CN104988192A

CN104988192A - 一种桑黄素d的制备方法

Info

Publication number: CN104988192A
Application number: CN201510291698.1A
Authority: CN
Inventors: 吴秀丽; 陈靖; 汪静; 刘成; 余建强; 付雪艳; 张新慧; 高晓娟; 赵云生; 刘河涛
Original assignee: Ningxia Medical University
Current assignee: Ningxia Medical University
Priority date: 2015-06-01
Filing date: 2015-06-01
Publication date: 2015-10-21

Abstract

本发明公开了一种桑黄素D的制备方法，利用火木层孔菌制备菌丝悬液，加入到亚硝酸钠溶液和醋酸缓冲液的混合液中进行诱变，将诱变液在固体培养基上培养，挑取优势菌株种至液体发酵培养基中，收集发酵液，经过滤后水洗、95％乙醇洗脱并收集醇提部分，旋蒸、干燥既得。本发明方法操作简单，副产物少，为桑黄素D的工业化生产奠定了基础。

Description

一种桑黄素D的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种桑黄素D的制备方法。

背景技术

桑黄是我国传统药用真菌，味甘、辛、无毒，是针层孔属真菌火木层孔菌(Phellinus igniarius)的子实体。桑黄寄生于杨、柳、桦及栎等树的树干上，为多年生。桑黄除了具有传统的治疗淋病、崩漏、带下、排毒、和胃止泻等功效外，还具有抗癌、免疫调节、保肝、抗肝硬化、抗脂质过氧化和抗诱变等药用功能。近年来，由于桑黄所特有的药理活性，使其成为国内外学者研究的热点，并被誉为目前国际公认的抗癌疗效最好的药用真菌之一，在生物治癌领域中有效率排在第一位。

桑黄素D是从野生桑黄子实体中分离得到的具有苯乙烯基吡喃酮(styrylpyrones)母核结构的真菌代谢产物，该类型化合物具有较强的肿瘤细胞毒活性，对A549和Bel7402两种细胞的IC₅₀值分别为0.010和0.008μM。然而，野生桑黄资源极其溃乏，人工栽培存在困难，极大的限制了资源的开发利用。因此，尽快寻找可替代资源，并进行深入的基础研究尤为必要。

发明内容

本发明针对现有桑黄资源匮乏的现状，目的在于提供一种桑黄素D的制备方法，具体针对桑黄的基源菌种进行亚硝酸诱导改造，从诱导菌株的次生代谢产物中得到桑黄素D的方法。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种桑黄素D的制备方法，包括以下步骤：

1)菌悬液制备

火木层孔菌菌株活化后，置于28℃培养箱中培养，挑选菌落形态较大、生长状态良好的菌株，挑取菌丝置于盛有无菌玻璃珠与生理盐水的锥形瓶中，充分震荡制备菌丝悬液；

2)亚硝酸诱变

取菌丝悬液2mL加入到1mL 0.005mol/L亚硝酸钠溶液和2mL、pH 4.4的醋酸缓冲液混合液中，28℃水浴诱变处理60min后，终止诱变；

3)涂平板培养

取终止液均匀涂布于固体培养基平板上，置于28℃培养箱中暗处培养；

4)挑选再生菌接种至斜面培养基中继续培养，连续挑取优势菌株培养三代至菌体稳定增殖；

5)将诱变后的优势菌株接种至液体发酵培养基中，于28℃，180rpm震荡培养21天，收集发酵液，用三层纱布滤除菌丝体，发酵液过大孔树脂柱，经水洗、95％乙醇洗脱并收集醇提部分，旋蒸、干燥。

本发明所述的终止诱变的具体过程为：取诱变液0.5mL加入到1mL、pH 8.6的磷酸氢二钠溶液中，使混合液的pH呈中性，终止诱变。

本发明所述的液体发酵培养基为：葡萄糖20g/L、蛋白胨+酵母粉7g/L、磷酸氢二钾1g/L、无水硫酸镁0.5g/L，pH自然。

本发明所述的固体培养基为：液体发酵培养基添加2％琼脂。

本发明所述的火木层孔菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

本发明的有益效果为：本发明通过对桑黄的基源菌种进行亚硝酸诱导改造，从诱导菌株次生代谢产物中得到桑黄素D，解决了由于野生桑黄资源溃乏带来的桑黄素D不能得到开发利用的问题，开辟了新的桑黄素来源的替代物，为桑黄素D在抗肿瘤药物中推广使用提供了技术支持。

附图说明

图1为桑黄素D对照品的液相色谱图；

图2为火木层孔菌原始菌的液相色谱图；

图3为火木层孔菌亚硝酸诱导菌的液相色谱图；

图4是原始菌株代谢产物的HPLC-MS-MS图；

图5是诱导菌株代谢产物的HPLC-MS-MS图；

图6是诱导菌株代谢产物5.30min的二级图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1

本发明所要解决的技术问题是针对桑黄的基源菌种进行亚硝酸诱导改造，从诱导菌株的次生代谢产物中得到桑黄素D的方法。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试菌株：火木层孔菌(Phellinus igniarius)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。

1.1.2培养基

液体发酵培养基(商用马丁培养基)：葡萄糖(20g/L)、蛋白胨+酵母粉(7g/L)、磷酸氢二钾(1g/L)、无水硫酸镁(0.5g/L)，pH自然；

固体培养基：液体发酵培养基添加2％琼脂。

1.2方法

1.2.1亚硝酸诱变

菌悬液制备：火木层孔菌菌株活化后，置于28℃培养箱中培养。挑选菌落形态较大、生长状态良好的菌株，挑取菌丝置于盛有无菌玻璃珠与生理盐水的锥形瓶中，充分震荡制备菌丝悬液。

亚硝酸诱变：取上述菌丝悬液2mL加入到1mL 0.005mol/L亚硝酸钠溶液和2mL、pH 4.4的醋酸缓冲液混合液中，28℃水浴诱变处理60min。

终止诱变：取上述诱变液0.5mL加入到1mL、pH 8.6的磷酸氢二钠溶液中，使混合液的pH呈中性，终止诱变。

涂平板培养：取上述终止液0.4mL均匀涂布于固体培养基平板上，将其置于28℃培养箱中暗处培养。

1.2.2菌种初筛

挑选实验平板上再生菌斑数占对照菌斑数量小于百分之一(平板上菌斑小于5最适宜)，接种至斜面培养基中继续培养，再生菌株与原始菌株在菌落生长活力和代谢颜色方面有较大差异，连续挑曲优势菌株培养三代至菌体稳定增殖，保存待用。

1.3代谢产物提取

将亚硝酸诱变后的优势菌株接种至液体发酵培养基中，于28℃，180rpm震荡培养21天。收集发酵液，用三层纱布滤除菌丝体，发酵液过大孔树脂柱，经水洗、95％乙醇洗脱并收集醇提部分，旋蒸、干燥备用。

1.4代谢产物鉴定

采用HPLC对优势菌株与火木层孔菌的代谢产物进行测试，实验仪器其条件为：

Agilent 1220型液相色谱仪，Eclipse XDB-C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，色谱柱流动相为甲醇-水-甲酸梯度洗脱(见下表)，流速：1mL/min，柱温30℃，检测波长为380nm，进样量10μL。

洗脱时间	甲醇	水	甲酸
				0	50	50	0.2
20	80	20	0.2
				25	100	0	0

如图1～3所示，以桑黄素D作对照，发现诱导前380nm(桑黄素类成分最大吸收波长)处，色谱峰较少，而诱导后峰明显增多，在保留时间12.2′的位置有桑黄素D的峰。

仪器信息及液相条件

根据前期对桑黄素类质谱结构特征分析发现，多个化合物的质谱裂解碎片中有m/z163的片断出现，应该是结构中类咖啡酰基片段产生。因此在对火木层孔菌和诱变后优势菌株的代谢产物进行HPLC-MS-MS时，手动提取能产生m/z 163.1子离子的成分(见图4和图5，一般认为大于11min峰为干扰成分)，明显看出诱导前代谢产物中几乎没有能够产生m/z 163的质谱信息，而诱导后则有多个可以产生m/z 163的信息，继续追踪5.30min处的二级质谱(见图6)发现其分子量为380，与桑黄素D的质谱图对照，基本一致，因此判定诱导后菌株中含有桑黄素D。

Claims

1.一种桑黄素D的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)菌悬液制备

2)亚硝酸诱变

3)涂平板培养

4)挑选菌斑数小于5的再生菌接种至斜面培养基中继续培养，连续挑取优势菌株培养三代至菌体稳定增殖；

2.根据权利要求1所述的一种桑黄素D的制备方法，其特征在于：所述的终止诱变的具体过程为：取诱变液0.5mL加入到1mL、pH 8.6的磷酸氢二钠溶液中，使混合液的pH呈中性，终止诱变。

3.根据权利要求1所述的一种桑黄素D的制备方法，其特征在于：所述的液体发酵培养基为：葡萄糖20g/L、蛋白胨+酵母粉7g/L、磷酸氢二钾1g/L、无水硫酸镁0.5g/L，pH自然。

4.根据权利要求1所述的一种桑黄素D的制备方法，其特征在于：所述的固体培养基为：液体发酵培养基添加2％琼脂。

5.根据权利要求1所述的一种桑黄素D的制备方法，其特征在于：所述的火木层孔菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。