CN112574893A - 鲍氏桑黄孔菌、其发酵产物的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了鲍氏桑黄孔菌、其发酵产物的制备方法及应用，所述鲍氏桑黄孔菌的分类命名为Sanghuangporus baumii HMGIM‑D150705,该菌种于2020年11月保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO:61307。本发明通过从野生资源中获得鲍氏桑黄孔菌菌株，经人工发酵后，对其发酵产物提取物进行分析，发现所述鲍氏桑黄孔菌的发酵产物提取物可显著抑制三阴性恶性乳腺癌细胞的增长，具有明显抑制癌细胞生长的效果。

Description

鲍氏桑黄孔菌、其发酵产物的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及食用菌领域，具体涉及鲍氏桑黄孔菌、其发酵产物的制备方法及发酵产物提取物的应用。
背景技术
食药用菌在我国成为粮、菜、果、油之后的第五大种植业，其具有营养成分均衡，并富含多种活性次级代谢产物，如多糖、萜类化合物、甾类化合物、生物碱等，在降血糖、降血脂、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫力等方面具有显著效果。还有一些食药用菌资源已被开发成化妆品、保健食品、药品等产品。在食药用菌产业蓬勃发展的今天，越来越多的珍稀食药用菌品种逐渐进入人们的视野，许多原有的珍稀品种逐渐被驯化，如竹荪、茶薪菇、离褶伞、羊肚菌等。但依然有数量巨大的野生食药用菌由于未能被人类认识，没有得到开发。据研究，目前世界上约有300多万种真菌物种，仅仅有1％的物种被认知，其中已知的大型真菌约14000种，国内已确认的食用菌有1789 种，药用真菌798种，而当中又只有不到100种的野生食药用菌被人类驯化，规模化栽培的品种更只有30多种。人类距离大型真菌的研究与利用还有相当长的道路要走。
鲍氏桑黄孔菌Sanghuangporus baumii，也被称作鲍氏针层孔菌 Phellinusbaumii、鲍姆纤孔菌Inonotus baumii，目前被归属于桑黄菌属，拉丁名为；Sanghuangporusbaumii(Pilát.)L.W.Zhou& Y.C.Dai。因鲍氏桑黄孔菌与其形态及其相似的裂蹄层孔菌、瓦宁木层孔菌、火木层孔菌、桑黄等均被统称为“桑黄”。2016年，基于形态观察和分子水平ITS、nlSUrDNA及mtDNA等数据的综合分析，鲍氏桑黄孔菌被归属为桑黄菌属。
“桑黄”是东亚及北欧地区传统药用大型真菌，主要活性成分为多糖、三萜类、蛋白质等。目前，野生“桑黄”资源极少，子实体为多年生，生长缓慢，并且已证实不同产地和不同菌株表现出成分含量和种类的差异，进而决定其生物活性存在较大差异，故在作为药材或食材使用时，难以保证产量及疗效。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明旨在提供鲍氏桑黄孔菌、其发酵产物的制备方法及发酵产物提取物的应用，通过从野生资源中获得所述鲍氏桑黄孔菌菌株，经人工发酵后，对其发酵产物提取物进行分析，发现所述鲍氏桑黄孔菌的发酵产物提取物可显著抑制三阴性恶性乳腺癌细胞的增长。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
鲍氏桑黄孔菌，其分类命名为Sanghuangporus baumii HMGIM-D 150705,该菌种于2020年11月23号保藏于广东省微生物菌种保藏中心(中国，广州)，保藏编号为GDMCC NO:61307。
本发明的鲍氏桑黄孔菌子实体多年生，无柄，木栓质。菌盖多马蹄形，外伸可达7cm，宽可达10cm，基部厚可达5cm；表面黑灰色近黑色，具同心环带和浅的沟纹，开裂；边缘钝，污褐色。孔口表面褐色至黑褐色，具折光反应；多角形，每毫米7-10个；边缘薄，全缘。不育边缘明显，黄褐色，宽可达5mm。菌肉褐色至污褐色，厚可达1cm。菌管分层明显，长可达3cm。担孢子3.3-4×3.3μm，宽椭圆形，浅黄色，厚壁，光滑，非淀粉质，不嗜蓝。春季至秋季多生于阔叶树的活力木或垂死木上，尤其是暴马丁香树上最为常见，造成木材白色腐朽。主要分布于东北和华北地区。可食用和药用，可栽培。
经ITS序列鉴定，发现其与鲍氏桑黄孔菌Sanghuangporus baumii 相似性高达100％，结合形态学鉴定，该真菌标本宏观特征和显微特征与鲍氏桑黄孔菌Sanghuangporusbaumii描述一致，鉴定结果为鲍氏桑黄孔菌Sanghuangporus baumii。
本发明第二方面提供如上所述的鲍氏桑黄孔菌的发酵产物提取物在制备抗癌细胞生长的药物中的应用。
优选的，所述发酵产物提取物为发酵产物的乙酸乙酯提取物。
优选的，所述癌细胞为三阴性恶性乳腺癌细胞。
本发明第三方面提供制备所述鲍氏桑黄孔菌的发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)菌株分离
将分离母种培养基中的各成分分装到第一试管中，将第一试管经 0.11MPa大气压、121℃高温湿热灭菌20-30min，冷却后摆成斜面；将鲍氏桑黄孔菌的子实体在无菌条件下用75％酒精擦拭表面后撕开，以无菌操作方式取0.2-0.5mm×0.2-0.5mm的内部菌肉组织接入第一试管中；接入后将第一试管置于25℃培养箱中恒温暗培养10-15d，待菌丝长满斜面后进行下一步转接；
(2)菌株纯化
将纯化母种培养基中的各成分分装到第二试管中，将第二试管经 0.11MPa大气压、121℃高温湿热灭菌20-30min，将经过分离后感染细菌的菌种转接到第二试管中，将第二试管置于25℃培养箱中恒温暗培养，待菌丝生长而细菌尚未生长时进行菌丝的挑取与下一步转接；
(3)固体发酵
采用菌种袋装入固体发酵培养基，在0.11MPa大气压、121℃高温湿热环境中灭菌20-30min，将固体发酵培养基取出冷却，以无菌操作的方式接入分离纯化成功的菌种；之后将固体发酵培养基置于 25℃培养箱中恒温暗培养，保持二氧化碳浓度为4000ppm以下、湿度为50-60％，培养时间为35-55d，优选45d。
优选的，按重量百分比计，所述分离母种培养基中各成分为：马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％、维生素B1 0.0008％-0.0012％、蚕蛹粉0.5％，余量为蒸馏水。
优选的，按重量百分比计，所述纯化母种培养基中各成分为：蛋白胨0.5％、葡萄糖1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、琼脂2％、 1/3000孟加拉红溶液10％、氯霉素0.01％，余量为蒸馏水。
优选的，所述固体发酵培养基中各成分为：大米50g、蒸馏水50mL。
优选的，所述菌种袋为聚丙烯菌种袋，其长度为15cm，宽度为 30cm，厚度为5丝米。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明通过从野生资源中获得鲍氏桑黄孔菌菌株，经人工发酵后，对其发酵产物提取物进行分析，发现所述鲍氏桑黄孔菌的发酵产物提取物可显著抑制三阴性恶性乳腺癌细胞的增长，具有明显抑制癌细胞生长的效果。
附图说明
图1为本发明鲍氏桑黄孔菌的野生子实体示意图；
图2为本发明不同浓度的鲍氏桑黄孔菌乙酸乙酯提取物对MDA-M B-231细胞生长影响的实验结果统计图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。在未作说明的情况下，本发明所采用的试剂、设备和方法均为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。
实施例1：
鲍氏桑黄孔菌的分离与鉴定
1.菌株分离
菌种来源：黑龙江五营。
分离母种培养基配方：
综合PDA培养基(马铃薯20％+葡萄糖2％+琼脂2％+磷酸二氢钾0. 3％+硫酸镁0.15％+维生素B1 0.0008％-0.0012％(微量))+0.5％蚕蛹粉，余量为蒸馏水。
将各营养成分及琼脂，分装到第一试管中，经0.11MPa大气压、 121℃高温湿热灭菌20-30min，冷却后摆成斜面。将采集回来的野生鲍氏桑黄孔菌子实体在无菌条件下用75％酒精擦拭表面后撕开，以无菌操作方式取0.2-0.5mm×0.2-0.5mm的内部菌肉组织接入第一试管中。将第一试管置于25℃培养箱中恒温暗培养，待菌丝长满斜面后进行下一步转接。母种长满斜面的时间大概为10-15d之间。
2.菌株纯化
纯化母种培养基配方：
孟加拉红培养基(蛋白胨0.5％+葡萄糖1％+磷酸二氢钾0.1％+硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05％+琼脂2％+1/3000孟加拉红溶液10％+氯霉素0. 01％，余量为蒸馏水)。
按配方制作纯化培养基，将培养基各成分分装到第二试管中，经 0.11MPa大气压、121℃高温湿热灭菌20-30min，将经过分离后感染细菌的菌种转接到第二试管中，将第二试管置于25℃培养箱中恒温暗培养，待菌丝生长而细菌尚未生长时进行尖端菌丝的挑取与下一步转接。
3.固体发酵
固体发酵培养基配方：大米50g，蒸馏水50mL。
采用5丝米厚的聚丙烯菌种袋(规格为15cm(长度)×30cm(宽度))按配方装入固体发酵培养基，经0.11MPa大气压、121℃高温湿热灭菌20-30min，取出冷却，将固体发酵培养基按无菌操作方式接入分离纯化成功的菌种。之后将固体发酵培养基置于25℃培养箱中恒温暗培养，控制湿度为50％-60％,菌丝生长过程中注意换气，保持二氧化碳浓度4000ppm以下，培养时间为35-55d，优选45d。
4.鉴定
将鲍氏桑黄孔菌(初步鉴定标本)经组织分离法得到其PDA纯培养物，通过液体培养收集菌丝，低温(40℃)烘干，使用液氮研磨，利用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒(商品编号SK8259，生工生物工程(上海)股份有限公司生产)进行DNA基因组的提取，得到的DNA溶液在-20℃环境中冷藏备用。通过真菌核糖体基因间隔区通用引物ITS1/ITS4(ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4:TCCTCCGCT TATTGATATGC，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)进行材料的ITS-PCR实验，扩增在Biometra PCR仪上进行，PCR反应液(共 50μl)组成为：
TaKaRaTaq(5units/μl)0.25μl；
10×PCRBuffer 5μl；
dNTPMixture(各2.5mM)4μl；
DNA模板2μl；
引物1(10μmol·L-1)5μl；
引物2(10μmol·L-1)5μl；
灭菌蒸馏水28.75μl。
以上所述的PCR反应液(商品编号R001A)由宝生物工程(大连) 有限公司生产。
反应条件为：94℃反应5min；94℃反应1min，55℃反应1min， 72℃反应1min，30个循环；72℃反应10min。PCR产物直接送检进行双向测序，该过程由华大基因完成。
其ITS序列为：
GGAAGGATCATTATCGAGTTTTGAAAGCGAGGCTTGCTGCTGGCGTGTAA TCTCGTGCGCATGTGCACGGCCTTCGCGCTCAAATCCAACTCAAACCCCT GTGCACCTTTATATATACCGCGAGTCGAAGTTAGTAATCTGAGGTTCTTG TAAGTAATCGGTAGGAAGGCGAAAGCGAGTCTTGCTCGTTAGGTAACCTT TCGAAAATGAAAGCGGGTGCGTCGGGTGAAGACTTCGGCTTGTTGTTATT ACAAACACCTTATATTGTCTTTGTGAATGTAATGCTCCTCGTGGGCGAAA AGAAATACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGA ACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCAT CGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCT GTTTGAGTGTCATGTTAATCTCAAACCGCTCGTCTTTCTTAATCGAAGGG CTTGCGGTTTGGACTTGGAGGGTTACTGCTGGCGCCTCTCGAGGGGTCGG CTCCTCTTAAATATATTAGCTGGGTTTTGGCTCGCGTTTACGGTGTAATA GTTGATTCCATTCACCAACGAGCGCTTGCCTGAAGGGCCTGCTTCTAGCC GTCCGCGTCGTCGGACAAGGAGTTTTATCTCCTTCTTGACACCTTTGACC TCAAATCAGGTAGGATTACCCGCTGAACTTAAGCATAT。
测序结果在GenBank进行序列Blast，发现与鲍氏桑黄孔菌San ghuangporusbaumii相似性高达100％，结合形态学鉴定，该真菌标本宏观特征和显微特征与鲍氏桑黄孔菌Sanghuangporus baumii描述一致，鉴定结果为鲍氏桑黄孔菌Sanghuangporus baumiiHMGIM-D 150705。该菌种HMGIM-D150705于2020年11月保藏于广东省微生物菌种保藏中心(中国，广州)，保藏编号为GDMCC NO:61307。
结合图1所示，本发明鲍氏桑黄孔菌Sanghuangporus baumii HMGIM-D150705子实体为多年生，无柄，木栓质。菌盖多马蹄形，外伸可达7cm，宽可达10cm，基部厚可达5cm；表面黑灰色近黑色，具同心环带和浅的沟纹，开裂；边缘钝，污褐色。孔口表面褐色至黑褐色，具折光反应；多角形，每毫米7-10个；边缘薄，全缘。不育边缘明显，黄褐色，宽可达5mm。菌肉褐色至污褐色，厚可达1cm。菌管分层明显，长可达3cm。担孢子3.3-4×3.3μm，呈宽椭圆形，浅黄色，厚壁，光滑，非淀粉质，不嗜蓝。春季至秋季多生于阔叶树的活力木或垂死木上，尤其是在暴马丁香树上最为常见，造成木材白色腐朽。多分布于东北和华北地区。可食用和药用，可栽培。
实施例2:
鲍氏桑黄孔菌抑制乳腺癌细胞生长的功能实验
一、不同菌株的乙酸乙酯提取物对抑制肿瘤生长效果的对比
(一)实验方法
1.菌株乙酸乙酯提取物样品的制备
将鲍氏桑黄孔菌菌株进行固体发酵，培养基为大米+水，培养45d 后菌丝长满大米培养基时，终止发酵，将发酵物保存，备用。
将上述鲍氏桑黄孔菌发酵物按照料液比1:10浸泡到乙酸乙酯溶剂中，浸泡过夜，超声提取100min，抽滤，获得滤液。提取二次，合并二次滤液。将滤液在减压条件下经旋转蒸发仪(温度不高于45℃) 蒸发干燥，低温保藏(4℃)，备用。同时按同样操作发酵木蹄层孔菌、桦剥管菌、火木层孔菌、玫瑰拟层孔菌、栗黑层孔菌、树舌灵芝、紫芝、假芝、药用拟层孔菌共9株，并进行提取，获得提取物，备用。
2.不同菌株提取物抑制肿瘤细胞增殖对比实验
用含1％青链霉素双抗和10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养液进行人源乳腺癌细胞MDA-MB-231培养。将对数生长期的细胞经消化、稀释至密度为1×105cells/ml，接种到24孔培养板，每孔0.5mL，将细胞板置于37℃、5％CO2的组织培养箱中培养。细胞培养4小时后，将上述提取物用DMSO(二甲基亚砜)进行溶解和配制，加入细胞板中，终浓度为100ug/mL和200ug/mL，对照孔为DMSO溶剂，每个样品3个复孔，重复三次。再次置于37℃、5％CO2组织培养箱中培养48 小时。
在培养过程中，倒置显微镜检测细胞形态的变化，并记录。培养结束后，收集细胞，与台盼蓝1：1混合进行拒染法染色。根据“死细胞被染成蓝色，活细胞因有完整的细胞膜而未着色”原理，用细胞计数器测定活细胞数，使用SPSS.21专用统计软件进行统计，采用配对t检验，P<0.05具有显著性差异，结果如下表1所示。
表1-十种药用菌菌株提取物抑制肿瘤的作用
Figure RE-GDA0002930898550000101
Figure RE-GDA0002930898550000111
3.不同鲍氏桑黄孔菌提取物浓度对抑制肿瘤细胞增殖效果的探究实验
细胞培养及培养条件同上述方法一致。设置样品处理终浓度为0、 25、50、75、100、150、200、250ug/mL，处理48小时后，收集细胞，计数和记录数据。数据使用SPSS.21专用统计软件进行统计，采用配对t检验，P<0.05具有显著性差异，结果如图2所示。
(二)实验结果分析
从上表1的实验数据分析结果可以看出，鲍氏桑黄孔菌、桦剥管菌、栗黑层孔菌及紫芝菌株的发酵产物提取物具有抑制乳腺癌细胞 MDA-MB-231增殖的作用；尤其在100μg/ml和200μg/ml浓度下，鲍氏桑黄孔菌对MDA-MB-231癌细胞的抑制效果最强，抑制率分别可达到65％和91％以上，并且在显微镜下观察看到细胞形态发生改变，细胞内出现大量空泡，最终诱导细胞死亡。紫芝和桦褐孔菌均为著名的常用药用菌，同等条件下的实验表明，其体外抑制乳腺癌细胞 MDA-MB-231的效果弱于鲍氏桑黄孔菌。
在上述研究基础上，设鲍氏桑黄孔菌HMGIM-D150705号菌株提取物样品浓度梯度检测对乳腺癌生长抑制的梯度依赖，结果显示：鲍氏桑黄孔菌发酵物乙酸乙酯提取物抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231生长成梯度依赖，IC50为78.23±4.86ug/mL，如图2所示。
2019年，Yang Y等报道鲍姆层孔菌提取物对肿瘤细胞进行活性评价，对恶性黑色素瘤的A375抑制效果最强，其IC50为176.2±7.6ug/ mL，而对乳腺癌细胞株MDA-MB-231的IC50为300.1±33.2ug/mL(Yang Y,He P,Li N.The Antitumor Potential of Extract ofthe Oak Bracket Medicinal Mushroom Sanghuangporusbaumii in SMMC- 7721TumorCells[J].Evidence-based Complementary and Altern ative Medicine,2019,2019:1-12.)。2015年，张林芳等报道了鲍姆层孔菌提取物对另外一种乳腺癌细胞MCF-7活性影响，结果显示在50 0ug/ml的剂量浓度下其抑制率低于50％(张林芳,孙婷婷,邹莉.鲍氏桑黄孔菌总三萜的提取及其体外抗乳腺癌细胞MCF-7活性[J].药物评价研究,2015(05):497-502)。与此相比，本发明的菌株固体发酵物的提取物的半数致死剂量为78.23±4.86ug/mL，其活性显著优异。
综上可知，本发明的鲍氏桑黄孔菌在抑制三阴性乳腺癌细胞生长方面具有显著的效果，在乳腺癌药物的开发方面具有开发潜力。
以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）
<120> 鲍氏桑黄孔菌、其发酵产物的制备方法及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 738
<212> DNA
<213> 鲍氏桑黄孔菌(Sanghuangporus baumii)
<400> 1
ggaaggatca ttatcgagtt ttgaaagcga ggcttgctgc tggcgtgtaa tctcgtgcgc 60
atgtgcacgg ccttcgcgct caaatccaac tcaaacccct gtgcaccttt atatataccg 120
cgagtcgaag ttagtaatct gaggttcttg taagtaatcg gtaggaaggc gaaagcgagt 180
cttgctcgtt aggtaacctt tcgaaaatga aagcgggtgc gtcgggtgaa gacttcggct 240
tgttgttatt acaaacacct tatattgtct ttgtgaatgt aatgctcctc gtgggcgaaa 300
agaaatacaa ctttcaacaa cggatctctt ggctctcgca tcgatgaaga acgcagcgaa 360
atgcgataag taatgtgaat tgcagaattc agtgaatcat cgaatctttg aacgcacctt 420
gcgccccttg gtattccgag gggcatgcct gtttgagtgt catgttaatc tcaaaccgct 480
cgtctttctt aatcgaaggg cttgcggttt ggacttggag ggttactgct ggcgcctctc 540
gaggggtcgg ctcctcttaa atatattagc tgggttttgg ctcgcgttta cggtgtaata 600
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tcggacaagg agttttatct ccttcttgac acctttgacc tcaaatcagg taggattacc 720
cgctgaactt aagcatat 738

Claims (9)

1.鲍氏桑黄孔菌,其特征在于,其分类命名为Sanghuangporus baumii HMGIM-D150705,保藏编号为GDMCC NO:61307。
2.如权利要求1所述的鲍氏桑黄孔菌的发酵产物提取物在制备抗癌细胞生长的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述发酵产物提取物为发酵产物的乙酸乙酯提取物。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述癌细胞为三阴性恶性乳腺癌细胞。
5.一种制备如权利要求2～4任一项所述鲍氏桑黄孔菌的发酵产物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)菌株分离
将分离母种培养基中的各成分分装到第一试管中，将第一试管经0.11MPa大气压、121℃高温湿热灭菌20-30min，冷却后摆成斜面；将鲍氏桑黄孔菌的子实体在无菌条件下用75％酒精擦拭表面后撕开，以无菌操作方式取0.2-0.5mm×0.2-0.5mm的内部菌肉组织接入第一试管中；接入后将第一试管置于25℃培养箱中恒温暗培养10-15d，待菌丝长满斜面后进行下一步转接；
(2)菌株纯化
将纯化母种培养基中的各成分分装到第二试管中，将第二试管经0.11MPa大气压、121℃高温湿热灭菌20-30min，将经过分离后感染细菌的菌种转接到第二试管中，将第二试管置于25℃培养箱中恒温暗培养，待菌丝生长而细菌尚未生长时进行菌丝的挑取与下一步转接；
(3)固体发酵
采用菌种袋装入固体发酵培养基，在0.11MPa大气压、121℃高温湿热环境中灭菌20-30min，将固体发酵培养基取出冷却，以无菌操作的方式接入分离纯化成功的菌种；之后将固体发酵培养基置于25℃培养箱中恒温暗培养，保持二氧化碳浓度为4000ppm以下、湿度为50-60％，培养时间为35-55d。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，按重量百分比计，所述分离母种培养基中各成分为：马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％、维生素B10.0008％-0.0012％、蚕蛹粉0.5％，余量为蒸馏水。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，按重量百分比计，所述纯化母种培养基中各成分为：蛋白胨0.5％、葡萄糖1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、琼脂2％、1/3000孟加拉红溶液10％、氯霉素0.01％，余量为蒸馏水。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述固体发酵培养基中各成分为：大米50g、蒸馏水50mL。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述菌种袋为聚丙烯菌种袋，其长度为15cm，宽度为30cm，厚度为5丝米。
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