CN103918724B - Lasiodiplodia pseudotheobromae或其发酵产物在防治小麦白粉病菌中的应用 - Google Patents
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Abstract
Lasiodiplodia pseudotheobromae或其发酵产物在防治小麦白粉病菌中的应用，本发明涉及微生物技术领域，本发明所述的内生真菌是从中科院武汉植物园采集的药用植物枸骨中分离获得，经微生物分类学鉴定，命名Lasiodiplodia pseudotheobromae(菌株代号LPS-1）,该菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心（地址：中国 武汉 武汉大学），保藏号：CCTCC NO: M2013605。本发明最显著的特征是菌株液体发酵液及其乙醚萃取物都能产生对小麦白粉菌（Blumeria graminis f.sp.tritic）有抑制作用的活性产物。该发明为微生物源农药的进一步研制和开发提供优良的出发菌株，是农业上重要的微生物资源。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种植物内生真菌在生防领域中的应用，特别涉及植物内生真菌Lasiodiplodia pseudotheobromae或其发酵产物在防治小麦白粉病菌中的应用。
背景技术
植物内生真菌是指生活在植物体内或其生活史的一定阶段处于健康植物体内，而不引起该植物任何外在病症的一类微生物。植物内生真菌是一种新的微生物资源，能产生多种结构类型的代谢产物，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗虫、调节植物生长等多种生物活性（Tan RX & Zou WX, 2001）。由于植物内生真菌能产生结构新颖、功能独特的代谢产物而成为新化合物、新药物筛选的潜在资源，从健康植物中分离内生真菌，筛选活性高、结构新颖的抗菌化合物具有广阔的前景（Strobel G, et al.2004）。
Lasiodiplodia pseudotheobromae作为热带和亚热带树木的重要致病真菌已被广泛研究。Alves等2008年首次报道Lasiodiplodia属的1个新种Lasiodiplodia pseudotheobromae，Alves等用ITS和EF1-α序列分析之前被鉴定为L.theobromae的菌株时，发现了另一个新种L.pseudotheobromae（Alves A，et al.2008）。Zhao等2010年报道在中国南部热带和亚热带地区的林木上分离出L.pseudotheobromae，研究表明该菌可寄生包括果树在内的多种植物（Zhao JP, et al.2010）。然而，目前尚没有文献报道Lasiodiplodia pseudotheobromae可作为一种生防菌，更没有文献报道该菌种可以防治小麦白粉病菌（Blumeria graminis f.sp.triti）。
发明内容
本发明人从药用枸骨中分离的一株内生真菌L.pseudotheobromae，并意外地发现其具有拮抗小麦白粉病菌的生物活性。因此，本发明的目的在于提供该内生真菌Lasiodiplodia pseudotheobromae及其发酵产物在防治小麦白粉病菌中的应用。
为了实现本发明的目的，发明人从药用植物枸骨中分离到一株内生真菌LPS-1，并对其进行了分类鉴定，确定为Lasiodiplodia pseudotheobromae，并将菌株代号命名为葡萄座腔菌（Lasiodiplodia pseudotheobromae）LPS-1，于2013年11月27日保藏在中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉武汉大学），保藏号：CCTCC NO: M 2013605。
另外，本发明人对所分离的内生真菌LPS-1做了进一步的形态学、同源性、培养方法和生物活性等方面的特征进行了研究，具体结果如下：
1、内生真菌LPS-1的形态特征
（1）无性世代：LPS-1在马铃薯-葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）上25℃培养3d后在光学显微镜下观察照片，在PDA培养基上菌丝初期呈白色疏松状，后期菌丝逐渐变成黑色。其菌落形态特征见图1。
（2）有性世代：在2%水琼脂平板表面摆放灭菌的松针，在平板中接入内生真菌LPS-1，放置到25℃培养箱，紫外灯和普通灯光下12小时光照与黑暗交替培养2-5周。在Olympus IX81型万能显微镜下观察并测量50个单孢大小，孢子的大小范围为平均值±误差，侧丝测量25个数据。分生孢子器中有透明的侧丝，圆柱形，初期无隔，成熟后有1～5个隔。偶见分支，侧丝尖端钝圆，在侧丝的基部和中部偶尔有膨大现象，长45.4±10.4μm，宽3.5±0.5μm。分生孢子初期无色，无隔，椭圆形或圆形，端部钝圆，壁厚。随着孢子成熟，孢子变成茶褐色，中央形成一层隔膜，且具有纵条纹，孢子大小为22.1～28.5×13.1～16.5μm（平均值±标准偏差=25.3±1.5×14.5±0.7μm，长宽比=1.7±0.1）。其有性形态特征见图2。
2、内生真菌LPS-1的同源性特征
运用PCR技术，扩增采用ITS通用引物ITS1和ITS4，LPS-1菌株ITS序列与Genebank中其它真菌的ITS序列进行比对，找出相似性最高，亲缘关系最近的真菌，LPS-1菌株的ITS序列与L. pseudotheobromae的ITS序列相似度为100%。综合形态学特征，将LPS-1菌株鉴定为L. pseudotheobromae。其ITS同源性的系统发育树见图4。
3、内生真菌LPS-1的发酵培养特征
培养基：麦精19.95g/L，蔗糖50 g/L，硝酸钠7.5 g/L，七水硫酸镁3.561 g/L，去离子水1L。
培养温度：25℃
发酵时间：7天
发酵条件：静态培养。
4、内生真菌发酵液萃取物对小麦白粉菌活性测定
内生真菌LPS-1液体发酵培养7天，得总发酵液，经离心或过滤得菌丝和菌液部分，用乙醚萃取，浓缩成浸膏，得到乙醚提取物。准确称取LPS-1菌株发酵液的乙醚提取物0.01g，并加入10 mL无菌水，超声波震荡充分溶解，最终配置成浓度为1000 mg/L的母液。采用离体叶段法，将母液配置成10 mg/L的工作液，用Poter喷雾塔均匀喷施到小麦离体叶段上，自然晾干，24小时后接种新鲜的小麦白粉病菌，另设阴性对照组（乙醚处理）和空白对照组（纯水处理），置于17℃培养室进行培养。7天后调查发病情况，结果见图3。
本发明的优点：本发明首次从药用植物枸骨中分离到一株内生真菌LPS-1，并发现其对小麦白粉菌具有较高的拮抗活性，从而可以将该内生真菌LPS-1作为生防菌应用于小麦白粉菌引起的植物疾病的防治中。另外，由于内生真菌LPS-1发酵液的乙醚萃取物具有更高的生防活性，因此可以继续利用该植物内生真菌资源获得天然生物活性物质，为其开发和应用以及探讨内生真菌的生理生态功能提供依据。
附图说明
图1为内生真菌LPS-1在PDA培养基生长3天（左图）和7天（右图）的菌落形态。
图2为内生真菌LPS-1有性世态的侧丝、产孢细胞和分生孢子的形态图；d.侧丝（×400）； e.产孢细胞（×200）；f.未成熟的分生孢子（×400）；g.成熟的孢子（×400）。
图3各组对小麦白粉病菌的防治效果图；从左至右分别是阴性对照组、空白对照组、LPS-1萃取物处理组。
图4为内生真菌LPS-1同源性的系统发育树图。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
实施例1：内生真菌LPS-1的分离
将采集药用植物枸骨的茎块在流水下冲洗，除去表面附着的泥沙。内生真菌的分离采用常规组织分离法，样品先用无菌水清洗2次，将样品切成1～2 cm长小段放入75%酒精中浸泡1～2min，用无菌水冲洗2～3次。再用1.5%有效氯含量的次氯酸钠消毒7～10 min，用无菌水冲洗3次，将表面消毒的组织在灭菌的培养皿中用灭菌的刀片切成0.2 cm×0.2cm的片段，用灭菌滤纸将消毒组织块表面的水分充分吸干。最后将组织块移植到PDA培养基 (含50 U/mL硫酸链霉素和氨苄青霉素) 平板上，置25℃恒温培养箱中。培养至第10天，取切口处长出的新鲜菌丝，转接到新的PDA平板培养，待菌落出现后，根据菌落颜色、形态和生长速度的差异，分别挑取各平板上的菌落边缘菌丝于新的平板上进行培养。根据菌落生长情况采用菌丝尖端纯化法逐步纯化，将纯化后的菌株在PDA斜面上保存，其中一株内生真菌的编号为LPS-1，于2013年11月27日保藏在中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉珞珈山武汉大学），保藏号：CCTCC NO: M 2013605。
实施例2：内生真菌LPS-1发酵液对小麦白粉菌的活性测定
采用摇瓶静态发酵法：在超净工作台中将在PDA上培养的新鲜内生真菌LPS-1用直径6 mm的灭菌打孔器打成菌饼，接种至100 mL三角瓶中装入30毫升麦精培养基中，培养温度25℃，培养7 d天。以不接种的麦精培养基做空白对照。麦精培养基配方：麦精19.95g/L，蔗糖50 g/L，硝酸钠7.5 g/L，七水硫酸镁3.561 g/L，去离子水1L。
发酵结束后过滤发酵液，11000 rpm离心10 min。取上清液备用。采用离体叶段法，将培养至1叶1心的小麦，第1叶剪成30 mm长叶段，置于含50 ug/ml苯骈咪唑的0.5%的水琼脂平板上。按照2.5×10-4吐温20与发酵液充分混匀，在喷雾塔中施用，喷雾量为350ml/m2，同时喷施含2.5×10-4吐温20 的麦精培养基溶液为阴性对照，自然晾干，24h后接种小麦白粉病菌分生孢子（接种量为10-20个分生孢子/10倍视野）。然后放在17 ± 1℃的空调房中培养，先避光12 h，然后在24小时40W日光灯照射下（培养室）培养。待空白对照充分发病后（7天），调查每个处理的每片叶的发病严重度（试验结果见表1）。
防治效果=（CK–T）/CK×100%
(CK为阴性对照平均严重度；T为处理平均严重度)
表1 LPS-1发酵液对小麦白粉菌生防效果
。
实施例3：内生真菌LPS-1的形态特征观察
内生真菌LPS-1在PDA培养基上25℃培养，菌落圆形，边缘整齐，初为白色，第三天开始以接种点为中心开始向外逐渐变为暗灰色，成熟菌落黑色。气生菌丝发达，菌落绒毛状，逐渐加厚成绒毡状。菌丝种类单一，黑色，粗壮，长，多分枝，无隔，PDA培养基上不产孢。
诱导产孢，在2%水琼脂平板表面摆放灭菌的松针，在平板中接入内生真菌LPS-1，放置到25℃培养箱，紫外灯和普通灯光下12小时光照与黑暗交替培养2-5周，在松针上开始形成黑色载孢体（即分生孢子器）。分生孢子器中有透明的侧丝，圆柱形，初期无隔，成熟后有1～5个隔。偶见分支，侧丝尖端钝圆，在侧丝的基部和中部偶尔有膨大现象，长45.4±10.4μm，宽3.5±0.5μm。分生孢子初期无色，无隔，椭圆形或圆形，端部钝圆，壁厚。随着孢子成熟，孢子变成茶褐色，中央形成一层隔膜，且具有纵条纹，孢子大小为 22.1～28.5×13.1～16.5μm（平均值±标准偏差=25.3±1.5×14.5±0.7μm，长宽比=1.7±0.1）。
实施例4：内生真菌LPS-1的ITS序列分析与分子鉴定
将内生真菌LPS-1移植到PDA平板上，在25℃下培养3-5天。用盖玻片刮取平板表面的菌丝，用灭菌的滤纸充分吸收菌丝的水分。采用CTAB方法提取总DNA。运用PCR技术，DNA扩增采用ITS通用引物ITS1和ITS4。DNA测序所用的引物分别为ITS1和ITS4，采用ABI PRISM 3730测序仪，分别进行正向（5′→3′）和（3′→5′）双向测序。
根据Blast比对结果，从中抽取与所分离的内生真菌LPS-1菌株序列相似性高的菌株的序列，采用CLUSTAL X 1.8进行序列比对后，再用MEGA软件计算遗传距离，然后利用距离依靠法中的邻位相连法（neighbor-joining, NJ）构建进化树。计算Bootstrap值来评价系统发育树的可靠性。LPS-1菌株的系统发育树图见图4。
实施例5：内生真菌LPS-1的发酵工艺和萃取物的制备工艺
菌种→活化→一级种子（PDA培养基）→培养（25℃，3天）→接种（按10%接种量）→发酵（麦精培养基，静态培养，25℃，7天）→发酵液。
发酵终止后过滤发酵产物，滤液于11000 r/min离心10 min，取上清液，用乙醚萃取，萃取5次，每次10 min。将有机相收集，旋蒸浓缩成浸膏备用。
实施例6：内生真菌LPS-1发酵液萃取物对小麦白粉病菌活性测定
（1） 用实施例5所述的方法，获得1000mg/L的发酵液乙醚萃取物母液。
（2） 抑菌活性的测定：取上述母液稀释成浓度为10 mg/L的溶液，
参照实施例2中所述方法进行内生真菌LPS-1发酵液萃取物对小麦白粉病菌活性测定（试验结果见表2）
表2 菌株LPS-1发酵萃取物对小麦白粉病菌活性测定结果
。
Claims (1)
1.Lasiodiplodia pseudotheobromae或其发酵产物在防治小麦白粉菌中的应用，所述的Lasiodiplodia pseudotheobromae是保藏号为CCTCC NO: M 2013605的内生真菌。
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