CN110004065B - 一种红褐灵芝新菌种及其人工栽培方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种野生的珍稀药用菌品种红褐灵芝Ganoderma mbrekobenum新菌种及其人工驯化的栽培方法和应用。本发明的红褐灵芝新菌种采自坦桑尼亚，经鉴定为红褐灵芝新菌种，命名为红褐灵芝(Ganoderma mbrekobenum)HMGIM‑I160003，保藏编号为CCTCC NO:M 2019092。综上所述，本发明提供一种新的红褐灵芝菌种及其人工栽培方法，驯化后外观均一产量高，平均菇袋产量达到50克，头潮生物转化率在15％及以上，并且其体外抑制肿瘤效果明显，具有实用性及开发前景。

Description

一种红褐灵芝新菌种及其人工栽培方法和应用
技术领域
本发明涉及一种珍稀药用菌新菌种及其人工栽培方法和应用，尤其涉及一种红褐灵芝新菌种及其人工栽培方法和应用。
背景技术
目前，食药用菌的产业发展迅猛，据中国食用菌协会统计，2017年我国食药用菌的产量达到3712万吨，比2016年增长了3.21％，产值为2721.92亿元，我国占全球75％以上，从业人员超过2000万人。食用菌产业在种植业中排在除了粮、菜、果、油之后的第五位，超过了茶叶和蚕桑。
在食药用菌产业蓬勃发展的今天，越来越多的珍稀食药用菌品种逐渐进入人们的视野，许多原有的珍稀品种逐渐被驯化，如竹荪、茶薪菇、离褶伞、羊肚菌等。但是也有大批的野生食药用菌由于未能被人类认识，没有得到研究。据研究，目前世界上约有300多万种真菌物种，仅仅有1％的物种被认识，其中已知的大型真菌约14000种，国内已确认的食用菌有1789种，药用菌798种，而当中又只有不到100种的野生食药用菌被人类驯化，规模化栽培的品种更只有30多种。人类距离大型真菌的研究与利用还有相当长的道路要走。
随着人们生活水平的逐步上升，对于生活品质的要求更高，而大型真菌由于其富含具有营养及功能作用的各种成分，包括真菌多糖、三萜类、甾醇等，对于人体健康具有非常良好的作用，日益受到人们的重视。
灵芝(Ganoderma)在中国有悠久的药用历史，长期被人们用于气管炎、肝炎、高血压、肿瘤、免疫力紊乱等病症的辅助治疗。现代的药理和临床研究结果也表明，灵芝含有抑制肿瘤和调节免疫的活性成分，但是其在这方面并没有得到现实的应用。自DONK(1948)建立灵芝科(Ganodermataceae)以来，目前全世界已报道的灵芝科大型真菌共200余种，我国有记载的灵芝有103种，其中14种已被人们所利用。
目前，在国内应用广泛的品种包括赤芝(Ganoderma lucidum)，紫芝(Ganodermasinense)等，灵芝属的许多其它种类也具有类似的效果，值得进一步研究。据国家食品药品监督管理总局(CFDA)网站统计，截至2017年3月，国内注册上市的灵芝保健品为669种，以胶囊、片剂、粉剂、袋泡茶为主，主要成分仍然以灵芝多糖、三萜为主。
发明内容
针对以上不足，本发明提供一种野生的珍稀药用菌品种红褐灵芝Ganodermambrekobenum新菌种及其人工驯化的栽培方法和应用。
本发明通过以下方案达到上述目的：
第一方面，本发明的红褐灵芝新菌种采自坦桑尼亚，经鉴定为红褐灵芝新菌种，并且组织分离获得原始菌株，命名为红褐灵芝(Ganoderma mbrekobenum)HMGIM-I160003，于2019年2月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山)，保藏编号为CCTCC NO:M 2019092。
第二方面，本发明提供一种红褐灵芝新菌种CCTCC NO:M 2019092的栽培方法，包括组织分离菌种后制作母种，制作生产母种，制作生产种，栽培培养及出菇管理，以重量百分比计，所述栽培料包括38％棉籽壳、50％木屑、10％麸皮、和2％CaCO3，所述栽培料的水分为60％-65％。
在第三方面，本发明提供一种红褐灵芝新菌种CCTCC NO:M 2019092或其提取物的应用，用于治疗或预防肿瘤。
在第四方面，本发明提供一种红褐灵芝新菌种CCTCC NO:M 2019092或其提取物的应用，用于制备治疗或预防肿瘤的药物。
在第五方面，本发明提供一种治疗或预防肿瘤的药物，包括红褐灵芝新菌种CCTCCNO:M 2019092或其提取物和载体。
综上所述，本发明提供一种新的红褐灵芝菌种及其人工栽培方法，驯化后外观均一产量高，平均菇袋产量达到50克，头潮生物转化率在15％及以上，并且其体外抑制肿瘤效果明显，具有实用性及开发前景。
附图说明
图1是实施例1的野外的红褐灵芝菌种CCTCC NO:M 2019092图。
图2为实施例1的扩增的ITS序列。
图3是实施例2的人工驯化的灵芝子实体图。
图4是实施例2的人工驯化的灵芝子实体图。
图5是实施例2的人工驯化的灵芝子实体的显微结构图。
图6是实施例2的人工驯化的灵芝子实体的显微结构图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
第一方面，本发明的红褐灵芝新菌种采自坦桑尼亚，经鉴定为红褐灵芝新菌种，并且组织分离获得原始菌株，命名为红褐灵芝(Ganoderma mbrekobenum)HMGIM-I160003，于2019年2月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山)，保藏编号为CCTCC NO:M 2019092。
目前，该新菌种在国内尚没有记载，国际上的研究者也并没有获得其菌种。
2016年4月汪路生在坦桑尼亚首都附近的Rudewa Ward，Kilosa District，Morogoro Region采集到一份灵芝标本(坐标：南纬6°37’28”，东经37°9’1”)，经广东省微生物研究所食用菌研究发展中心科研人员进行组织分离法得到其PDA纯培养物，通过ITS测序比对，发现与anoderma mbrekobenum相似性高达99％，结合形态学鉴定，该真菌标本宏观特征和显微特征与Ganoderma mbrekobenum描述一致，鉴定结果为Ganoderma mbrekobenum。
红褐灵芝新菌种CCTCC NO:M 2019092的性状如下：
红褐灵芝Ganoderma mbrekobenum属灵芝科，灵芝属，担子果每年生，伞形具柄，菌盖平展，干时木质或软木质。菌肉结构均匀，菌盖在干燥时呈现褐红色至肝棕色。表面坚硬，光滑，边缘钝圆，厚，干燥时呈现褐红色至肝棕色。菌柄直径大于5cm，侧生，柱状，具一单柱，红褐色，边缘增厚。菌孔面光滑，干燥时呈乳白色至黄褐色，菌孔每毫米4-6个，圆形至不规则或稍细长，
Figure BDA0002023298500000031
(av:
Figure BDA0002023298500000032
SD32，26；n＝100)，菌髓44-152μm(av:83.6μm；SD 23；n＝100)；菌管长0.1-0.7mm，深褐色。二系的菌丝系统，生殖菌丝不显著，分枝，薄壁和透明；骨架菌丝最普遍在担子果，偶尔分枝，淡至深褐色，粗2.5-7μm，尖端逐渐变细。担子未观察到，担孢子棕色，卵形到近椭圆形，顶端平截，双层壁，内壁有小刺，
Figure BDA0002023298500000033
(av.
Figure BDA0002023298500000034
SD 0.7，0.4；n＝100)，孢子壁薄，光滑；具有中等厚度的外壁，内生孢子厚，深棕色。
第二方面，本发明提供一种红褐灵芝新菌种CCTCC NO:M 2019092的栽培方法，包括组织分离菌种后制作母种，制作生产母种，制作生产种，栽培培养及出菇管理，以重量百分比计，所述栽培料包括38-40％棉籽壳、48-50％木屑、8-10％麸皮、和1-2％CaCO3，所述栽培料的水分为60％-65％。
优选的，以重量百分比计，所述栽培料包括38％棉籽壳、50％木屑、10％麸皮、和2％CaCO3。
优选的，所述栽培管理包括：将生产种转接至栽培料中，25℃恒温、遮光培养，湿度50％-60％，菌丝生长过程中注意换气，保持二氧化碳浓度4000ppm以下，菌丝长满菌袋进入成熟期，继续置于25℃遮光处，进行出菇管理。
优选的，所述出菇管理包括：控制温度在26℃-28℃之间，加大通风量，将菌袋盖子去掉，空气相对湿度调整至90％以上，经5-7天，菌丝开始扭结并形成淡黄色原基，保持相对湿度，控制在空间温度26℃-28℃之间，空气相对湿度在80％-90％，加大通风量，使CO2浓度保持在350～1500ppm，每天漫射光9小时，子实体成熟，白边消失，采摘。
优选的，所述组织分离菌种包括：采集回来的野生簇生沿丝伞子实体在无菌条件下酒精擦拭表面后，撕开，以无菌操作方式接入0.2-0.5mm×0.2-0.5mm的内部菌肉组织，置于25℃中恒温暗培养，待菌丝长满斜面后得到分离的菌种。
优选的，所述组织分离培养基为综合PDA培养基。
进一步优选的，以重量百分比计，所述综合PDA培养基包括马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％、维生素B1微量。
优选的，所述制作母种包括：将分离的菌种转接至母种培养基，置于25℃恒温暗培养，待菌丝生长而细菌尚未生长时进行尖端菌丝的挑取，得到母种。
优选的，所述母种培养基为孟加拉红培养基。
进一步优选的，以重量百分比计，所述孟加拉红培养基包括：蛋白胨0.5％、葡萄糖1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05％、琼脂2％、1/3000孟加拉红溶液10％、氯霉素0.01％，其余为水。
优选的，所述制作生产母种包括：将母种转接至生产母种培养基，置于25℃恒温暗培养，待菌丝长满斜面得到生产母种。
优选的，所述生产母种培养基为加富综合PDA。
进一步优选的，以重量百分比计，所述加富综合PDA包括：马铃薯20％、葡萄糖2％、蛋白胨1％、琼脂2％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％、维生素B1微量，其余为水。
优选的，所述制作生产种包括：向生产种培养基中无菌接入生产母种，接种时确保生产母种料块埋入原种料中，置于25℃恒温暗培养，待菌丝吃满料后得到生产种。
优选的，以重量百分比计，所述生产种培养基包括：98-99％高粱和1-2％碳酸钙。
本发明的新菌种为一种木腐菌，因此采用以纤维素含量比较丰富的木屑、棉籽壳为主料，含氮量较低，出菇效果较好，该品种经驯化后，外观均一，而且产量高。
在第三方面，本发明提供一种红褐灵芝新菌种CCTCC NO:M 2019092或其提取物的应用，用于治疗或预防肿瘤。
优选的，所述提取物为红褐灵芝新菌种CCTCC NO:M 2019092子实体的乙酸乙酯提取物。
进一步优选的，所述红褐灵芝新菌种CCTCC NO:M 2019092子实体的乙酸乙酯提取物为100μg/ml的提取物。
优选的，所述的肿瘤包括肿瘤细胞肝肿瘤、脑肿瘤、乳腺肿瘤。
在第四方面，本发明提供一种红褐灵芝新菌种CCTCC NO:M 2019092或其提取物的应用，用于制备治疗或预防肿瘤的药物。
优选的，所述提取物为红褐灵芝新菌种CCTCC NO:M 2019092子实体的乙酸乙酯提取物。
进一步优选的，所述红褐灵芝新菌种CCTCC NO:M 2019092子实体的乙酸乙酯提取物为100μg/ml的提取物。
优选的，所述的肿瘤包括肿瘤细胞肝肿瘤、脑肿瘤、乳腺肿瘤。
在第五方面，一种治疗或预防肿瘤的药物，包括红褐灵芝新菌种CCTCC NO:M2019092或其提取物和载体。
优选的，所述提取物为红褐灵芝新菌种CCTCC NO:M 2019092子实体的乙酸乙酯提取物。
进一步优选的，所述红褐灵芝新菌种CCTCC NO:M 2019092子实体的乙酸乙酯提取物为100μg/ml的提取物。
优选的，所述的肿瘤包括肝肿瘤、脑肿瘤、乳腺肿瘤。
所述载体为任何可药用的载体或填充剂等。
实施例1：
红褐灵芝Ganoderma mbrekobenum
2016年4月汪路生在坦桑尼亚首都附近的Rudewa Ward，Kilosa District，Morogoro Region采集到一份灵芝标本(坐标：南纬6°37’28”，东经37°9’1”)，如图1所示。经广东省微生物研究所食用菌研究发展中心科研人员进行组织分离法得到其PDA纯培养物，通过液体培养收集菌丝，低温(40℃)烘干，使用液氮研磨，利用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒，进行DNA基因组的提取，得到的DNA溶液-20℃冷藏备用。通过真菌核糖体基因间隔区通用引物ITS1/ITS4(ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)进行材料的ITS-PCR实验，扩增在Biometra PCR仪上进行，PCR反应液组成(共50μl)为：
Figure BDA0002023298500000051
反应条件为：94℃反应5min；94℃反应1min，55℃反应1min，72℃反应1min，30个循环；72℃反应10min.PCR产物直接送检进行双向测序，由华大基因完成。其ITS序列为图2。
测序结果在GenBank进行序列Blast，发现与anoderma mbrekobenum相似性高达99％，结合形态学鉴定，该真菌标本宏观特征和显微特征与Ganoderma mbrekobenum描述一致，鉴定结果为Ganoderma mbrekobenum。该菌种I160003于2019年2月保藏于中国典型培养物保藏中心(中国武汉)，保藏编号为CCTCC NO:M 2019092。
实施例2
一、培养基(以重量百分比计)：
1、组织分离培养基(综合PDA)：
马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％、维生素B1微量，其余为水。
2、母种培养基(孟加拉红培养基)：
蛋白胨0.5％、葡萄糖1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05％、琼脂2％、1/3000孟加拉红溶液10％、氯霉素0.01％，其余为水。
3、生产母种培养基(加富综合PDA)：
马铃薯20％、葡萄糖2％、蛋白胨1％、琼脂2％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％、维生素B1微量，其余为水。
4、生产种培养基：
98-99％高粱、1-2％碳酸钙。
5、栽培料：
38％棉籽壳、50％木屑、10％麸皮、2％CaCO3，栽培料的水分60％-65％、pH自然。
二、方法：
1、组织分离菌种：
制作组织分离培养基，分装试管，在0.11MPa大气压、121℃高温高压湿热灭菌30min，取出冷却摆成斜面。采集回来的野生簇生沿丝伞子实体在无菌条件下用75％酒精擦拭表面后，撕开，以无菌操作方式接入0.2-0.5mm×0.2-0.5mm的内部菌肉组织。置于25℃培养箱中恒温暗培养，待菌丝长满斜面后后得到分离的菌种则可进行转接，其长满的时间大概在10天-15天之间。
2、制作母种：
按配方制作母种培养基，分装试管，在0.11MPa大气压、121℃高温高压湿热灭菌30min，对于分离的菌种进行转接。置于25℃培养箱中恒温暗培养，待菌丝生长而细菌尚未生长时进行尖端菌丝的挑取与转接，得到母种。
3、制作生产母种：
制作生产母种培养基，分装试管，在0.11MPa大气压、121℃高温高压湿热灭菌30min，取出冷却无菌操作接入母种。置于25℃培养箱中恒温暗培养，待菌丝长满斜面后后得到生产母种则可进行转接。生产母种长满的时间大概在15天-20天之间。
4、制作生产种
称取所需比例的高粱，经水泡湿过夜，按比例混入碳酸钙，装入250ml锥形瓶中，折合每瓶装干料100-150g，得到生产种培养基。以硅胶塞封口。在0.147MPa大气压、128℃高温高压湿热灭菌90min，取出冷却后将培养基抖散后无菌操作接入生产母种。接种时确保生产母种料块埋入生产种料中。置于25℃培养箱中恒温暗培养，待菌丝吃满料后(20天左右)则可作为生产种使用接入栽培袋中。
5、栽培培养
称人工驯化的栽培料所需比例的培养料，充分混合并加水(含水量为55-65％)，装入17cm×35cm耐高温的透明聚丙烯菌种袋。折合每袋装干料400-420g。装好料后用小木棒在袋料中打洞，洞深至袋底，然后在袋口套上塑料环，扣上配套的盖子，即得一个制好的栽培料袋。在0.147MPa大气压、128℃高温高压湿热灭菌90min，取出冷却后无菌操作接入生产种。接种时确保种料块埋入栽培料中。接种后在25℃±1℃、空气相对湿度60-70％的培养室中避光培养。待菌丝吃满料后(18天左右)则可进入后熟管理，待栽培料袋中的菌丝长满袋中栽培料后，继续遮光后熟培养20天，就可以进入出菇管理阶段。
6、出菇管理(包括原基形成、子实体生长)
控制温度在26-28℃，并加大通风量，保持空间二氧化碳含量在1％以下，空气相对湿度调整至90％以上，经5-7天后，去除菌盖，把栽培袋竖排放置(袋与袋之间应留有空隙)，此时菌丝开始扭结并形成淡黄色米柆状原基。
原基生长至0.5cm后，继续控制温度在26-28℃，空气相对湿度85-90％之间，每天光照9小时，光照强度300-500lx，并保持空气中二氧化碳浓度350～1500ppm，保持空气湿润。经40天左右，灵芝完全成熟，喷粉结束。在此期间，每天向幼菇喷施水雾1-2次，直至子实体大小基本不变，白边消失，说明子实体已趋成熟，此时采收。从长出原基到子实体成熟约经过40天。结果如图3和图4所示。
三、出菇情况
1、出菇期：该品种出菇期为88天，头潮菇出菇期40天。
2、产量：每个菇袋每潮出菇44.68-53.15克，平均袋产量为49.27克，头潮生物转化率在14.08％左右。
3、子实体性状：子实体呈扇形或如意形，呈土褐色。对其进行显微镜观察，结果如图5和图6所示。
与野生状态相比，该品种在人工驯化后子实体个体均一，外形圆整，产量较高。
实施例3成分分析
对实施例2栽培的红褐灵芝新菌种CCTCC NO:M 2019092子实体进行灵芝粗多糖和灵芝三萜检测。其中总三萜采用了齐墩果酸法，当中的灵芝酸A采用了高效液相法进行了测定。
一、灵芝粗多糖的检测
粗多糖的提取按照NY/T1676-2008食用菌中粗多糖含量的测定方法进行。方法如下：
1、葡萄糖标准曲线的制作
精确称取105℃干燥恒重的标准葡萄糖50mg，置500ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度。吸取葡萄糖标准溶液0.00ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml，分置于具塞比色管中，各加蒸馏水至体积为1.0ml，再加5％苯酚试液1.5ml，摇匀，迅速滴加浓硫酸7.0ml，摇匀后放置30min，然后用去离子水定容至10ml，冷却后再488nm波长条件下，以试剂空白调零，分别测定A488nm值。按浓度与吸光值得比绘制葡萄糖标准曲线。
2、样品中多糖的提取
精确称取0.5-1g左右粉碎过20mm孔径筛的样品(红褐灵芝新菌种CCTCC NO:M2019092子实体)，加入10ml蒸馏水，摇匀后沸水浴2小时，冷却后加水至10ml，4000r/min离心15min后去上清液，沉淀物加水溶解，在沸水中水浴1小时，4000r/min离心15min。同样去上清液，沉淀物再加水5ml洗涤，4000r/min离心15min，三次上清液混合定容至25ml，准确量取1.0ml加入无水乙醇5ml，震荡均匀后沉淀过夜，4000r/min离心15min，弃去上清液，取沉淀物再加无水乙醇5ml，反复操作二次，沉淀物用去离子水溶解定容至10ml(也可视沉淀物的量而定)。
3、样品测定
吸取1ml溶解液于10ml比色管，加苯酚1.5ml、浓硫酸7.0ml摇匀后反应半小时，然后定容至10ml，冷却后在488nm波长条件下，以试剂空白调零，分别测定A488nm值。与葡萄糖标样作对照，求出总多糖含量。
4、计算
Figure BDA0002023298500000091
C——从标准曲线上查得样品比色液中葡萄糖的质量，mg
n——为稀释倍数
W——样品重量
计算得出，红褐灵芝新菌种CCTCC NO:M 2019092子实体的粗多糖含量为1.12％。。该含量高于普通灵芝样品的平均值。
二、灵芝三萜的测定(齐墩果酸法)
按《保健食品功效成分与标志性成分》，中国医药科技出版社，2007年，第十二章(三)方法，测定步骤如下：
1、齐墩果酸标准液的制备
精密称取10mg齐墩果酸，以无水乙醇为溶剂，配制成50ml浓度为0.2mg/ml的齐墩果酸乙醇溶液。
2、香草醛-冰醋酸溶液的制备
精密快速称取香草醛0.552g.迅速用适量冰醋酸溶解并马上倒入10ml的容量瓶中，迅速用冰醋酸稀释至刻度，以备当日之用。
3、标准曲线的绘制
精密吸取齐墩果酸标准液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8ml分别置于具塞试管中，加热挥去溶剂，再加入0.4ml新制的5％香草醛-冰醋酸液及1.6ml高氯酸，在70飞恒温水浴中加热15min,流水冷却至室温，再加人4ml醋酸乙酯稀释，摇匀，在560nm处测定。
4、样品的提取
取样品粉末(红褐灵芝新菌种CCTCC NO:M 2019092子实体)20g(过10目筛)，第一次加入75％乙醇溶液300ml(1:15，重量/体积)在80℃恒温水浴中回流2h，过滤。第二次加人75％乙醇溶液200ml(I：10，重量/体积)在80℃恒温水浴中回流1.5h，集两次总滤液。
5、待测样品的配制
准确取上述0.5ml滤液，用3ml无水乙醇稀释，配制成待测样。
6、样品测定
准确取上述0.3ml待测样液，加热挥去溶液，再加人0.4ml新制的5％香草醛－冰醋酸液及1.6ml高氯酸，在70℃恒混水浴中加热15mm，流水冷却至室温，再加人4ml醋酸乙酯稀释，摇匀，在560nm处测定其中试剂空白以蒸馏水为参比液，根据标样标准曲线计算齐墩果酸含量。
经计算，红褐灵芝新菌种CCTCC NO:M 2019092子实体所含总三萜含量为1.0％。该含量高于普通灵芝样品的平均值。
三、灵芝酸A的测定
灵芝子实体样品(红褐灵芝新菌种CCTCC NO:M 2019092子实体)粉碎后过40目筛，精密称定样品2.000g(因为灵芝纤维较多，无法全部过筛，因此粗纤维和细粉各称取1.000g)。加入75ml无水乙醇，加热回流45min(电热套旋钮扭至中间位置，乙醇容易爆沸，注意冷凝管口有否乙醇挥发)。放冷后过滤，用10mL无水乙醇洗涤滤渣后过滤，合并滤液，共洗涤2次。60℃水浴，采用真空旋转蒸发仪乙醇，将浓缩液定容至25mL容量瓶。吸取3mL溶液，用0.22μm针头式过滤器过滤，弃去最初1.5mL滤液，剩余滤液装于液相小瓶。其余提取液装在15ml离心管，保存在4℃。
按HPLC(JY/T024-1996)进行灵芝酸A检测，灵芝酸A标准品来自成都普思生物科技公司，检测结果计算得到：红褐灵芝Ganoderma mbrekobenum子实体灵芝酸A含量为0.0003％，普通灵芝的灵芝酸A含量通常在0.02％以上。可见该品种的灵芝酸A含量极低。
实施例4抑制肿瘤细胞功能
1、乙酸乙酯提取物的制备
实施例2栽培获得的红褐灵芝新菌种CCTCC NO:M 2019092子实体，粉碎后用乙酸乙酯浸泡，10小时后超声提取，超声100min，提取二次，合并二次有机相。将收集好的有机相进行抽滤后，将抽滤得到的液体用旋转蒸发仪旋蒸至无液滴状态，低温保藏(4℃)备用。同时与其他野生食药用菌大米培养基(25℃，暗培养45天)用相同提取方法提取的有机相进行平行实验对比。
2、肿瘤细胞培养
用含青霉素、链霉素和10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养液进行肿瘤细胞HepG2(人肝癌)、U87(人脑癌)和MB231(人乳腺癌)培养。将含有10％FBS的DMEM细胞悬液接种于96孔组织培养板上，细胞浓度为2×104cells/ml。培养物置于37℃、5％CO2的组织培养箱中培养4小时待用。
3、抑制肿瘤细胞实验
(1)样品配制
将乙酸乙酯提取物用DMSO溶解，配制成浓度为50mg/ml的母液，过滤后用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养液将母液分别稀释为8、15、31、63、125ug/ml的样品溶液。另外配制浓度为100μg/ml的样品溶液。
(2)加样
小心吸去96孔板里的细胞培养液，加入终浓度分别为8、15、31、63、125μg/ml及100μg/ml的样品溶液。每样品三个复孔。同时设置调零孔(培养基)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液)。
(3)培养
置于37℃、5％CO2组织培养箱中培养44小时。
(4)抑肿瘤细胞能力测定
培养44小时后，采用MTT法对肿瘤细胞凋亡进行检测，每孔加入10μl MTT液(5mg/ml，溶剂为PBS)，继续在37℃、5％CO2组织培养箱中培养4小时，吸去孔内液体，每孔加入150μl DMSO，用紫外分光光度计在OD490nm下振荡测定吸光值。样品重复三次实验。
(5)数据分析
使用SPSS.21专用统计软件进行统计，采用配对t检验，P<0.05具有显著性差异。
4、实验结果
采用SPSS.21专用统计软件进行统计，对HepG2的抑制率结果如表1所示。
表1：各样品提取物对HepG2的抑制率
Figure BDA0002023298500000111
Figure BDA0002023298500000121
从表1的结果可以看出，在100μg/ml浓度下，红褐灵芝乙酸乙酯提取物对HepG2和U87的抑制率分别为97.4％。此外，红褐灵芝乙酸乙酯提取物对U87的抑制率为95.5％，抑制HepG2、U87和MB231的IC50分别为84.9ug/ml，56.5及98.2ug/ml。这表明，本发明的红褐灵芝新菌种CCTCC NO:M 2019092具有强烈的体外抑制肿瘤细胞作用。同时开展的对照实验中，其他大多数野生菌的提取物均没有抑制肿瘤细胞的效果或者不够强烈的效果。
从上述结果可知，本发明的红褐灵芝新菌种CCTCC NO:M 2019092具有体外抑制肿瘤效果明显，是一个具有开发前景的菌种。
以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种红褐灵芝（Ganoderma mbrekobenum）HMGIM-I160003，其特征在于，保藏编号为CCTCC NO: M 2019092。
2.一种如权利要求1所述的红褐灵芝HMGIM-I160003的栽培方法，其特征在于，包括组织分离菌种后制作母种，制作生产母种，制作生产种，栽培培养及出菇管理，以重量百分比计，栽培料包括38-40%棉籽壳、48-50%木屑、8-10%麸皮、和1-2% CaCO3，所述栽培料的水分为60%-65%。
3.根据权利要求2所述的栽培方法，其特征在于，以重量百分比计，所述栽培料包括38%棉籽壳、50%木屑、10%麸皮、和2% CaCO3。
4.根据权利要求2所述的栽培方法，其特征在于，所述栽培培养包括：将生产种转接至栽培料中，25℃恒温、遮光培养，湿度50%-60%，菌丝生长过程中注意换气，保持二氧化碳浓度4000ppm以下，菌丝长满菌袋进入成熟期，继续置于25℃遮光处，进行出菇管理。
5.根据权利要求2或4所述的栽培方法，其特征在于，所述出菇管理包括：控制温度在26℃-28℃之间，加大通风量，将菌袋盖子去掉，空气相对湿度调整至90%以上，经5-7天，菌丝开始扭结并形成淡黄色原基，保持相对湿度，控制在空间温度26℃-28℃之间，空气相对湿度在80%-90%，加大通风量，使CO2浓度保持在350~1500ppm，每天漫射光9小时，子实体成熟，白边消失，采摘。
6.根据权利要求2所述的栽培方法，其特征在于，所述组织分离菌种包括：采集回来的野生簇生沿丝伞子实体在无菌条件下酒精擦拭表面后，撕开，以无菌操作方式接入0.2-0.5mm×0.2-0.5 mm的内部菌肉组织，置于25℃中恒温暗培养，待菌丝长满斜面后得到分离的菌种；或
所述制作母种包括：将分离的菌种转接至母种培养基，置于25℃恒温暗培养，待菌丝生长而细菌尚未生长时进行尖端菌丝的挑取，得到母种；或
所述制作生产母种包括：将母种转接至生产母种培养基，置于25℃恒温暗培养，待菌丝长满斜面得到生产母种；或
所述制作生产种包括：向生产种培养基中无菌接入生产母种，接种时确保生产母种料块埋入原种料中，置于25℃恒温暗培养，待菌丝吃满料后得到生产种。
7.根据权利要求6所述的栽培方法，其特征在于，组织分离的培养基为综合PDA培养基；或，所述母种培养基为孟加拉红培养基；或，所述生产母种培养基为加富综合PDA；或，以重量百分比计，所述生产种培养基包括：98-99%高粱和1-2%碳酸钙。
8.权利要求1所述的红褐灵芝HMGIM-I160003的应用，其特征在于，用于制备治疗肝肿瘤、脑肿瘤、乳腺肿瘤的药物。
9.权利要求1所述的红褐灵芝HMGIM-I160003的提取物的应用，其特征在于，用于制备治疗肝肿瘤、脑肿瘤、乳腺肿瘤的药物；所述提取物的制备方法为：获得红褐灵芝HMGIM-I160003子实体，粉碎后用乙酸乙酯浸泡，10小时后超声提取，超声100min，提取二次，合并二次有机相，将收集好的有机相进行抽滤后，将抽滤得到的液体用旋转蒸发仪旋蒸至无液滴状态，即得所述提取物。
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