CN101942393B - 一株产石杉碱甲的蛇足石杉内生真菌竹黄菌株 - Google Patents

Abstract

本发明公布了一株产石杉碱甲(huperzineA)的蛇足石杉(Huperziaserrata)内生真菌，属生物工程技术领域。该菌是从蕨类植物蛇足石杉(H.serrata)植物活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得，经微生物分类学鉴定命名为竹黄菌(Shiraia sp.)slf-14，已于2009年12月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 209294。该菌株通过液体发酵，可产生石杉碱甲。本发明首次发现竹黄菌发酵液中含有石杉碱甲，为寻找治疗老年痴呆症活性成分石杉碱甲资源提供了新途径。

Description

一株产石杉碱甲的蛇足石杉内生真菌竹黄菌株

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及一种其发酵产物含石杉碱甲及其类似物的真菌，该真菌对于发酵法生产石杉碱甲及其类似物有着重要意义。

背景技术

石杉碱甲(huperzine A)又名福定碱，是我国首次从蕨类植物石杉科石杉属蛇足石杉(千层塔)中分离出的一种生物碱，它对中枢乙酰胆碱酯酶(acetylcholine esterase，ACHE)具有高效、可逆、高选择性的抑制作用，可用于阿尔茨海默症的治疗(AD)，同时对重症肌无力、记忆障碍、血管性痴呆具有显著的疗效。石杉碱甲(huperzine A)为我国首创的一类新药(商品名哈伯因)，其被公认为治疗指数高、作用时间长、无毒副作用的一类新药。石杉碱甲衍生物ZT-1与石杉碱甲相比，具有更高抑制乙酰胆碱酯酶活性且毒副作用更小的特点，现ZT-1正作为一种新的治疗AD药物开发，在中国和欧洲均已完成了II期临床研究。

迄今，石杉碱甲制剂所需原料均从蛇足石杉(Huperzia serrata)中提取而得。蛇足石杉是

一种珍稀野生蕨类植物，其植株矮小(10～30cm)，生长缓慢(自然条件下长成高12cm的成苗约需10～15年时间)，散生于山林阴湿处，目前尚未实现人工栽培，野生资源十分有限，且其石杉碱甲含量极低(约0.02％左右)。资源调查表明，我国是蛇足石杉的主要产区，但每年蛇足石杉的可采收量不足200吨。

随着世界人口平均寿命的提高，世界各国均逐步进入老龄化社会，与年龄有关的退化性疾病也随之增加。据估计，目前全世界AD患者已有超过2000万，且数量每20年将翻一番，成为继冠心病、癌症之后，威胁人类生命健康的最严重疾病之一。我国AD患者已超过500万，占全世界所有患病人数的1/4。而且，随着我国人口老龄化进程的加快，这个数字将更为庞大。由于国际国内对石杉碱甲药物需求不断增加，这势必产生石杉碱甲原料供应的巨大缺口。因此要从根本上解决蛇足石杉资源和石杉碱甲药物的短缺问题，有必要寻求比较科学合理的开发利用方式和途径。

微生物发酵产生目标产物的研究已是一门成熟的应用型学科，植物内生菌作为一种新的微生物资源引起了广泛的关注，从内生菌中寻找和发现新的活性化合物是植物内生菌研究的一个热点。植物内生真菌次生代谢产物的多样性为人类突破植物资源周期长、产量低、不可再生等限制，利用植物内生真菌工业发酵生产重要的药物开辟了新途径，具有极大的应用价值和开发潜力。目前有从石杉科中分离所得内生菌产石杉碱甲及其类似物的相关报道。专利CN 101265451A介绍从石杉科植物中分离的一种产石杉碱甲的木霉菌D01(吴东才，专利申请号200710003519.5)，龚玉霞(《蛇足石杉内生真菌的分离及生物活性初步研究》，安徽师范大学，硕士论文，2007)和杨晓军(《内生真菌YD-01次生代谢产物的研究I》2006，37(5)：479-480，中国药科大学学报)均报导了产石杉碱甲及其类似物的菌株。这些研究表明利用微生物发酵生产石杉碱甲成为一种可能，采用内生菌发酵生产石杉碱甲将是解决石杉碱甲原料来源的经济有效的新途径。但目前报道的菌种石杉碱甲产量低，如黎万奎等对蛇足石杉支顶孢属内生真菌2F09P03B产石杉碱甲发酵条件进行了优化，结果其最高产量仅为8.32μg/L(《蛇足石杉内生真菌2F09P03B产石杉碱甲发酵条件的研究》，中国医药生物技术，2007，2(4)：254-259)，无法应用于工业化的生产。

发明内容

本发明的目的是提供一株产石杉碱甲的竹黄菌株，可通过液态发酵生产石杉碱甲。

本发明的产石杉碱甲的蛇足石杉内生真菌竹黄菌株，其分类命名为竹黄菌(Shiraia sp.)slf14，从蕨类植物蛇足石杉(H.serrata)植物活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2009年12月6日，保藏号为CCTCCNO：M 209294。

本发明所述的竹黄菌株(Shiraia sp.)slf14固体培养特征为：

固体培养为PDA培养基，28±1℃培养4-5天，菌落直径29-31mm，7天菌落直径为62-65mm，12-14天长满整个培养皿。菌丝初期为白色，丝状交织，不易挑取；菌落干燥，不透明，与培养基结合紧密，边缘不平整，呈放射形丝状，表面有白色绒毛，成熟后为绒毡状，微红色，菌体产生的色素部分分泌到培养基中，使培养基背面呈棕红色。菌落以接种块为中心在培养基上呈红白相间同心圆状分布。

本发明所述的蛇足石杉内生真菌竹黄菌株的显微形态特征为：

菌丝分枝、平滑、有隔、间距不等、呈管状；在菌丝中部产分生孢子器，分生孢子器呈梨形，当分生孢子器成熟后，从顶端释放出大量球形或椭球形的分生孢子。

本发明所述的蛇足石杉内生真菌的液体培养条件为：

①培养基为PDA培养基，摇瓶培养5-7天，培养温度28±1℃；

②发酵培养特征：培养第1天，未见明显生长现象；培养第2天，有菌丝球出现；培养第3天，发酵液变红，菌球数量变多；培养第4-5天，发酵液颜色变深，菌球数量变多，直径变大；培养第7天，菌丝球集结。

③竹黄菌(Shiraia sp.)slf14液体发酵10-12天后，对发酵液进行化学提取、分离可得到乙酰胆碱酯酶抑制剂一石杉碱甲及其类似物。

本发明所述的蛇足石杉内生真菌竹黄菌株基因登录号为GQ355934，ITS碱基序列为：

TTAAGTTCAGCGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAAACGTGGTAAAAAGCTTATCTGGACGTCAGTATTCCGGCTTGGACTCGCAAATTGTGCTGCGCTCCAAGGCCAAAATGCCGGCTGCCAATATCTTTAAGGCGAGTCCAGTCGCAATGGATAGGACAAACACCCAACACCAAGCATAGCTTGAGGGTACAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCCATGGAATACCAAGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACACTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTGTAAATATTAATTTGTTCAGACGCTGATTGCAATTACAATGAGTTTAAGAGATCCTATCGGCTGGAGAACCAGCCGAGGAAACATGTAGTACGCAAAAAACATGGGTGCAGACGGGGGCTATATTGCTATAACCCCGTACTACTAGGTAATGATCCTT。

本发明所述的蛇足石杉内生真菌竹黄菌株，经发酵可得石杉碱甲及其类似物，其工艺包括菌种活化、发酵培养、发酵产物细胞破碎、总生物碱的提取和TLC和HPLC分析5个步骤。

其中，菌种活化采用平板培养，培养基为马铃薯葡萄糖固体培养基(固体PDA)；发酵原料为液体马铃薯培养基，发酵方式为液体摇瓶培养；培养时间：10-12天；培养温度：28±1℃。

发酵物提取：发酵完毕，离心收集发酵产物，破碎细胞，用索氏抽提器提取总生物碱，采用TLC和HPLC分析。

本发明从野生的蛇足石杉中获得一株生长快、产石杉碱甲稳定的竹黄菌(Shiraia sp.)slf14，同时该内生菌可产竹红菌素。本发明所述的竹黄菌(Shiraia sp.)slfl4，通过菌体液体发酵能够产生石杉碱甲及其类似物，具有可逆性抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)的作用，在国际上已被列为第二代乙酰胆碱酯酶的抑制剂之一，是寻找治疗老年痴呆活性成分石杉碱甲新资源的重要微生物，有较大的应用价值。

附图说明：

图1为本发明所述竹黄菌(Shiraia sp.)slf14的菌落形态；

图2为本发明所述竹黄菌(Shiraia sp.)slf14在400倍显微镜下观察到的菌丝形态(a)和孢子形态(b)；

图3为本发明所述竹黄菌(Shiraia sp.)slf14薄层图谱；

图4为本发明所述的石杉碱甲标准品HPLC色谱图(a)与竹黄菌(Shiraia sp.)slf14生物碱成分(b)的对照HPLC色谱图。

具体实施方式：

以下结合实施例对本发明进行细说明。

实施例1：本发明竹黄菌株的制备或筛选

(1)采集完整的蛇足石杉菌株，装于封口袋中，放置到4℃保温箱中保存，回到实验室立即处理。

(2)将完整植株用自来水冲洗15-20min，无菌水冲洗3次。根、茎剪成1-2cm小段，叶保持原状。

(3)根、茎部和叶子都采用75％乙醇浸5min表面初步灭菌，再用0.1％升汞浸泡8min，无菌水漂洗组织表面灭菌的方式。

(4)将上述处理好的茎用灭菌过的剪刀将两头剪掉，再将去掉两头的茎纵剖，一分为二，再剪成0.1×0.5cm的小块。将叶子的边缘用灭过菌的剪刀剪去，把剪去了边缘的叶片也剪成约0.2×0.5cm的小块。将它们分别置于外加60μg/L链霉素和0.5g/L重铬酸钾的PDA培养基上，置28℃培养箱中培养。

为了检查表面灭菌效果，设对照进行灭菌效果的检验。对照I：将进行了灭菌操作的根、茎和叶子不剪去两头和边缘，然后将它们的表面与固体平板接触后取出，将培养皿放入培养箱培养；对照II：最后一次洗涤用无菌水接入培养基中。每个处理重复3次。

(5)发现接种组织周围长出菌落，用接种针挑取菌丝前端，接种到另一个培养基上。每天观察一次，如果长出菌落，立即挑出。

(6)挑出的真菌形成菌落后，用接种针挑取菌丝前端，再接种到另一个培养基上，如此反复纯化4次，将菌种接到斜面培养基上4℃保存。

实施例2：本发明筛选出高抑制乙酰胆碱酯酶活性的竹黄菌株

(1)取从蛇足石杉植株中分离到的内生真菌活化培养，无菌条件下，转接入已灭菌的液体PD培养基中，28℃下120rpm摇床培养12天；

(2)发酵完毕，抽滤得到菌丝体，收集菌丝体进行细胞破碎，然后放在索氏抽提仪中用无水乙醇抽提，抽提液用旋转蒸发仪浓缩至原1/5，加入等体积氯仿萃取，合并氯仿相，于40℃用旋转蒸发仪蒸干，以少量甲醇溶解，作为待测样品液。

(3)初筛以ATCh为底物、DTNB为显色剂，通过ATCh被AChE水解产生胆碱与DTNB反应，释放出黄色产物5-巯基-2-硝基苯甲酸来检测酶活性。

具体操作步骤如下：在Eppendof管中加入供试AChE粗提物、10mmol/LATCh，再加入0.05mol/LPBS补平反应体系至390μL，混匀，恒温37℃孵育30min，加6％高氯酸10μL，振荡混匀，室温下终止反应20min，10000转离心1min，取上清液，移加96孔板，每孔100μL，共计3孔，再加0.05mmol/L DTNB 100μL反应显色(整个反应体系为200μL)，酶标仪410nm处检测OD值。

实验结果表明竹黄菌slf14对乙酰胆碱酯酶的抑制率达到96.47％，显著高于筛选到的其他蛇足石杉内生真菌，初步断定可能含有石杉碱甲及其类似物。

实施例3：本发明竹黄菌株的显微形态和分子生物学鉴定

取所得到抑制率最高的菌株进行显微形态和分子生物学方法鉴定，具体过程如下：

(1)采用固体平板培养法：培养为马铃薯葡萄糖PDA培养基，28±1℃培养4天，菌落直径31mm，7天菌落直径为65mm，12天长满整个培养皿。菌丝初期为白色，丝状交织，不易挑取；菌落干燥，不透明，与培养基结合紧密，边缘不平整，呈放射形丝状，表面有白色绒毛，成熟后为绒毡状，微红色，菌体产生的色素部分分泌到培养基中，使培养基背面呈棕红色。菌落以接种块为中心在培养基上呈红白相间同心圆状分布。显微图片见说明书附图1。

(2)分子生物学采用ITS-DNA鉴定，取培养6天的发酵液，离心收集菌体，把所得的菌体通过CTAB法提取总DNA，利用ITS通用引物通过扩增保守序列，将所得的序列胶回收、纯化、克隆，再送到上海生工测序，所得ITS碱基序列如下：

TTAAGTTCAGCGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAAACGTGGTAAAAGCTTATCTGGACGTCAGTATTCCGGCTTGGACTCGCAAATTGTGCTGCGCTCCAAGGCCAAAATGCCGGCTGCCAATATCTTTAAGGCGAGTCCAGTCGCAATGGATAGGACAAACACCCAACACCAAGCATAGCTTGAGGGTACAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCCATGGAATACCAAGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACACTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTGTAAATATTAATTTGTTCAGACGCTGATTGCAATTACAATGAGTTTAAGAGATCCTATCGGCTGGAGAACCAGCCGAGGAAACATGTAGTACGCAAAAAACATGGGTGCAGACGGGGGCTATATTGCTATAACCCCGTACTACTAGGTAATGATCCTT

实施例4：本发明竹黄菌株发酵可得石杉碱甲及其类似物

(1)取本发明的竹黄菌(Shiraia sp.)slf14，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的固体PDA培养基平板，于28±1℃活化培养72小时；

(2)取活化培养后的菌种，无菌条件下，转接入已灭菌的液体PDA培养基中，28±1℃下120rpm摇床培养12天；

(3)发酵完毕，抽滤得到菌丝体，收集菌丝体进行细胞破碎，然后放在索氏抽提仪中用无水乙醇抽提，抽提液用旋转蒸发仪浓缩至原1/5，加入等体积氯仿萃取，合并氯仿相，于40℃用旋转蒸发仪蒸干，以少量甲醇溶解，作为待测样品液。

(4)运用TLC法进行初步的测定：将待测样品与石杉碱甲标准样品分别点样于硅胶板，以氯仿-丙酮-异丙醇-浓氨水(4∶4∶2.0∶0.12)为展开剂，展开后用0.3％高锰酸钾溶液显色，比较待测样品与石杉碱甲标准样品的R_f值，初步判断待测样品中是否含有石杉碱甲。

(5)运用HPLC法进行精确测定。色谱条件：Agilent 1100色谱系统；ODS-C_i8反相柱(5μm，4.6mm×150mm)；流动相为甲醇∶水＝85∶15；流速1ml/min，进样量20μl，柱温25℃，检测波长308nm。

(6)经TLC和HPLC分析，表明本发明的蛇足石杉内生真菌菌种液体发酵能够产生石杉碱甲及其类似物。

Claims (2)

1.一株产石杉碱甲的蛇足石杉内生真菌竹黄菌株，其分类命名为竹黄菌(Shiraiasp.)slf14，已于2009年12月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M209294。

2.利用权利要求1所述的竹黄菌株生产石杉碱甲的方法，其特征在于：

①取权利要求1所述的竹黄菌株，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的固体PDA培养基平板，于28±1℃活化培养72-84小时；

②取活化培养后的菌种，无菌条件下，转接入已灭菌的液体PDA培养基中，28±1℃下120rpm摇床培养10-12天；

③发酵完毕，抽滤得到菌丝体，收集菌丝体进行细胞破碎，然后放在索氏抽提仪中用无水乙醇抽提，抽提液用旋转蒸发仪浓缩至原1/4-1/5左右，加入等体积氯仿萃取，合并氯仿相，于38-42℃用旋转蒸发仪蒸干，以少量甲醇溶解，作为待测样品液。

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