CN107841523A - 利用群体感应分子诱导从桦褐孔菌中提取三萜类物质方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用群体感应分子诱导从桦褐孔菌中提取三萜类物质方法，包括：将活化的桦褐孔菌(Inonotus obliquus)CFCC 83414接入液体培养基，于24‑26℃发酵培养8‑14天，在发酵第5‑8天加入群体感应分子，发酵完成后，分离菌体和发酵液，通过后处理从菌体和发酵液中分离纯化得到三萜类物质。本发明通过在发酵中期加入群体感应分子刺激桦褐孔菌的生长，该方法无需引入基因工程菌株或外加酶，后处理简单，能有效提高桦褐孔菌中三萜类物质的产量。

Description

利用群体感应分子诱导从桦褐孔菌中提取三萜类物质方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵及代谢领域，尤其涉及一种利用群体感应分子诱导从桦褐孔菌中提取三萜类物质的方法。
背景技术
桦褐孔菌(Inonotus obliquus)是一种十分珍稀而名贵的药用真菌，属于真菌门、担子菌亚门、层菌纲、非褐菌目、多孔菌科、褐卧孔菌属。主要分布于俄罗斯、芬兰、波兰、日本北海道等北半球北纬40°～50°的地区和我国的黑龙江大兴安岭、吉林长白山一带。从16世纪以来，俄罗斯、波兰、芬兰等国家的民间就广泛使用桦褐孔菌来治疗各种疑难杂症，如各种癌症、心脏病和糖尿病等。
桦褐孔菌是生长在寒带的木腐菌，引起白桦、银桦、榆树、赤杨的白腐。在木材中的桦褐孔菌菌丝在零下40℃也不会冻死，是极耐寒的种类。桦褐孔菌的形态特征：菌核呈现瘤状(不育性的块状物)，外表黑灰，有不规则沟痕，内部黄色，无柄，直径25～40cm，深色，表面深裂，很硬，干时脆，可育部分厚5mm，皮壳状薄，暗褐色；菌管3～10mm，脆、通常菌管的前端开裂，菌孔每mm 6～8个，圆形，浅白色，后变暗褐色；菌肉木柱质，有轻微的、模糊不清的环纹，鲜(明亮)淡黄褐色。孢子呈阔椭圆状至卵状，光滑，9～10μm×5.5～6.5μm，有刚毛。
桦褐孔菌含有多糖、三萜类、桦褐孔菌醇、多种氧化三萜类化合物、栓菌酸、多种羊毛甾醇型三萜类化合物、叶酸衍生物、芳香族的香草酸、丁香酸及γ羟基苯甲酸，还有报道称已分离出单宁化合物、类固醇、生物碱类化合物、黑色素类、低分子多酚类及木质素类化合物。
三萜类物质的药理研究成果表明其具有抗肿瘤、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎镇痛、免疫调节保肝、提高动物免疫力和在胚胎细胞发育过程中的调控作用等多种活性，此外，在抗氧化、抗糖尿病、调节心血管系统等方面均呈现出较好的生物活性。
白桦脂酸(Betulinic acid，BA)，又名桦木酸，是一种五环三萜类化合物。广泛分布于多种植物中，如鼠李科的酸枣仁、桦木科的白桦树皮、豆科的皂角刺、蔷薇科的光皮木瓜、五加科刺五加、大戟科重阳木、锦葵科木芙蓉花等。最早分离于生长在非洲东部的鼠李科常绿植物的树皮。在我国，白桦脂酸最丰富的自然资源是白桦树皮。近年研究表明，白桦脂酸具有诸多的生物活性，如抗肿瘤、抗HIV、抗炎、抗菌、抗疟疾等，尤其是在抗肿瘤方面，特别是针对黑色素瘤，有突出的表现。同时还具有作用机制特异、分子质量小、低毒性等优点，有广泛的应用开发前景，是一类很有潜力的药物先导化合物。
目前，研究表明，桦褐孔菌中可以分离到三萜类物质。但是，在实验过程中，发现从桦褐孔菌中直接提取三萜类物质时，得到的量非常低，所以希望找到一种更为高效的提高三萜类物质产量的方法。
群体感应是当菌体的数量达到一定密度时才能发生的感应现象，指的是在一个特定的环境中当菌体的数量急剧增加时，由它所分泌的信号分子的浓度也会相应升高，当其达到一个阈值水平时，菌体之间就会通过发信号来调整它们的共同行为，对较高的细胞密度作出共同的感应。
群体感应分子指的介导在菌体细胞与细胞间信息交流而引发的群体感应过程中的自体诱导物或特殊的、微小的、可扩散的信息素。菌体通过这些群体感应分子时刻监控着它们的生存环境。在菌体数量较少时，分泌的信号分子浓度较低，菌体之间保持着一种沉默寡言或处在不具备攻击能力的状态。但是，当菌体的数量急剧增加的时候，此时的细胞会通过发信号，改变和协调它们之间的行为，共同表现出它们的某些生理特性，从而更有利于整个种群的代谢活动和生理功能。
发明内容
本发明提供了一种利用群体感应分子诱导从桦褐孔菌中提取三萜类物质方法，该方法无需引入基因工程菌株、外加酶，后处理简单，能有效提高桦褐孔菌中三萜类物质，特别是白桦脂酸的产量。
一种利用群体感应分子诱导从桦褐孔菌中提取三萜类物质的方法，包括：将活化的桦褐孔菌(Inonotus obliquus)CFCC 83414接入液体培养基，于24-26℃发酵培养8-14天，在发酵第5-8天加入群体感应分子，发酵完成后，分离菌体和发酵液，通过后处理从菌体和发酵液中分离纯化得到三萜类物质；
其中，所述群体感应分子为法尼醇、色醇、对羟基苯乙醇、苯乙醇、茴香脑和香叶醇中的至少一种；
所述三萜类物质为白桦脂醇、白桦脂酸、角鲨烯和羊毛甾醇中的至少一种。
三萜类物质属于次生代谢产物，主要在桦褐孔菌的代谢过程中产生，桦褐孔菌的发酵周期一般为12天。群体感应分子及其衍生物被证明是一种能增加菌丝体生长和次级代谢产物产量的诱导剂。本发明研究发现，在发酵中期加入群体感应分子可有效提高桦褐孔菌中三萜类物质，特别是白桦脂酸的产量。
本发明中，所述桦褐孔菌(Inonotus obliquus)CFCC 83414菌株购自中国林业微生物菌种保藏管理中心，菌株编号CFCC 83414。
所述桦褐孔菌(Inonotus obliquus)CFCC 83414活化用的固体培养基为马铃薯葡萄糖琼脂合成培养基和麸皮水浸提液的混合物。马铃薯葡萄糖琼脂合成培养基可以为市售产品。
所述固体培养基中原料质量百分比组成可以为：马铃薯浸出粉1％，葡萄糖2％，琼脂1.8％，氯霉素0.01％，余量为麸皮水浸提液；其中，麸皮水浸提液为麸皮按照4-6％质量百分比浓度加入水中，经熬制、除杂后得到。
固体培养基可以通过如下方法制备：将麸皮按照4-6％质量百分比浓度加入水中，熬制0.4-0.6小时后用八层纱布过滤除去大颗粒；然后加入马铃薯葡萄糖琼脂合成培养基，混匀，煮沸，分装在玻璃管中，之后在121℃下灭菌20min，灭菌后摆成斜面待其凝固。
所述液体培养基为马铃薯葡萄糖合成培养基和麸皮水浸提液的混合物。马铃薯葡萄糖合成培养基可以为市售产品。
所述液体培养基中原料质量百分比组成可以为：马铃薯浸出粉0.8％，葡萄糖2％，余量为麸皮水浸提液；其中，麸皮水浸提液为麸皮按照4-6％质量百分比浓度加入水中，经熬制、除杂后得到。
液体培养基可以通过如下方法制备：将麸皮按照4-6％质量百分比浓度加入水中，熬制0.4-0.6小时后用八层纱布过滤除去大颗粒；然后加入马铃薯葡萄糖合成培养基，混匀，分装，之后在121℃下灭菌20min。采用此培养基配方，更有利于菌体的生长和代谢。
所述发酵温度可以为25℃，发酵时间可以为11-14天，所述发酵方式为三角瓶发酵。
发酵培养时，前2-3天转速设为0rpm/min，然后再以90-110rpm/min的转速培养2-3天，之后再以150-180r/min的转速培养。先静置2～3天，是因为刚接种后，培养基中菌体较少，所需要的氧气也较少；然后再以90-110rpm/min的转速培养2-3天，是因为这个时期，菌体已经在逐渐增多，所以要适当增大转速，以满足其对氧气的需求。之后再以150-180r/min的转速培养，是因为此时其菌体量已经达到其最大值，所以要适当加大转速。这样设置转速，更有利于菌体生长和代谢。
所述群体感应分子为法尼醇、色醇、对羟基苯乙醇、苯乙醇、茴香脑和香叶醇中的至少一种；优选为法尼醇。预实验中对法尼醇、色醇、对羟基苯乙醇、苯乙醇、茴香脑和香叶醇进行初步的比较，发现法尼醇促进三萜类物质合成的效果较显著。
所述法尼醇在加入前，先溶解在DMSO中，然后采用0.22μm的无菌的有机系滤膜过滤除菌。
所述法尼醇的加入时间可以为发酵第6-7天。因为此时添加，发酵后得到的三萜类物质量最多。
以每升发酵液计，所述法尼醇的添加量可以为0-300μmol；优选为100-300μmol；更优选为300μmol。因为加入法尼醇的量过少时，对菌体的诱导效果不明显。
所述后处理包括将菌体破碎后用乙醇溶液萃取，同时将发酵液用水饱和的正丁醇萃取，之后合并萃取液，浓缩，得到三萜类物质。
所述菌体破碎、萃取方法为：将菌体先用无菌水洗涤两次，之后加入适量的无菌水，用超声破碎仪破碎5次，每次1min(300W)，然后加入等量的95％乙醇溶液进行萃取，于23-27℃超声提取0.8-1.2h，萃取2-3次，合并，得到萃取液。
所述发酵液萃取三萜类物质方法为：将发酵液用三倍体积的水饱和的正丁醇萃取，于23-27℃超声提取0.8-1.2h，萃取2-3次，合并，得到萃取液。
所述三萜类物质更优选为白桦脂酸。白桦脂酸是三萜类物质中的一种，生物活性显著，但在自然界中较难提取。本发明研究发现，采用群体感应分子诱导，能显著提高白桦脂酸的提取率。
提取白桦脂酸时，所述后处理包括将菌体破碎后用乙醇溶液萃取，同时将发酵液用乙酸乙酯萃取，之后合并萃取液，浓缩，得到白桦脂酸。所述发酵液萃取白桦脂酸的方法为：将发酵液用等量的乙酸乙酯萃取，于23-27℃超声提取0.8-1.2h，萃取2-3次，合并，得到萃取液。
本发明在桦褐孔菌发酵过程中，于合适的时机添加诱导剂群体感应分子，以提高三萜类物质的产量，具备如下有益效果：
(1)通过在发酵中期添加群体感应分子，有效促进了桦褐孔菌及其发酵液中三萜类物质特别是白桦脂酸产量的提高，当添加法尼醇时，三萜含量最高可提高105％，特别地，白桦脂酸的产量可提高2-10倍。
(2)法尼醇、色醇、对羟基苯乙醇、苯乙醇、茴香脑和香叶醇等均为常见的群体感应分子。而法尼醇作为一种倍半萜，作为桦褐孔菌中固有的一种物质，具有多种生物活性，它的添加无需后续处理。
(3)法尼醇与油酸和真菌激发子诱导相比，对增加菌体中三萜类物质和白桦脂酸的含量效果更为显著；法尼醇与真菌激发子相比，对三萜类物质总含量的提升效果更强。法尼醇作为一种小分子，容易得到和添加，是一种良好的诱导剂。
附图说明
图1为白桦脂酸标准品的液相色谱图。
图2为菌体破碎液的液相色谱图。
图3为发酵液的液相色谱图。
图4为本发明的工艺流程图。
具体实施方式
为更好理解本发明，下面结合实施例来阐释本发明。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中：桦褐孔菌(Inonotus obliquus)CFCC 83414菌株购自中国林业微生物菌种保藏管理中心，菌株编号CFCC 83414。
实施例1
1、固体培养基的制备
将麸皮按照5％质量百分比浓度加入水中，熬制0.5小时后用八层纱布过滤除去大颗粒，得到麸皮水浸提液；然后加入PDA合成培养基(市售)，混合均匀后，将其煮沸后分装在玻璃管中，每管10mL，之后在121℃下灭菌20min。灭完菌后摆斜面至斜面凝固。
其中，原料质量百分比组成为：马铃薯浸出粉1％，葡萄糖2％，琼脂1.8％，氯霉素0.01％，余量为麸皮水浸提液。
2、菌种的活化
将桦褐孔菌CFCC 83414接种到斜面上，在25℃的培养箱中培养15天左右，待其长满整个斜面。
3、液体培养基的制备
将麸皮按照5％(以水的体积计)的比例加入水中，并且熬制半个小时后用八层纱布过滤除去大颗粒，得到麸皮水浸提液；然后加入PDB合成培养基(市售)，混合均匀后，分装在500mL的锥形瓶中，每瓶分装100mL，之后在121℃下灭菌20min。
其中，原料质量百分比组成为：马铃薯浸出粉0.8％，葡萄糖2％，余量为麸皮水浸提液。
4、接种
每个摇瓶接种1块1cm2的桦褐孔菌CFCC 83414菌种。
5、发酵
在25℃温度下培养，先静置2～3天，然后再以100rpm的转速培养2～3天，之后再以180rpm的转速培养。
6、法尼醇的加入
正常的发酵过程中，在发酵第6天加入法尼醇(法尼醇需先溶解在DMSO中配成1M的工作液后用0.22μm的无菌的有机系滤膜过滤除菌)，每瓶加入5μL，使得发酵液中法尼醇的浓度为50μM。
7、菌体和发酵液的分离和提取
将发酵液及菌体倒入50mL离心管，在3500r/min的转速下离心10min，将发酵液和菌体细胞分离。菌体用去离子水洗2次后用冻干机冻干除去水分，然后称其干重，之后每管加入15mL左右的95％乙醇溶液，用超声破碎仪破碎5次，每次1min，25℃下超声1h，萃取2次；对于每个样品，发酵液先定容至100mL，然后分别取10mL和50mL，并分别加入30mL水饱和的正丁醇和50mL乙酸乙酯萃取，25℃温度下超声1h，之后用离心机离心，转速为3500r/min，时间为10min，每个样品萃取2次。之后用旋蒸仪进行旋转蒸发浓缩，直到将其蒸干为止，旋转蒸发的参数如下：转速为120r/min，水浴的温度为50℃。
得到的晶体用1-2mL甲醇(色谱纯)溶解，用0.22μm的有机系的微孔滤膜过滤除杂，之后等待进样。
8、白桦脂酸浓度的测定：反相液相色谱法(RP-HPLC)。
其色谱检测条件：
色谱柱DiamonsilC18(250mm×4.6mm，5μm)；
流动相为乙腈/水(v/v＝91/9)；
流速1.0mL/min；
检测波长210nm；
柱温25℃；
进样量20μL；
跑样时间25min，梯度洗脱。
绘制标准曲线：取1mL标准品进样，在色谱检测条件下测定对应的峰面积值(A)，以峰面积值A为纵坐标，白桦脂酸的浓度C为横坐标，绘制标准曲线，经统计处理求得白桦脂酸浓度与峰面积的线性回归方程为：A＝8.18575C+15.47603(R2＝0.99964)。
9、三萜类物质含量的测定：香草醛-高氯酸法
香草醛-高氯酸测定方法：取待测样品溶液或样品稀释液0.1mL于试管中，70℃加热挥干溶剂，再加5％(m/v)香草醛冰醋酸溶液0.2mL，高氯酸0.5mL，混匀后于60℃水浴中20min，取出后置于冷水中15min，最后加入冰醋酸5mL，混匀后，吸取200μL于550nm下测定吸光值。每个设三个复孔。
三萜类物质标准曲线的制定(以白桦脂醇为对照)：称5mg白桦脂醇于离心管中，加10mL无水乙醇，配成500μg/mL的储备液。用无水乙醇稀释成200μg/mL的工作液。取200μg/mL的白桦脂醇工作液0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6mL于试管中(对应的浓度10，20，40，60，80，100，120μg/mL)，之后按照香草醛-冰醋酸法测量。以吸光度A为纵坐标，白桦脂醇的浓度C为横坐标，绘制标准曲线，经统计处理求得白桦脂醇浓度与吸光度的线性回归方程为：A＝8.18575C+15.47603(R2＝0.99964)。
白桦脂酸标准品、菌体破碎液和发酵液的液相色谱图分别见图1-图3；工艺流程图见图4。
实验组在发酵中期时加入法尼醇，对照组加入同样浓度的DMSO。测定结果表明，对照组和添加法尼醇的实验组冻干菌体中三萜类物质的含量分别为13.402和13.023mg/g，白桦脂酸的含量分别为4.0265和5.7236μg/g；对照组和实验组发酵液中三萜类物质含量分别为14.225和29.186mg/100mL，白桦脂酸的含量分别为0.0351和0.0427μg/mL。
由结果可知，添加50μM法尼醇的实验组白桦脂酸的产量显著高于自然发酵的对照组，实验组的发酵液中三萜类物质的含量也远远高于实验组。
实施例2
参照实施例1的桦褐孔菌发酵工艺，在加入法尼醇阶段，每瓶加入1M的法尼醇工作液10μL，使得发酵液中法尼醇的浓度为100μM。其他条件同实施例1。
三萜类物质和白桦脂酸浓度的检测方法同实施例1。
实验组在发酵中期时加入法尼醇，对照组加入同样浓度的DMSO。测定结果表明，对照组和添加法尼醇的实验组冻干菌体中三萜类物质的含量分别为13.402和14.949mg/g，白桦脂酸的含量分别为4.0265和3.2706μg/g；对照组和实验组发酵液中三萜类物质含量分别为14.225和11.473mg/100mL，白桦脂酸的含量分别为0.0351和0.1395μg/mL。
实施例3
参照实施例1的桦褐孔菌发酵工艺，在加入法尼醇阶段，每瓶加入1M的法尼醇工作液15μL，使得发酵液中法尼醇的浓度为150μM。其他条件同实施例1。
三萜类物质和白桦脂酸浓度的检测方法同实施例1。
实验组在发酵中期时加入法尼醇，对照组加入同样浓度的DMSO。测定结果表明，对照组和添加法尼醇的实验组冻干菌体中三萜类物质的含量分别为13.402和15.545mg/g，白桦脂酸的含量分别为4.0265和13.7273μg/g；对照组和实验组发酵液中三萜类物质含量分别为14.225和10.426mg/100mL，白桦脂酸的含量分别为0.0351和0.0599μg/mL。
实施例4
参照实施例1的桦褐孔菌发酵工艺，在加入法尼醇阶段，每瓶加入1M的法尼醇工作液30μL，使得发酵液中法尼醇的浓度为300μM。其他条件同实施例1。
三萜类物质和白桦脂酸浓度的检测方法同实施例1。
实验组在发酵中期时加入法尼醇，对照组加入同样浓度的DMSO。测定结果表明，对照组和添加法尼醇的实验组冻干菌体中三萜类物质的含量分别为13.402和12.894mg/g，白桦脂酸的含量分别为4.0265和40.9992μg/g；对照组和实验组发酵液中三萜类物质含量分别为14.225和17.519mg/100mL，白桦脂酸的含量分别为0.0351和0.0403μg/mL。
从实施例1～4的结果表明，添加5～300μM的法尼醇发酵的桦褐孔菌菌体或发酵液中三萜类物质以及白桦脂酸的含量总体上均高于自然发酵的对照；说明加入法尼醇后，菌体或发酵液中三萜类物质和白桦脂酸的含量均有明显的提高。

Claims (10)

1.一种利用群体感应分子诱导从桦褐孔菌中提取三萜类物质方法，包括：将活化的桦褐孔菌(Inonotus obliquus)CFCC 83414接入液体培养基，于24-26℃发酵培养8-14天，在发酵第5-8天加入群体感应分子，发酵完成后，分离菌体和发酵液，通过后处理从菌体和发酵液中分离纯化得到三萜类物质；
其中，所述群体感应分子为法尼醇、色醇、对羟基苯乙醇、苯乙醇、茴香脑和香叶醇中的至少一种；
所述三萜类物质为白桦脂醇、白桦脂酸、角鲨烯和羊毛甾醇中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液体培养基为马铃薯葡萄糖合成培养基和麸皮水浸提液的混合物。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵采用三角瓶发酵，发酵时间为11-14天；培养时，前2-3天转速设为0rpn/min，然后再以90-110rpn/min的转速培养2-3天，之后再以150-180r/min的转速培养。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述群体感应分子为法尼醇。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述法尼醇的加入时间为发酵第6-7天。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，以每升发酵液计，所述法尼醇的添加量为0-300μmol。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述后处理包括将菌体破碎后用乙醇溶液萃取，同时将发酵液用水饱和的正丁醇萃取，之后合并萃取液，浓缩，得到三萜类物质。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述三萜类物质为白桦脂酸。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述后处理包括将菌体破碎后用乙醇溶液萃取，同时将发酵液用乙酸乙酯萃取，之后合并萃取液，浓缩，得到白桦脂酸。
10.根据权利要求7或9所述的方法，其特征在于，萃取方法为：置于23-27℃下超声提取0.8-1.2h。
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