻干燥，冻干粉即为所述铁皮石斛内生真菌胞外多糖。

3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤（2）中，所述真空浓缩是采用旋转蒸发仪于45℃将抽滤液浓缩为原液的1/10体积。

4.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤（2）中，所述醇沉的具体操作为采用浓缩液：95%乙醇=1:4的体积比震荡混合均匀，于4℃静置12~24小时；所述95%是指体积百分比。

5.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤（2）中，所述离心指在8000 rpm离心15分钟。

6.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤（2）中，所述脱水处理是依次采用无水乙醇、丙酮和石油醚洗涤进行脱水处理；所述干燥是在温度50~55℃下进行干燥。

7.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤（2）中，将离心得到的沉淀脱水、干燥后，以0.05~0.2g/mL的浓度溶于去离子中进行透析；所述透析是采用截留分子量3500Da透析袋蒸馏水透析24~72小时。

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