CN104357525B - 一种利用微生物发酵生产甘草次酸的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用微生物发酵生产甘草次酸的方法，涉及一种生产甘草次酸的方法。是要解决现有生产甘草次酸的方法存在生产工艺复杂、费用高、环境污染的问题。方法：一、甘草内生真菌RP4菌株的活化；二、甘草内生真菌RP4种子液的制备；三、甘草内生真菌RP4发酵液供试品的制备；四、甘草内生真菌RP4发酵液中甘草次酸的提取分离。本发明方法工艺简单，成本低，使用生物发酵来生产，不污染环境。用于生产甘草次酸。
Description
技术领域
本发明涉及一种生产甘草次酸的方法。
背景技术
甘草次酸(Glycyrrhetinic acid，GA)为药用植物甘草(Glycrrhiza uralensisFisch)的有效成分之一，又称甘草亭酸，是五环三萜类齐墩果烷型化合物(见图1)，分子式：C30H46O4，分子量为470.69，一般呈白色针状结晶，无嗅无味，熔点为297～298℃，可溶于甲醇、乙醇、氯仿，具有荧光性，在波长254nm处有最大吸收。甘草次酸的结构如下：
甘草次酸除具有肾上腺皮质激素样作用及抗溃疡、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗心律失常、清除自由基等药理作用，还有镇咳、消痰、降血脂、抗胆碱酯酶、抗破伤风毒素、抗凝血、提高内耳听觉等作用，现广泛应用于医药、食品及日用化学品领域。
由于甘草次酸具有以上药理作用及用途，使得甘草次酸在预防及治疗疾病方面日益引起研究人员的注意，对其进行深入开发研究有着广阔的前景，并且有望成为一种可防治多种疾病的新型药物。但是，甘草中的甘草次酸含量较低，只有0.1％左右，应用传统的化学合成法以及酸化裂解法生产甘草次酸，存在着生产工艺复杂、产率低、费用高、环境污染等缺点。因此，迫切需要寻找一种生产甘草次酸的新方法，从而为保护自然资源，促进中药的现代化研究开辟新的途径。
发明内容
本发明是要解决现有生产甘草次酸的方法存在生产工艺复杂、费用高、环境污染的问题，提供一种利用微生物发酵生产甘草次酸的方法。
本发明利用微生物发酵生产甘草次酸的方法，按以下步骤进行：
一、甘草内生真菌RP4菌株的活化：将RP4菌株接种于马铃薯固体培养基平板上，放置于恒温箱中，培养3d，得到活化的RP4菌株；
二、甘草内生真菌RP4种子液的制备：将活化后的RP4菌株在无菌条件下以接种环挑取菌丝接种于马铃薯液体培养基中培养，计数，以浓度为3×108CFU/mL的菌液作为种子液；
三、甘草内生真菌RP4发酵液供试品的制备：取种子液50μL，接种至300mL马铃薯液体培养基中培养，获得RP4菌株发酵样品，将RP4菌株发酵样品真空抽滤，得RP4菌株发酵液，将所得RP4菌株发酵液至于50℃减压浓缩至100mL作为供试品；
四、甘草内生真菌RP4发酵液中甘草次酸的提取分离：将步骤三获得的供试品采用乙醚萃取3次，再采用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，于50℃减压浓缩至100mL，放置于高速冷冻离心机中离心，弃去沉淀，将上层溶液挥去溶剂，加入2g柱层层析硅胶，搅拌均匀后挥干溶剂作为柱层析样品，采用湿法装柱，经过二次硅胶柱层析分离后得到甘草次酸。
本发明所述RP4菌株为枝顶孢菌(Acremonium dichromosporum)RP4，已在中文专利ZL 201210171187.2中公开，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M2012048，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日。
本发明生产甘草次酸的原料为内生真菌RP4的发酵液，该发酵液原料廉价易得，即节省了甘草植物资源又开辟了甘草次酸原料生产的新途径。本发明方法工艺简单，成本低，使用生物发酵来生产，不污染环境。本发明从RP4菌株发酵液中对甘草次酸进行提取分离，形成成熟的技术路线后进行工厂化生产，以应用到医药、食品等行业，解决甘草次酸原料紧缺的问题。本发明方法生产甘草次酸的产率可达到2mg/L。
附图说明
图1为实验1中结晶物质薄层鉴别结果；图2为结晶物质外观形态照片；图3为结晶物质的HPLC色谱图；图4为甘草次酸对照品的HPLC色谱图；图5为加入对照品后结晶物质的HPLC色谱图；图6为甘草次酸对照品的HPLC/MS鉴定结果；图7为结晶物质的HPLC/MS鉴定结果；图8为氢核磁共振谱。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式利用微生物发酵生产甘草次酸的方法，按以下步骤进行：
一、甘草内生真菌RP4菌株的活化：将RP4菌株接种于马铃薯固体培养基平板上，放置于恒温箱中，培养3d，得到活化的RP4菌株；
二、甘草内生真菌RP4种子液的制备：将活化后的RP4菌株在无菌条件下以接种环挑取菌丝接种于马铃薯液体培养基中培养，计数，以浓度为3×108CFU/mL的菌液作为种子液；
三、甘草内生真菌RP4发酵液供试品的制备：取种子液50μL，接种至300mL马铃薯液体培养基中培养，获得RP4菌株发酵样品，将RP4菌株发酵样品真空抽滤，得RP4菌株发酵液，将所得RP4菌株发酵液至于50℃减压浓缩至100mL作为供试品；
四、甘草内生真菌RP4发酵液中甘草次酸的提取分离：将步骤三获得的供试品采用乙醚萃取3次，再采用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，于50℃减压浓缩至100mL，放置于高速冷冻离心机中离心，弃去沉淀，将上层溶液挥去溶剂，加入2g柱层层析硅胶，搅拌均匀后挥干溶剂作为柱层析样品，采用湿法装柱，经过二次硅胶柱层析分离后得到甘草次酸。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中恒温箱的温度为28℃。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤二中所述培养的条件为于28℃，120r/min下摇床培养3d。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤三中所述培养的条件为于28℃，120r/min下摇床培养15d。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤四所述离心的转速为14000r/min，离心的时间为10min。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤四所述柱层层析硅胶为80-100目，在使用前先于120℃烘箱中活化2h。其它与具体实施方式一至五之一相同。
实验1：
本实验利用微生物发酵生产甘草次酸的方法，按以下步骤进行：
一、甘草内生真菌RP4菌株的活化：将RP4菌株接种于马铃薯固体培养基平板上，放置于28℃恒温箱中，培养3d，得到活化的RP4菌株；马铃薯固体培养基的配制：去皮马铃薯200g切成小块，放入沸水中煎煮30min，以8层纱布过滤除去马铃薯块，向滤液中加入葡萄糖20g，再次煮沸后加入琼脂20g，全部溶解后，定容至1000mL，121℃高压灭菌30min，冷却备用。
二、甘草内生真菌RP4种子液的制备：将活化后的RP4菌株在无菌条件下以接种环挑取菌丝接种于含有50mL马铃薯液体培养基的100mL锥形瓶中，于28℃，120r/min条件下摇床培养3d，计数，以浓度为3×108CFU/mL的菌液作为种子液；马铃薯液体培养基的配制：配制方法同马铃薯固体培养基，区别在于不添加琼脂。
三、甘草内生真菌RP4发酵液供试品的制备：取种子液50μL，接种至含300mL马铃薯液体培养基的500mL锥形瓶中，共发酵8L，于28℃，120r/min摇床培养15d后，获得RP4菌株发酵样品，将RP4菌株发酵样品真空抽滤，去除菌丝体，得RP4菌株发酵液，将所得RP4菌株发酵液至于50℃减压浓缩至100mL作为供试品；
四、甘草内生真菌RP4发酵液中甘草次酸的提取分离：将步骤三获得的供试品采用乙醚萃取3次(3×140mL)，再采用乙酸乙酯萃取3次(3×140mL)，合并乙酸乙酯萃取液，于50℃减压浓缩至100mL，放置于高速冷冻离心机中，以14000r/min离心10min，弃去沉淀，将上层溶液挥去溶剂后，加入2g柱层层析硅胶，搅拌均匀后挥干溶剂作为柱层析样品，进行硅胶柱分离。
步骤四所述柱层层析硅胶为80-100目，在使用前先于120℃烘箱中活化2h。
五、硅胶柱色谱分离方法：采用湿法装柱。
称取柱层析硅胶(200-300目)15g，置于120℃烘箱中活化2h，放置于干燥器中冷却备用。将活化后的硅胶(200-300目)加入石油醚制成混悬液，均匀搅拌除去气泡，将硅胶混悬液缓慢倒入层析柱(内径2cm，柱长50cm)内，打开下部活塞，缓慢加入石油醚冲洗硅胶柱至柱床不再下降，再用两倍柱体积的洗脱液体系稳定硅胶柱。
将步骤四得到的柱层析样品均匀铺在硅胶柱上方，以石油醚-乙酸乙酯(15:5；15:10；15:15；10:15；5:15)进行梯度洗脱，收集洗脱液，每10mL收一馏分，并用薄层鉴别(TLC)对其进行检测，根据TLC结果合并含有甘草次酸的馏分，将合并后的馏分中的溶剂挥干，进行二次硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯(15:10)为洗脱液，分离得到单体物质；单体物质以石油醚-乙酸乙酯(15:15)为洗脱液进行硅胶柱纯化，将得到洗脱液合并、挥干、重结晶，结晶物质薄层鉴别结果如图1，得到结晶物质。经薄层鉴别，结晶物质与甘草次酸对照品Rf值相同，初步认定结晶物质为甘草次酸。该结晶物质外观形态如图2所示，结晶物质为白色针状结晶，易溶于可溶于甲醇、乙醇、氯仿。
六、对结晶物质的结构鉴定：
1、采用HPLC法进行纯度分析：采用流动相为甲醇-水-冰醋酸(85:14:1)时，结晶物质的HPLC色谱图见图3，甘草次酸对照品的HPLC色谱图见图4，加入对照品后结晶物质的HPLC色谱图见图5。由图3，图4和图5可知，甘草内生真菌RP4发酵液中分离纯化出的结晶物质为单峰，纯度较高，并且与甘草次酸对照品保留时间一致，而且通过对照品加入法得到了较好的确认。
2、氢核磁共振谱(1H-NMR)鉴别：根据结晶物质的薄层鉴别(TLC)及HPLC的测定结果，已初步确定结晶物质为甘草次酸，对结晶物质进行氢核磁共振谱(1H-NMR)进行鉴别，结果见图8。将结晶物质的氢核磁共振谱与谱库进行对比分析，确定结晶物质的氢核磁共振谱图数据与已知化合物甘草次酸一致，确定结晶物质为甘草次酸。
3、HPLC/MS分析：质谱条件：ESI离子源；雾化气压力为2.41×105Pa；氮气流速为10mL/min；干燥气体温度350℃；毛细管电压为3000V；采用正离子模式，在m/z100～1000内进行扫描，甘草次酸对照品的HPLC/MS鉴定结果见图6，结晶物质的HPLC/MS鉴定结果见图7，结果表明甘草次酸和结晶物质分子量完全吻合。
综合TLC、HPLC、1H-NMR及HPLC/MS测定结果，确定从甘草内生真菌RP4发酵液中分离得到甘草次酸，其分子量为470.69，分子式为C30H46O4。因此采用上述工艺可以利用甘草内生真菌RP4生产甘草次酸原料，为工业化生产甘草次酸提供新方法。
Claims (2)
1.一种利用微生物发酵生产甘草次酸的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
一、甘草内生真菌RP4菌株的活化：将RP4菌株接种于马铃薯固体培养基平板上，放置于恒温箱中，培养3d，得到活化的RP4菌株；
二、甘草内生真菌RP4种子液的制备：将活化后的RP4菌株在无菌条件下以接种环挑取菌丝接种于马铃薯液体培养基中培养，计数，以浓度为3×108CFU/mL的菌液作为种子液；
三、甘草内生真菌RP4发酵液供试品的制备：取种子液50μL，接种至300mL马铃薯液体培养基中培养，获得RP4菌株发酵样品，将RP4菌株发酵样品真空抽滤，得RP4菌株发酵液，将所得RP4菌株发酵液至于50℃减压浓缩至100mL作为供试品；
四、甘草内生真菌RP4发酵液中甘草次酸的提取分离：将步骤三获得的供试品采用乙醚萃取3次，再采用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，于50℃减压浓缩至100mL，放置于高速冷冻离心机中离心，弃去沉淀，将上层溶液挥去溶剂，加入2g柱层层析硅胶，搅拌均匀后挥干溶剂作为柱层析样品，采用湿法装柱，经过二次硅胶柱层析分离后得到甘草次酸；
其中步骤一中恒温箱的温度为28℃；步骤二中所述培养的条件为于28℃，120r/min下摇床培养3d；步骤三中所述培养的条件为于28℃，120r/min下摇床培养15d；步骤四所述离心的转速为14000r/min，离心的时间为10min；
所述RP4菌株为枝顶孢菌(Acremonium dichromosporum)RP4，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 2012048，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日。
2.根据权利要求1所述的一种利用微生物发酵生产甘草次酸的方法，其特征在于步骤四所述柱层层析硅胶为80-100目，在使用前先于120℃烘箱中活化2h。
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