CN103642864B

CN103642864B - 一种内生竹黄真菌发酵制备苝醌类化合物的方法

Info

Publication number: CN103642864B
Application number: CN201310727483.0A
Authority: CN
Inventors: 张志斌; 李平; 朱笃; 颜日明; 汪涯; 杨慧林
Original assignee: Jiangxi Normal University
Current assignee: Jiangxi Normal University
Priority date: 2013-12-26
Filing date: 2013-12-26
Publication date: 2016-02-10
Anticipated expiration: 2033-12-26
Also published as: CN103642864A

Abstract

一种内生竹黄真菌发酵制备苝醌类化合物的方法，本发明涉及利用竹黄菌株Shiraia？sp.slf-14，保藏号为CCTCC？NO：M？209294，已在ZL200910186852.3公开，通过液体发酵制备获得竹红菌甲素(Hypocrellins？A)、竹红菌乙素(Hypocrellins？B)、痂囊腔菌素B(Elsinochromes？B)及痂囊腔菌素C？(Elsinochromes？C)四种苝醌类化合物。本发明为这4种苝醌类化合物的生产制备提供了一种新的资源和方法。

Description

一种内生竹黄真菌发酵制备苝醌类化合物的方法

技术领域

本发明涉及一种制备苝醌类化合物的方法，尤其涉及一种内生竹黄真菌发酵制备苝醌类化合物的方法。

背景技术

苝醌（Perylenequinones，PQ）类化合物主要是从子囊菌纲和半知菌类真菌中分离到的一类具有光敏活性的色素。根据分子结构的差异苝醌类化合物分为弗莱菌素型、交链孢毒素型及蒽醌类物质3大类化合物，其中弗莱菌素型主要包括竹红菌素、痂囊腔菌素、弗莱菌素和尾孢素等化合物。1980年，中国学者万象义等从竹红菌子实体中分离到一种新的苝醌类化合物，因源于竹红菌而命名为竹红菌甲素(HypocrellinA，HA)。1991年，日本学者Kishi等从竹黄菌子座中分离得到另外两种竹红菌素，分别称为竹红菌乙素(HB)、竹红菌丙素(HC)。目前，已从竹黄中分离到HA、HB和HC，其中对HA的研究最多，它是一种重要的天然光敏色素，在医药和食品领域有着巨大的潜在应用价值。痂囊菌素可以由许多子囊真菌产生，包括痂囊腔菌素A、痂囊腔菌素B、痂囊腔菌素C和痂囊腔菌素D四种。痂囊菌素最先由Weiss等在1957年从Elsinoe培养物中分离得到，并对它们的物理化学性质以及光敏抑菌性质进行了初步研究。此后一些研究者先后确定了痂囊腔菌素A、B、C和D的结构。随着人们对各种苝醌类化合物认识的增加，在对痂囊腔菌素光敏性质以及光敏行为进行了深入的研究同时，还发现痂囊腔菌素有很好的抗病虫害的作用，而且不会对人体产生间接的毒副作用。其中痂囊腔菌素C可作为漂白剂，其漂白效果甚至要好于同为苝醌类化合物的竹红菌甲素。

发明专利200710132510.4介绍了一株产苝醌化合物的竹黄菌株Shiraiasp.SUPER-H168，其主要代谢产物为竹红菌甲素和竹红菌乙素。专利201110100965.4从蜈蚣衣属植物地衣的内生真菌Phaeosphaeriasp.提取一类苝醌类化合物，其在抗真菌和抗肿瘤方面有潜在的应用价值。专利201210127338.4发明了一种高产竹红菌素的竹黄菌株Shiraiabambusicolaww67，该菌株液态发酵产量可达0.35%。刘为忠（《苝醌类化合物产生菌固态发酵工艺研究》，云南大学学报，2000,225（5）389-391）和沈云修《一株产苝醌类化合物的真菌化学成分研究》，中草药，2003,34（2）：111-113）等报导了产苝醌类化合物的真菌。

虽然已有报道可以通过液体发酵或者固体发酵来获得苝醌类化合物，但产量不高且都是从竹林中筛选得到，本发明从江西庐山蛇足石杉内生真菌中分离到一株高产苝醌类化合物的菌株Shiraiasp.slf-14，其液态发酵产量较高，该发明为传统苝醌类化合物的发酵制备提供新的菌种来源和方法。

发明内容

本发明的目的是，利用竹黄菌株Shiraiasp.slf-14，保藏号为CCTCCNO：M209294，已在ZL200910186852.3公开，通过液体发酵制备获得竹红菌甲素、竹红菌乙素、痂囊腔菌素B及痂囊腔菌素C四种苝醌类化合物。

本发明的技术方案：四种苝醌类化合物是从蛇足石杉内生竹黄菌株Shiraiasp.slf-14发酵产物制备获得的，其制备流程包括以下步骤：

a）制备内生竹黄菌株Shiraiasp.slf-14的发酵培养物，将内生真菌Shiraiasp.Slf14发酵菌体进行干燥、碾碎，用质量分数60%的乙醇浸提3次，每次24h，合并提取液后减压浓缩，用等体积的石油醚、乙酸乙酯进行梯度萃取，石油醚相减压浓缩后得到浸膏A；乙酸乙酯相减压浓缩后得到浸膏B；

b)将浸膏A经硅胶柱层析，用石油醚/乙酸乙酯作为洗脱剂，从体积比100∶0～0∶100进行梯度洗脱，收集石油醚/乙酸乙酯体积比20∶80梯度洗脱下来的馏分A1；馏分A1经硅胶柱层析，以氯仿-甲醇体积比从100∶0～0∶100梯度洗脱，收集氯仿/甲醇以20：1的馏分，重结晶分离到化合物Ⅰ和Ⅱ，分别为竹红菌甲素和竹红菌乙素；

c)将浸膏B经硅胶柱层析，用氯仿/甲醇作为洗脱剂，从体积比100：0～0:100进行梯度洗脱，获得馏分B1，B2及B3，其中流分B1分别经正相硅胶柱色谱（氯仿-甲醇200：1）反复洗脱、重结晶分离到化合物Ⅰ和Ⅱ，分别为竹红菌甲素和竹红菌乙素；而馏分B2和B3分别经正相硅胶柱色谱（氯仿-甲醇50：1，20：1）反复洗脱、重结晶分离到化合物Ⅲ和Ⅳ，即为痂囊腔菌素B和痂囊腔菌素C；

所述的a）步骤内生竹黄菌株Shiraiasp.slf-14发酵是由液体发酵培养获得，培养基组成为：碳源0-50g/L，氮源0-50g/L，马铃薯汁200g/L，KH₂PO₄0-5g/L，NaCl0-5g/L，用自来水水配制；液体发酵条件：将斜面保藏的菌株Slf14转接至PDA平板上进行活化，28°C培养7d后接种至装有150mLPDB培养基的500mL摇瓶中，发酵温度为20-32°C发酵周期为8-14d；

本发明具有如下特点：用于该菌发酵的碳源可以是葡萄糖、果糖、可溶性淀粉、麦芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、或半乳糖。氮源可以是无机铵盐、无机硝酸盐、蛋白胨、酵母膏、尿素、玉米浆、或黄豆饼粉。马铃薯汁既可以补充碳源也可以补充氮源，200g/L是指称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加入1000mL水煮沸半小时，用6-8层纱布过滤，所得滤液加入培养基中，培养基终体积为1000mL。

本发明的从内生竹黄真菌Shiraiasp.Slf14的发酵培养物中制备包括下述通式（Ⅰ-Ⅳ）的化合物：

竹红菌甲素(Ⅰ)

竹红菌乙素(Ⅱ)

痂囊腔菌素B(Ⅲ)

痂囊腔菌素C(Ⅳ)

化合物Ⅰ：红色晶体，ESI-MSm/z547[M+H]⁺；¹HNMR（400MHz,CDCl₃）δ：1.71（3H,s,H-16），1.90（3H,s,H-18），2.64（1H,d,J＝12.0Hz,H-13β）,3.52（1H,d,J＝12.0Hz,H-13α），3.45（1H,s,H-15），4.08（6H,s,OCH₃-6,7），4.12（3H,s,2-OCH₃），4.28（3H,s,11-OCH₃），6.56（1H,s,H-8或5），6.62（1H,s,H-5或8），15.92（1H,s,OH-9或4），15.96（1H,s,OH-4或9）；¹³CNMR（100MHz,CDCl₃）δ：26.9（C-16），30.1（C-18），41.8（C-13），56.5（6-OCH₃），56.6（7-OCH₃），60.8（11-OCH₃），61.9（C-13），62.1（2-OCH₃），78.6（C-14），101.9（C-8或5），102.1（C-5或8），106.7（C-9a或3a），106.8（C-3a或9a），117.6（C-7a或6a），118.6（C-6a或7a），125.0（C-9b或3b），125.3（C-3b或9b），127.6（C-1a），128.5（C-12a），133.2（C-1），134.1（C-12），150.6（C-11），150.9（C-2），167.4（C-7或6），167.5（C-6或7），170.9（C-10或3），171.8（C-3或10），179.8（C-9或4），180.3（C-4或9），207.4（C-17）。上述数据与文献[沈云修,荣先国,高宗华.竹黄的化学成分研究[J].中国中药杂志,2002,27(9):674.]对照基本一致，确定该化合物为竹红菌甲素。

化合物Ⅱ：红色晶体，ESI-MSm/z529[M+H]⁺；¹HNMR（400MHz,CDCl₃）δ：1.85（3H,s,H-16），2.38（3H,s,H-18），3.23（1H,d,J＝11.5Hz,H-13β），4.05（6H,s,OCH₃-6,7），4.05（1H,d,J＝11.5Hz,H-13α），4.09（3H,s,11或2-OCH₃），4.15（3H,s,2或11-OCH₃），6.42（1H,s,H-8或5）,6.44（1H,s,H-5或8），16.00（1H,s,9或4-OH），16.03（2H,s,4或9-OH）；¹³CNMR（100MHz,CDCl₃）δ：20.7（C-16），29.5（C-18），34.8（C-13），56.5（7或6-OCH₃），56.6（6或7-OCH₃），61.2（11或2-OCH₃），61.3（2或11-OCH₃），103.1（C-8或5），103.2（C-5或8），107.4（C-9a或3a），108.7（C-3a或9a），121.1（C-7a或6a），121.6（C-6a或7a），123.2（C-9b或3b），124.1（C-3b或9b），124.2（C-12a或1a），124.3（C-1a或12a），134.0（C-12或1），134.3（C-1或12），134.5（C-15），144.8（C-14），146.8（C-11或2），149.5（C-2或11），163.4（C-7或6），164.8（C-6或7），168.0（C-10或3），168.3（C-3或10），186.1（C-4），186.1（C-9），200.1（C-17）。上述数据与文献[殷志琦,陈占利,张健,等.药用真菌竹黄的化学成分研究[J].中国中药杂志,2013,38(007):1008.]对照基本一致，确定该化合物为竹红菌乙素。

化合物Ⅲ：红色晶体，ESI-MSm/z547[M+H]⁺；¹HNMR（400MHz,CDCl₃）δ：1.14（3H,d,J=6.4Hz,H-16），2.09（3H,s,H-18），3.63（1H,m,H-14），4.06（3H,s,OCH₃-7），4.07（3H,s,OCH₃-6），4.20（3H,m,H-15），4.25（3H,s,OCH₃-11），4.26（3H,s,OCH₃-2），5.14（1H,s,H-13），6.60（1H,s,H-8），6.61（1H,s,H-5），16.15（2H,s,OH-3,10）；¹³CNMR（100MHz,CDCl₃）δ：21.9（C-16），28.4（C-18），42.5（C-14），49.0（C-13），56.5（OCH₃-6,7），60.9（11-OCH₃），61.3（2-OCH₃），69.8（C-15），102.3（C-8），102.4（C-5），107.5（C-9a），107.8（C-3a），118.4（C-6a），118.6（C-7a），122.3（C-3b），122.3（C-9b），122.7（C-1a），122.8（C-12a），130.6（C-1），133.6（C-12），150.2（C-11），150.4（C-2），167.4（C-7），167.5（C-6），171.9（C-10），172.0（C-3），179.7（C-9），179.8（C-4），206.0（C-17）。上述数据与文献[刘为忠,沈云修,李维莉,等.一株产生苝醌类化合物的真菌的化学成分研究(Ⅱ)[J].中草药,2003,34(2):111.]对照基本一致，确定该化合物为痂囊腔菌素B。

化合物Ⅳ：红色晶体，ESI-MSm/z549[M+H]⁺；¹HNMR（400MHz,CDCl₃）δ：1.12（6H,d,H-16,18），3.69（2H,m,H-15,17），4.06（6H,s,OCH₃-6,7），4.16（2H,d,J=8.5Hz,H-13,14），4.21（6H,s,OCH₃-2,11），6.60（2H,s,H-5,8），16.14（2H,s,OH-4,9）；¹³CNMR（100MHz,CDCl₃）δ：22.0（C-16,18），42.2（C-13,14），56.5（OCH₃-6,7），61.2（OCH₃-2,11），70.3（C-15,17），102.3（C-5,8），107.4（C-3a,9a），118.4（C-6a,7a），122.6（C-12a,1a或C-9b,3b），122.8（C-1a,12a或C-3b,C-9b），134.6（C-12,1），150.6（C-11,2），167.4（C-6,7），171.9（C-3,10），179.6（C-4,9）。上述数据与文献[梁晓辉.竹黄菌发酵产竹红菌素的研究[D].无锡:江南大学,2009.]对照基本一致，确定该化合物为痂囊腔菌素C。

本发明提供了一种蛇足石杉来源的能产生多种苝醌类化合物的内生竹黄菌发酵制备红菌甲素，竹红菌乙素，痂囊腔菌素B和痂囊腔菌素C的新菌种来源和方法。

附图说明

图1是本发明的化合物Ⅰ：竹红菌甲素(HypocrellinsA)，化合物Ⅱ：竹红菌乙素(HypocrellinsB)，化合物Ⅲ：痂囊腔菌素B(ElsinochromesB)和化合物Ⅳ：痂囊腔菌素C(ElsinochromesC)的结构式。

具体实施方式：

如图1所示，以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制；

实施例1：

一、内生竹黄菌株Shiraiasp.slf-14发酵培养

（1）配制培养基：

种子培养基配制，每升培养基中含有：玉米粉15g/L，淀粉5g/L，黄豆饼粉5g/L，酵母粉2g/L，KH2PO40.5g/L，NaCl0.5g/L，定容至1000mL，pH为8。

发酵培养基配制：葡萄糖或蔗糖20g/L，200g/L马铃薯汁，马铃薯汁配制是称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加入1000mL水煮沸半小时，用6-8层纱布过滤，所得滤液加入培养基中，培养基终体积为1000mL。

（2）发酵：

种子培养：将在平板上活化的内生竹黄菌株Shiraiasp.slf-14接入种子培养基中，28°C，140rpm发酵培养5d制得种子液；

发酵培养：将种子液以10%的接种量接入到发酵培养基中，发酵摇瓶是装有150mLPDB培养基的500mL摇瓶中，28°C，120rpm，发酵培养12d通过过滤收集获得发酵菌体。

二、内生竹黄菌株Shiraiasp.slf-14发酵菌体苝醌类化合物的分离提取

1、发酵菌体的收集

将内生竹黄菌Shiraiasp.slf-1428°C发酵培养12d后，4层纱布过滤收集菌体，放置于40°C烘箱中烘干，烘干的菌体放置在-20°C冰箱中保存待用。

2、发酵菌体的萃取

将发酵收集的菌体进行干燥、碾碎，用60%的乙醇浸提3次，每次24h，合并提取液后减压浓缩，用等体积的石油醚、乙酸乙酯进行梯度萃取，石油醚相减压浓缩后得到浸膏A；乙酸乙酯相减压浓缩后得到浸膏B；

3、化合物的分离纯化

将浸膏A经硅胶柱层析，用石油醚/乙酸乙酯作为洗脱剂，从体积比100∶0～0∶100进行梯度洗脱，收集石油醚/乙酸乙酯体积比20∶80梯度洗脱下来的馏分A1；馏分A1经硅胶柱层析，以氯仿-甲醇体积比从100∶0～0∶100梯度洗脱，收集氯仿/甲醇以20：1的馏分，重结晶分离到化合物Ⅰ和Ⅱ，分别为竹红菌甲素和竹红菌乙素；

将浸膏B经硅胶柱层析，用氯仿/甲醇作为洗脱剂，从体积比100：0～0:100进行梯度洗脱，获得馏分B1，B2及B3，其中流分B1分别经正相硅胶柱色谱（氯仿-甲醇200：1）反复洗脱、重结晶分离到化合物Ⅰ和Ⅱ，分别为竹红菌甲素和竹红菌乙素；而馏分B2和B3分别经正相硅胶柱色谱（氯仿-甲醇50：1，20：1）反复洗脱、重结晶分离到化合物Ⅲ和Ⅳ，即为痂囊腔菌素B和痂囊腔菌素C；

4、分离化合物的结构鉴定

对于纯化得到的四个组分，采用ESI-MS质谱仪及核磁共振（NMR）进行验证，通过比对已有数据确定纯化得到的四个组分确实为竹红菌甲素(Ⅰ)、竹红菌乙素(Ⅱ)、痂囊腔菌素B(Ⅲ)和痂囊腔菌素C(Ⅳ)。

Claims

1.一种内生竹黄真菌发酵制备苝醌类化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a）制备内生竹黄菌株Shiraiasp.slf-14的发酵培养物，将内生真菌Shiraiasp.Slf14发酵菌体进行干燥、碾碎，用质量分数60%的乙醇浸提3次，每次24h，合并提取液后减压浓缩，用等体积的石油醚、乙酸乙酯进行梯度萃取，石油醚相减压浓缩后得到浸膏A；乙酸乙酯相减压浓缩后得到浸膏B；所述的步骤a）内生竹黄菌株Shiraiasp.slf-14发酵是由液体发酵培养获得，培养基组成为：碳源0-50g/L，氮源0-50g/L，马铃薯汁200g/L，KH₂PO₄0-5g/L，NaCl0-5g/L，用自来水配制；液体发酵条件：将斜面保藏的菌株Slf14转接至马铃薯-琼脂（PDA）平板上进行活化，28℃培养7d后接种至装有150mL马铃薯液体（PDB）培养基的500mL摇瓶中，发酵温度为20-32℃发酵周期为8-14d；

c)将浸膏B经硅胶柱层析，用氯仿/甲醇作为洗脱剂，从体积比100：0～0:100进行梯度洗脱，获得馏分B1，B2及B3，其中馏分B1分别经正相硅胶柱色谱反复洗脱、重结晶分离到化合物Ⅰ和Ⅱ，分别为竹红菌甲素和竹红菌乙素；而馏分B2和B3分别经正相硅胶柱色谱反复洗脱、重结晶分离到化合物Ⅲ和Ⅳ，即为痂囊腔菌素B和痂囊腔菌素C。

2.根据权利要求1所述的一种内生竹黄真菌发酵制备苝醌类化合物的方法，其特征在于：所述碳源选用葡萄糖、果糖、可溶性淀粉、麦芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、或半乳糖。

3.根据权利要求1所述的一种内生竹黄真菌发酵制备苝醌类化合物的方法，其特征在于：所述氮源选用无机铵盐、无机硝酸盐、蛋白胨、酵母膏、尿素、玉米浆、或黄豆饼粉。