KR20110115252A - 간기능개선, 혈청지질농도 개선, 혈압조절 및 아토피, 피부미백에 효과적인 기능성 생약 발효물 제조방법 및 그에 의한 생약 발효물 - Google Patents
간기능개선, 혈청지질농도 개선, 혈압조절 및 아토피, 피부미백에 효과적인 기능성 생약 발효물 제조방법 및 그에 의한 생약 발효물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 특정종균을 이용한 개량종국을 이용하여 기능성 생약 발효물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 특정 종균을 곡류에 배양한 개량종국을 이용하여 대두, 현미, 찹쌀현미, 백미, 율무, 수수 등의 곡류를 발효한 후 이 발효물에 비타민나무(Hippophae rhamnoides L.), 가시오가피, 당귀, 산수유, 감초, 박하, 오미자, 알로에, 계피, 상황버섯, 영지버섯, 표고버섯, 인삼, 쑥 등의 생약제제를 투입하여 발효한 발효물을 숙성 및 안정시켜 발효를 통해 생산된 고기능성 발효물을 제조하는 방법으로서 식품, 건강기능식품, 화장품 나아가 의약품으로 활용이 가능한 발효물을 제조하는 방법에 대한 것이다.
Description
본 발명은 기능성 생약 발효물 제조방법 및 그에 의한 생약 발효물에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 특허출원 10-2010-0034534에 개시된 개량종국을 이용하여 1차 곡류 발효액을 제조한 후, 가시오가피, 당귀, 산수유, 감초, 박하, 오미자, 알로에, 계피, 상황버섯, 영지버섯, 표고버섯, 인삼, 쑥 등의 생약제제, 각종 과일 또는 곡류 등 발효하기 어려웠던 원료들을 발효하여 2차 생약발효물을 제조하고, 최적의 발효공정을 이용하여 안정 및 숙성화시켜 생리활성도가 높은 기능성 생약 발효물을 제조하는 방법 및 화장품, 의약품, 기능성 식품 등에 활용 가능한 생약 발효물에 대한 것이다.
일반적으로 발효약재는 가열하지 않으므로 약성의 파괴를 최소화하고 약리성분의 분자구조를 소화흡수가 용이한 형태로 분해하여 체내 흡수력을 높이며 약물의 독성으로 인한 부작용을 중화해주고 약의 쓴맛을 보완해 주는 것으로 보고되고 있다.
그러나 위와 같은 발효약재의 장점에도 불구하고, 한약재에 유산균을 배양하여 발효약재를 제조하는 방법은 연구되고 있으나 곰팡이를 배양하여 제조한 방법은 아직 개발되고 있지 않다.
즉, 백국균이나 황국균, 홍국균 등의 곰팡이류를 이용한 발효약재는 없으며 더구나 곰팡이를 이용한 발효약재를 한방약, 식품, 화장품에 응용하여 약리효능과 기능성을 높이고 맛과 향을 부드럽게 보완한 제품은 개발되지 못하고 있는 실정이다.
특히, 각종 곡류와 과일, 야채, 약초 등 다양한 종류의 발효물을 발효시킬 수 있는 발효제를 개발하는데 한계가 있었으며, 종래의 누룩으로 발효물을 제조하면 발효시간이 길어 발효공정을 운영하는 비용의 증가와 원료의 낭비로 인한 경제적 손실이 큰 문제가 있었다.
본 발명은 상기의 문제점을 해소하기 위하여 발명된 것으로, 종전에 발효하기 어려웠던 어떤 재료이든지 효율적으로 발효시킬 수 있으며, 잡균의 오염이 없어 곰팡이독소에 의한 식중독을 예방할 수 있고, 정해진 종균과 정해진 방법으로 품질이 균일한 발효물을 생산할 수 있는 개량 종국을 이용하여, 약성의 파괴를 최소화하고 약리성분의 분자구조를 소화흡수가 용이한 형태로 분해하여 체내 흡수력을 높이며 약물의 독성으로 인한 부작용을 중화해주고 약의 쓴맛을 보완해 줄 수 있으며, 건강기능 식품, 화장품, 의약품으로 활용가능한 기능성 생약 발효물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 본 발명의 목적은, i) 주원료인 곡류에 부원료인 생약원료를 혼합한 곡물 배지에 황국균(Aspergillus), 백국균(Rhizopus), 홍국균(Monascus) 중 1종 또는 2종 이상을 혼합한 종균을 균일하게 접종하고 혼합한 후, 배양하여 개량 종국을 준비하는 제1단계, ii) 상기 개량 종국을 이용하여 곡류를 발효시킴으로써, 1차 곡류 발효액을 제조하는 제2단계, iii) 상기 1차 곡류 발효액에 생약제제, 과일, 곡류 등의 기능물질을 투입하여 2차 발효시키는 제3단계, 및 iv) 상기 2차 발효액을 숙성 및 안정화시켜 기능성을 배가시키는 단계를 포함하는 생약 발효물의 제조방법을 제공함으로써 달성된다.
이때, 상기 제1단계의 생약원료가 비타민나무(Hippophae rhamnoides L.), 가시오가피, 당귀, 산수유, 감초, 박하, 오미자, 알로에, 계피, 상황버섯, 영지버섯, 표고버섯, 인삼, 쑥 중 1종 또는 2종 이상을 혼합한 것일 수 있으며, 상기 곡물 배지를 이루는 곡류와 생약원료가 9:1의 중량비율로 혼합되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 곡물 배지에서 배양되는 종균은 Rhizopus microsporus var. oligosporus, Rhizopus oligosporus , Monascus ruber , Monascus purpureus , Aspergillus oryzae , Aspergillus sojae , Aspergillus kawachii 중 1종 또는 2종 이상을 혼합한 것이며, 상기 종균이 곡물 배지에 0.1 내지 1%의 비율로 접종되는 것이 바람직하다.
그리고, 상기 제1단계의 종균은 접종, 혼합된 곡물 배지를 30 내지 40℃의 온도, 50 내지 80%의 습도 조건에서 12 내지 36시간 배양시키는 것이 바람직하다.
또한, 상기 제2단계의 1차 곡류 발효액의 제조는 물에 중량대비 0.1 내지 1%의 개량종국과 쌀겨와 쌀과 같은 발효배지를 투입하여 20 내지 30℃의 온도를 유지하며 배양함으로써 제조되는 것이 바람직하며, 상기 배양은 기포기를 가동과 정지비율을 4:1로 하여 분당 100 내지 150리터가 되게 반복적으로 가동하여 이루어질 수 있다.
그리고, 상기 제3단계의 2차 발효는 곡류 발효를 마친 1차 곡류 발효액에 가시오가피, 당귀, 산수유, 감초, 박하, 오미자, 알로에, 계피, 상황버섯, 영지버섯, 표고버섯, 인삼, 쑥 등의 생약제제, 각종 과일 또는 곡류과 같은 기능물질을 단독으로 혹은 2종 이상의 복수로 투입하여 20 내지 30℃의 온도를 유지하며 10 내지 20일간 배양하여 이루어진다.
또한, 제4단계의 숙성 및 안정화 단계는 생약제제 발효를 마친 2차 발효액을 15 내지 18의 온도를 유지하며 계속 반복적으로 기포기를 가동과 정지비율을 4:1로 하여 이루어질 수 있다.
한편, 상기와 같은 본 발명의 목적은, 상기에서 설명한 제조방법에 의해서 제조되는 생약 발효물을 제공함으로써 달성된다.
본 발명에 따라 개량종국을 이용하여 발효하기 어려웠던 생약제제 등을 발효할 수 있는 공정의 제공으로 어떤 재료이든지 발효가 가능한 발효의 공정을 통하여 기능성이 뛰어난 발효물을 얻을 수 있었다.
상기의 방법으로 얻어진 발효물은 식품 혹은 건강기능식품으로 접목하여 섭취 시 간수치 개선, 혈압의 조절, 심혈관계 질환에 효과적이었으며, 호르몬 조절을 통한 유방암, 전립선암 등에 대한 항암효과, 많은 중년 여성에게 발생할 수 있는 골다공증의 예방, 노화방지 등에 탁월한 효과가 있는 발효물의 제공이 가능하다.
또한 화장품의 원료로 사용 시 노화방지, 멜라닌 색소의 침착을 막아 미백에도 효과가 있으며, 현대 사회에서 이슈가 되고 있는 아토피 등에 많은 효과가 있는 제품으로의 접목이 가능하다. 식품, 건강기능식품, 화장품은 물론 의약품의 소재로서도 활용이 가능한 안정한 발효산물이 제공된다.
도 1은 일반메주 발효군, 생약제제 첨가군, 개량종국 첨가군의 생균수 측정결과이다.
도 2는 일반발효물과 개량종국발효물의 숙성기간에 따른 ACE저해활성 실험결과이다.
도 3은 일반발효물과 개량종국발효물의 tyrosine저해활성 실험결과이다.
도 2는 일반발효물과 개량종국발효물의 숙성기간에 따른 ACE저해활성 실험결과이다.
도 3은 일반발효물과 개량종국발효물의 tyrosine저해활성 실험결과이다.
본원은 특허출원 10-2010-0034534에서 출원한 개량종국을 곡류배지에 접종하여 1차 곡류발효물을 얻고, 이를 이용하여 생약제제에서 2차 발효를 거쳐 2차 생약발효물을 제조하는 방법이 개시된다.
본 발명의 생약 발효물의 제조방법은, i) 주원료인 곡류에 부원료인 생약원료를 혼합한 곡물 배지에 황국균(Aspergillus), 백국균(Rhizopus), 홍국균(Monascus) 중 1종 또는 2종 이상을 혼합한 종균을 균일하게 접종하고 혼합한 후, 배양하여 개량 종국을 준비하는 제1단계, ii) 상기 개량 종국을 이용하여 곡류를 발효시킴으로써, 1차 곡류 발효액을 제조하는 제2단계, iii) 상기 1차 곡류 발효액에 생약제제, 과일, 곡류 등의 기능물질을 투입하여 2차 발효시키는 제3단계, 및 iv) 상기 2차 발효액을 숙성 및 안정화시켜 기능성을 배가시키는 제4단계를 포함한다.
이때, 상기 제1단계의 생약원료는 비타민나무(Hippophae rhamnoides L.), 가시오가피, 당귀, 산수유, 감초, 박하, 오미자, 알로에, 계피, 상황버섯, 영지버섯, 표고버섯, 인삼, 쑥 중 1종 또는 2종 이상을 혼합한 것일 수 있으며, 상기 곡물 배지를 이루는 곡류와 생약원료가 9:1의 중량비율로 혼합되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 곡물 배지에서 배양되는 종균은 Rhizopus microsporus var. oligosporus, Rhizopus oligosporus , Monascus ruber , Monascus purpureus , Aspergillus oryzae , Aspergillus sojae , Aspergillus kawachii 중 1종 또는 2종 이상을 혼합한 것이며, 상기 종균이 곡물 배지에 0.1 내지 1%의 비율로 접종되는 것이 바람직하고, 상기 종균이 접종, 혼합된 곡물 배지를 30 내지 40℃의 온도, 50 내지 80%의 습도 조건에서 12 내지 36시간 배양시키는 것이 바람직하다.
또한, 상기 제2단계의 1차 곡류 발효액의 제조는 물에 중량대비 0.1 내지 1%의 개량종국과 쌀겨와 쌀과 같은 발효배지를 투입하여 20 내지 30℃의 온도를 유지하며 배양함으로써 제조되는 것이 바람직하며, 상기 배양은 기포기를 가동과 정지비율을 4:1로 하여 분당 100 내지 150리터가 되게 반복적으로 가동하여 이루어질 수 있다.
그리고, 상기 제3단계의 2차 발효는 곡류 발효를 마친 1차 곡류 발효액에 가시오가피, 당귀, 산수유, 감초, 박하, 오미자, 알로에, 계피, 상황버섯, 영지버섯, 표고버섯, 인삼, 쑥 등의 생약제제, 각종 과일 또는 곡류과 같은 기능물질을 단독으로 혹은 2종 이상의 복수로 투입하여 20 내지 30℃의 온도를 유지하며 10 내지 20일간 배양하여 이루어진다.
또한, 제4단계의 숙성 및 안정화 단계는 생약제제 발효를 마친 2차 발효액을 15 내지 18℃의 온도를 유지하며 계속 반복적으로 기포기를 가동과 정지비율을 4:1로 하여 이루어질 수 있다.
상기 제조방법의 일 실시예를 구체적으로 살펴보면, 1.5톤짜리 발효조에 물 1,000리터를 넣고, 특허출원 10-2010-0034534에서 출원한 개량종국과 시중에서 유통 중인 메주를 각각 중량대비 0.1 내지 1%씩 투입하고, 발효배지로서 쌀겨 300g, 쌀 200g을 10 내지 20일 간 매일 같은 시간에 투입하여 20 내지 30℃의 온도를 유지하며 배양할 때 계속 반복적으로 기포기를 가동과 정지비율을 4:1로 하여 곡류를 1차 발효시킨다.
1차 발효를 마친 곡류발효액에 비타민나무(Hippophae rhamnoides L.), 가시오가피, 당귀, 산수유, 감초, 박하, 오미자, 알로에, 계피, 상황버섯, 영지버섯, 표고버섯, 인삼, 쑥 등의 생약제제, 각종 과일 또는 곡류 등의 기능물질을 물 100리터에 200g이 되게 단독으로 혹은 2종 이상의 복수로 투입하여 20 내지 30℃의 온도를 유지하며 10 내지 20일간 배양하여 2차 발효시킨다.
2차 발효를 마친 생약제제 발효액을 숙성 및 안정화키며 최종적으로 식품, 건강기능식품, 화장품, 의약품 등으로 이용가능한 생약 발효물을 얻게 된다.
이하에서는 상기에서 설명한 생약 발효물의 제조 및 활성 등을 확인하기 위한 단계별 실시방법을 살펴볼 것인바, 본 발명의 권리범위가 이들 실시 예에 한정되는 것이 아님은 당연하다.
실시예
1 :
곡류배지를
이용한 1차 곡류 발효
1.5톤짜리 발효조에 물 1,000리터를 넣고, 특허출원 10-2010-0034534에서 출원한 개량종국과 시중에서 유통 중인 메주를 각각 중량대비 0.1 내지 1% 씩을 투입하고, 발효배지로서 쌀겨 300g, 쌀 200g을 매일 같은 시간에 투입하여 20 내지 30℃의 온도를 유지하며 배양할 때 계속 반복적으로 기포기를 분당 100 내지 150리터가 되게 가동하여 가동과 정지비율을 4:1로 하여 곡류를 배지로 발효시켰다. 상기에 기술한 표 대로 종균의 종류를 여러 가지 경우로 하여 10 내지 20일간 1차 곡류발효를 실시하였다.
실시예
2 : 생약제제를 이용한 2차 생약제제발효
상기의 1차 곡류발효를 마친 곡류발효액을 침전시켜 부피대비 1차 곡류발효액의 70%에 해당하는 상등액을 2차 생약제제 발효조로 옮기고, 비타민나무(Hippophae rhamnoides L.), 가시오가피, 당귀, 산수유, 감초, 박하, 오미자, 알로에, 계피, 상황버섯, 영지버섯, 표고버섯, 인삼, 쑥 등의 생약제제나 각종 과일 또는 곡류 등의 기능성 원료를 물 100리터 당 각각 200g씩 되게 단독으로 혹은 2종 이상의 기능성 원료를 복수로 투입하여 20 내지 30℃의 온도를 유지하며 10 내지 20일간 배양하여 2차 생약제제발효를 실시하였다.
실시예
3 : 숙성 및 안정화
2차 생약제제발효액을 침전시켜 1차 곡류발효액의 부피대비 10%에 해당하는 침전물을 침전시킨 후 상등액을 숙성 및 안정화반응조로 옮기고, 15 내지 18℃의 온도를 유지하며 계속 반복적으로 기포기를 가동과 정지비율을 4:1로 하여 숙성시켜 안정화시켰다. 1차 곡류발효 및 2차 생약제제발효를 하는 과정에서 미생물의 번식으로 인하여 품온이 상승하여 반응조 내의 온도도 상승하였으나, 숙성 및 안정조의 온도를 발효에 적합한 온도보다 낮게 유지함으로써 미생물의 증식은 완만해지고 1차 곡류발효와 2차 생약제제발효로 생성된 발효물을 숙성시키고 안정화시켰다.
실시예
4 : 발효 중 변화에 대한 실험 - 저장성 측정
시중에서 유통 중인 일반 메주만을 사용하여 생약제제의 발효없이 곡류배지에 발효한 군을 대조군으로 하고 일반 메주만을 사용하여 상기의 실시예대로 실험한 군, 특허출원 10-2010-0034534에서 출원한 개량종국을 추가로 투입하여 상기의 실시예대로 실험한 군 등 3그룹으로 나누어 저장 중 생균수의 변화를 측정한 결과는 표 2와 같다.
생균수 측정 결과, 생균수가 실험군 별로 104-108 CFU/g 정도로 저장 기간 동안 차이를 보였으며, 일반 메주만을 투입하여 생약제제 발효를 거치지 않은 군은 생균수의 차이를 보이지 않았으나, 일반 메주만을 상기의 실시예대로 실시한 군과 특허출원 10-2010-0034534에서 출원한 개량종국을 추가로 투입하여 상기의 실시예대로 실험한 군은 생균수가 발효시간이 지속될수록 감소하는 현상을 보였다.
이처럼 생약제제 발효를 실시한 실험군에서 저장 후기에 이르러 생균수가 감소한 것은 생약제제의 항균 및 항진균 효과에 의한 것으로 사료된다. 일반적으로 발효물은 발효 후에도 미생물과 미생물이 생산한 효소가 최종 발효산물 속에 남아 있어 저장 중에 Mucor , Rhizopus , Aspergillus 등의 곰팡이와 Saccharomyces 등의 효모, 그리고 Micrococcus , Bacillus , Pseudomonas 등의 미생물이 발효물의 변화에 관여하는 것으로 알려져 있다. 본 실험결과를 고려할 때, 발효공정 진행 시 생약제제를 투입할 경우 발효물의 변화에 관여하는 미생물의 증식을 억제하여 발효물의 저장성을 향상시킬 수 있을 것으로 사료된다.
| 시험군 | 처리방법 | ||
| 1차 곡류발효 | 2차 생약제제발효 | 숙성 및 안정화 | |
| 일반메주 | O | X | X |
| 일반메주 | O | O | O |
| 일반메주+개량종국 | O | O | O |
| Treatment | Aging time (days) | |||||
| 10 | 15 | 20 | 25 | 30 | 35 | |
| Using normal seed malt (1st) | 8.73 | 8.52 | 8.46 | 8.31 | 8.27 | 8.06 |
| Using normal seed malt (2nd) | 7.92 | 7.50 | 7.11 | 6.78 | 6.62 | 6.14 |
| Using upgraded seed malt | 7.11 | 6.47 | 5.76 | 5.24 | 4.97 | 4.21 |
(Unit : log number(CFU/g))
실시예
5 :
발효물의
동물실험
1. 실험재료 및 실험동물과 식이의 준비
본 실시예에서 사용된 동물은 150g±5g, Sprague-Dawley계(♂)의 흰쥐를 분양받아 1마리씩 스테인레스 재질의 사육장(항온항습기, 온도 22±2℃, 습도 50±5%)에 넣어 사육하며 연구를 진행하였다. 총 연구기간은 6주이었는데, 일주일은 적응시기였고 실험식이는 5주간 섭취시켰다.
일주일간 적응시킨 흰쥐를 난괴법에 의해 나누어 각 군당 10마리씩 총 4군으로 분류하였다. 즉 기본식이군(Basal diet group, BDG), 고지방대조군(High-fat diet control group, FCG)과 고지방식이에 일반발효물 섭취군(High fat diet+Normal, FCG-N), 고지방식이에 개량종국발효물 섭취군(High fat diet+Upgraded seed malt, FCG-U)으로 나누었고, 실험식이는 표 3에 자세히 정리하였다.
| BDG | FCG | FCG-N | FCG-U | |
| Starch | 22.68 | 21.34 | 21.34 | 21.34 |
| Wheat-powder | 22.68 | 21.34 | 21.34 | 21.34 |
| Sucrose | 20.18 | 18.26 | 18.26 | 18.26 |
| Corn oil | 2.14 | 3.64 | 3.64 | 3.64 |
| Beef tallow | 4.28 | 10.94 | 10.94 | 10.94 |
| Casein | 20.18 | 16.62 | 16.62 | 16.62 |
| Cellulose | 4.60 | 4.60 | 4.60 | 4.60 |
| Mineral mixtrue | 1.41 | 1.41 | 1.41 | 1.41 |
| Vitamin mixture | 1.85 | 1.85 | 1.85 | 1.85 |
| Total | 100.00 | 100.00 | 100.00 | 100.00 |
| < Treatment > | ||||
| BDG | FCG | FCG-N | FCG-U | |
| Normal seed malt | X | X | O | X |
| Upgraded seed malt | X | X | X | O |
2. 체중증가량, 식이섭취량, 식이효율
체중은 3일 간격으로 일정시간에 측정하였고 식이섭취량은 매일 측정하였으며, 식이효율(food efficiency ratio, FER)은 체중증가량을 같은 기간 동안의 식이섭취량으로 나누어 계산하였다.(표 4)
네 군 간의 평균 일일 식이섭취량은 21.31g이었다. 즉 기본식이군(BDG)과 고지방대조군(FCG)의 섭취량은 각각 22.03g, 21.95g이었고, 고지방식이에 일반발효물 섭취군과 고지방식이에 개량종국발효물 섭취군은 각각 20.99g, 20.28g을 섭취하여 네 군 간에는 섭취량의 유의적인 차이는 없었다. 식이효율도 총 식이섭취량과 같은 양상으로 네 군 간에 유의적인 차이를 보이지 않았다. 연구기간 동안의 총 체중증가량 및 일일 체중증가량이 유의적으로 차이를 나타내지 않았다.
| BDG | FCG | FCG-N | FCG-U | |
| Weight gain (g/day) | 2.65±0.21 | 2.66±0.38 | 2.75±0.16 | 2.15±0.15 |
| Food intake (g/day) | 22.03±0.41 | 21.95±0.24 | 20.99±0.31 | 20.28±0.17 |
| FER | 0.12±0.02 | 0.12±0.03 | 0.13±0.04 | 0.11±0.02 |
3. 최종 발효물 섭취에 따른 혈액학적 성상의 변화
사육한 실험동물의 혈액을 채취하기 위해 실험종료 16시간 절식시키고 마취하여 심장에서 혈액을 취하였다. 채취 후 CBC tube에 2ml를 취하고, 나머지는 원심분리하여 혈청을 분리한 후 -80℃에서 냉동보관하였다. 혈액의 WBC, RBC, Hct, Hb 및 MCV, MCH, MCHC는 자동분석기를 이용하여 분석하였고, lymphocyte는 Turk solution을 이용하여 염색하여 수를 카운트 한 후 percentage로 표시하였다.
혈청의 임상화학적 분석으로 총 단백질은 biuret method 원리에 의해 TP kit(Total protein reagent)를 이용하여 유색화합물을 형성시킨 후 자동분석기를 이용하여 농도를 구하였다. 알부민 농도는 brocresol green-Doumas method에 의해 albumin kit를 이용하여 화합물을 형성시킨 후 자동분석기로 분석하였으며 총 빌리루빈은 azo reaction 원리에 의해 kit(Total bilirubin reagent)를 사용하여 발색시킨 후 자동분석기로 농도를 구하였다.
Creatinine 농도는 creatinine은 알칼리 용액에서 pocroted와 유색화합물을 형성하는 속도를 측정하여 Crea kit를 이용하여 자동분석기로 측정하였으며, Uric acid농도는 PAP method에 따라 kit와 자동분석기를 통해 혈청 내 요산농도를 구하였다. Blood urea nitrogen(BUN)의 농도는 kinrtic UV test에 따라 urea kit와 자동분석기로 농도를 측정하였고 alkaline phosphate(ALP) 농도는 IFCC method에 의해 Kit를 이용하여 발색시키고 자동분석기로 측정하였다. 간기능을 판단하는 glutamic oxaloacetate transaminase(GOT) 농도는 혈청 중의 GOT작용으로 aspartic acid와 a-ketoglutaric acid는 oxaloacetic acid와 L-glutamic acid로 변화된다. 다시 oxaloacetic acid는 조효소 NADH의 존재하에서 MDH작용으로 malate가 생성되는데, NADH가 NAD+로 산화될 때 340nm에서 흡광도의 감소를 측정하여 농도를 구한다.
이때 ST kit를 사용하였고 자동분석기로 농도를 측정하였으며, glutamic pyruvate transaminase(GTP)농도는 혈청 중의 GTP의 작용으로 L-alanine과 a-ketoglutaric acid는 pyruvic acid와 L-glutamic acid로 변화된다. 생성된 pyruvate는 조효소 NADH의 존재 하에 LDH작용으로 lactate가 생성되는데 NADH가 NAD+로 산화될 때 340nm에서 흡광도의 감소를 측정하며 ALT kir를 이용하여 자동분석기로 측정하였다.
Lactate dehydrogenase(LDH)농도는 buffered pyruvate substrate와 NADH2에다 혈청을 가해 incubation시키면 혈청 내의 LDH에 의해 pyruvic acid가 감소되고 lactate와 NAD+가 생성되는 원리로 LDH kit를 이용하여 발색시킨 후 자동분석기로 측정하였다.
| BDG | FCG | FCG-N | FCG-U | |
| RBC(x106/mm3) | 3.87±0.32 | 3.67±0.41 | 3.07±0.42 | 3.13±0.38 |
| WBC(x106/mm3) | 3.57±0.28 | 3.02±0.19 | 2.91±0.09 | 3.12±0.07 |
| Hct (%) | 57.38±4.92 | 57.00±3.19 | 58.00±5.10 | 57.63±3.72 |
| Hb (g/dl) | 16.35±1.01 | 15.99±0.99 | 16.39±1.06 | 16.70±0.96 |
| MCV (fl) | 64.63±0.91 | 63.10±0.54 | 64.25±0.12 | 63.13±0.85 |
| MCH (pg) | 18.50±0.31 | 18.39±0.45 | 18.00±0.29 | 18.50±1.48 |
| MCHC (g/dl) | 28.63±1.09 | 28.59±0.89 | 28.00±3.02 | 28.88±1.52 |
| Lymphocyte (%) | 72.88±5.02 | 73.00±4.02 | 69.63±4.75 | 72.88±5.55 |
고지방식이와 함께 발효물을 5주간 섭취한 후의 건강상태의 변화를 관찰하기 위해 혈액학적 성상 및 혈청의 임상화학 검사를 실시하여 표 6에 정리하였다.
표에서 보듯이 기본식이군, 고지방대조군 및 일반발효물과 개량종국발효물을 섭취한 두 군에서 모두 혈액학적 성상은 정상수준을 유지하고 있었다. 또한 네 군 간의 유의적인 차이를 보인 항목은 없었으나 5주간의 일반발효물 또는 개량종국발효물 섭취 시 정상 수준을 벗어나지 않은 점으로 보아 추출물이 혈액학적 요인에 유해한 영향을 미치지는 않은 것으로 판단된다.
| BDG | FCG | FCG-N | FCG-U | |
| Total protein (g/dl) | 4.86±0.32 | 4.95±0.29 | 5.21±0.33 | 4.91±0.57 |
| Albumin (g/dl) | 3.34±0.10 | 3.60±0.17 | 4.11±0.24 | 3.40±0.12 |
| Total bilirubin (mg/dl) | 0.18±0.04 | 0.25±0.06 | 0.21±0.03 | 0.20±0.04 |
| Creatinine (mg/dl) | 0.58±0.04 | 0.60±0.06 | 0.59±0.02 | 0.47±0.05 |
| Uric acid (mg/dl) | 1.75±0.44 | 1.94±0.32 | 2.81±0.61 | 2.51±0.59 |
| BUN (mg/dl) | 12.05±3.00 | 11.94±2.62 | 11.71±2.11 | 12.18±2.75 |
| ALP (mg/dl) | 109.63±5.19 | 115.12±3.76 | 126.36±7.01 | 125.13±4.92 |
| GOT (U/L) | 31.00±14.00 | 45.06±10.17 | 20.25±13.27 | 21.75±16.61 |
| GPT (U/L) | 27.13±5.15 | 29.00±4.10 | 28.75±4.92 | 25.13±9.16 |
| LDH (U/L) | 139.65±30.09 | 167.09±19.21 | 118.58±41.72 | 109.61±37.72 |
체내 영양상태를 민감하게 반영하는 혈청의 임상화학적 결과에서 네 군 간에 유의적인 차이를 보인 항목은 GOT농도였다. 간기능의 지표가 되는 GOT농도는 고지방대조군의 농도가 45.06U/L로써 기본식이군의 31.00U/L보다 유의적으로 높아져서 정상범위를 벗어났으나, 일반발효물과 개량종국발효물을 섭취한 군에서는 각각 20.25U/L, 21.75U/L로써 고지방대조군보다 유의적으로 낮아졌고 기본식이군보다도 유의적으로 낮은 수준을 보였다.
상기의 결과를 바탕으로 개량종국발효물의 5주간 섭취가 간기능의 지표인 GOT농도, GPT농도, LDH에 유익한 변화를 주어 간기능에 유익한 영향을 주었음을 알 수 있었다.
4. 최종 발효물 섭취에 따른 혈청지질농도의 개선효과
Total Cholesterol은 Enzymetic colormetic test에 의해 R208시약로 발색시킨 후 자동분석기로 농도를 구하였으며, HDL-Cholesterol과 LDL-Cholesterol은 Enzymetic colorimetry방법을 이용하여 각각의 kit와 생화학분석기로 측정하였다. Triglyceride는 Enzymetic glycerol 비소거법의 원리에 의해 TG kit와 자동분석기를 이용하여 분석하였다.
| BDG | FCG | FCG-N | FCG-U | |
| Total cholesterol (mg/dl) | 216.18±19.24 | 341.38±1.02 | 220.38±20.10 | 205.02±17.62 |
| HDL-cholesterol (mg/dl) | 30.57±4.09 | 26.84±2.92 | 30.76±4.11 | 38.02±2.11 |
| LDL-cholesterol (mg/dl) | 46.24±8.75 | 62.91±5.12 | 52.16±8.75 | 44.16±4.44 |
| Triglyceride (mg/dl) | 47.31±11.41 | 146.07±18.20 | 99.75±9.82 | 43.25±12.91 |
| Atherogenic index | 6.07±1.02 | 11.72±0.98 | 6.16±0.62 | 4.39±0.39 |
표 7에 기본식이군, 고지방대조군 및 고지방식이에 일반발효물 또는 개량종국발효물을 섭취한 네 군의 Total Cholesterol, LDL-Cholesterol, HDL-Cholesterol, Triglyceride농도 및 동맥경화지수를 정리하였다.
HDL-Cholesterol 농도는 고지방식이 개량종국발효물을 섭취한 군에서는 38.02mg/dL로서 기본식이군의 30.57mg/dL, 고지방식이 일반발효물 섭취군의 30.76mg/dL보다도 유의적으로 높게 나타났다. 한편 LDL-Cholesterol의 농도는 고지방 섭취에 의해 기본식이군보다 유의적으로 상승되어 62.91mg/dL이었고, 또한 상승된 농도는 발효물 섭취에 의해 유의적으로 낮아져 개량종국발효물 섭취군에서는 그 농도가 44.16mg/dL로서 기본식이군의 46.24mg/dL와 같은 수준으로 낮아졌다.
Triglyceride의 농도는 고지방 식이섭취에 의해 기본식이군보다도 유의적으로 높아져서 146.07mg/dL로 상승되었고 일반발효물 및 개량종국발효물 섭취에 의해 각각 99.75mg/dL, 43.25mg/dL로 유의적으로 낮아진 결과를 보였다.
모든 지질의 농도가 네 군 간에 유의적인 차이를 보였는데, 특히 Total Cholesterol 농도는 일반발효물 또는 개량종국발효물을 섭취한 두 군의 농도와 기본식이군의 농도가 같은 수준으로 나타나 추출물이 혈청의 총 콜레스테롤 농도를 낮추는데 매우 좋은 효과가 있었음을 알 수 있었고, 건강에 유익한 HDL Cholesterol의 수치는 높이고, 건강에 유해한 LDL Cholesterol의 수치는 낮추어 전반적으로 개량종국발효물을 섭취시 건강에 유익함을 확인할 수 있었다.
한편 동맥경화 지수는 기본식이군에서 6.07, 고지방대조군에서 11.72, 일반발효물 섭취군에서는 6.16, 개량종국발효물 섭취군에서는 4.39로 나타나 서로 유의적인 차이를 보였는데, 이는 생약제제 발효물이 Total Cholesterol 농도는 낮추고 상대적으로 HDL-Cholesterol 농도를 높인데서 기인한 것으로 혈청의 지질 농도 개선에 매우 좋은 방향이라 확인했다.
본 실험에서 개량종국발효물이 혈액의 Total Cholesterol, LDL-Cholesterol, Triglyceride의 농도는 낮추고, HDL-Cholesterol 농도는 상승시키는 유용한 결과를 나타낸 것은 생약제제의 발효를 통해 수용성 및 불용성 식이섬유 등을 동시에 함유하고 있어 고지혈증 및 동맥경화의 예방이나 치료에 효과가 있고 혈청지질 농도 개선효과도 효과가 있음을 확인했다.
실시예
6 :
Angiotensin
Converting
Enzyme
Inhibition
Angiotensin converting enzyme(ACE) 저해활성은 시료액에 동일 용량의 ethyl acetate를 처리하여 얻은 추출액 50ul를 rabbit lung powder에서 추출한 ACE용액 150ul(약 2.8~3Unit)와 기질용액 50ul와 섞은 후 37℃에서 30분간 반응시킨 다음 1N HCl로 반응을 정지시켰다. 이 반응액에 유리되어 나오는 hippuric acid의 양을 228nm에서 흡광도를 측정하여 산출하였고 시료 무첨가구를 대조구로 하여 저해율을 구하였다.
ACE는 체내 혈압조절계에서 엔지오텐신(I)을 (II)로 전환시키는 것을 촉매하는 효소로 고혈압을 일으키는 중요한 효소이다. 따라서 근래에 ACE저해제를 이용한 고혈압 예방용 건강식품이나 한방 의약품 개발에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 일반발효물과 개량종국발효물의 숙성기간에 따른 ACE저해활성의 변화를 조사한 결과 먼저 개량종국발효물의 경우 제조 직후 71.4%이었던 ACE저해활성이 숙성 25일에 39.6%로 급격히 감소하였다. 일반발효물의 경우에도 제조직후 72.3%에서 숙성 25일에 53.7%로 낮아지긴 했지만 개량종국발효물과 많은 차이를 확인할 수 있었다. 이와 같이 숙성이 진행함에 따라 ACE저해활성이 낮아지는 것은 개량종국발효물의 ACE저해물질이 생약제제 발효를 통하여 protease의 활성이 더욱 강해졌으며 숙성기간이 길어짐에 따라 다시 분해되었기 때문인 것으로 판단된다.
| Treatment | Aging time (days) | |||||
| 0 | 5 | 10 | 15 | 20 | 25 | |
| Using normal seed malt | 72.30 | 69.70 | 67.10 | 63.40 | 58.90 | 53.70 |
| Using upgaded seed malt | 71.40 | 63.20 | 51.90 | 44.70 | 42.30 | 39.60 |
실시예
7 : 최종
발효물의
Isoflavone
함량
Isoflavone 분석을 위한 시료의 전처리는 발효콩 분말 1g에 80% ethanol 50ml를 넣어 초음파기에서 60분간 추출한 후, 원심분리(3,000 x g, 20분)하였다. 그 상등액을 취하여 2회 반복여과한 후 40에서 회전감압농축기로 농축한 다음 80% methanol 10ml를 넣고 용해하였다. 시료액은 0.2um syringe filter로 여과하여 HPLC로 Isoflavone 함량을 분석하였다. HPLC의 분석조건으로 분석에 사용된 칼럼은 Symmetry C18 column(3.9x150mm)이었고, UV검출기를 사용하여 254nm에서 3반복하여 측정하였다. Gradient는 0.1% acetic acid를 함유한 acetonitrile(용매B)을 85:15로 시작하여 50분간 65:35로 증가시켰고, 유속은 1.0mL/min이었다. Isoflavon 표준물질로는 daidzin, genistin을 사용하였다.
개량종국발효물과 일반발효물의 Isoflavone함량을 측정하였다. Daidzein의 함량은 일반발효물(0.57mg/100g) 보다 개량종국발효물이 11.86mg/100g로 크게 증가하였다. Genistein의 함량 역시 일반발효물(8.9mg/100g)보다 개량종국발효물이 28.9mg/100g로 증가하였다. 이상의 결과에서 일반발효물 보다 개량종국발효물이 daidzein 및 genistein의 함량을 크게 증가시켰으며, 개량종국의 사용으로 생약제제의 발효를 통해 생약제제에 함유되어 있던 Isoflavone이 생약제제가 발효되는 과정이 용출된 것을 확인하였다.
실시예
8 :
총페놀
및
총플라보노이드
함량
총 페놀함량은 100ml 메스플라스크에 75ml의 증류수와 적당한 농도로 희석한 시료액 1ml를 넣고 잘 혼합한 후, Folin-Denistldir 5ml와 탄산나트륨 포화용액 10ml를 넣은 후 증류수로 100ml 용량으로 채운 후, 이것으로 잘 혼합하여 실온에서 30분간 방치시킨 후 spectrophotometer를 이용하여 725nm에서 흡광도를 측정하였다. 총페놀 함량은 표준물질 tannic acid를 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 % tannic acid 당량으로 환산하였다. 총플라보노이드 함량은 시료용액 1ml와 diethylene glycol 10ml를 혼합하고, 여기에 1N NaOH용액 1ml 가하여 잘 혼합한 후, 37에서 1시간 반응시킨 후 420nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 표준검량곡선은 naringin을 사용하여 작성하였다.
개량종국발효물과 일반발효물의 총페놀 및 총플라보노이드 함량을 측정한 결과, 일반발효물과 개량종국발효물의 총페놀함량은 각각 2.1% 및 7.6%이었으며, 총플라보노이드 함량은 각각 1.3% 및 2.7%로 일반발효물보다 모두 높았다.
실시예
9 :
SOD
유사활성
Superoxide 라디칼(O2 -)소거활성은 xanthine-xanthind oxidase cytodhrome C 환원법으로 측정하였다. 즉, 시료 0.2ml, 1mM xanthine 0.2ml와 0.05mM cytochrome C 0.2ml를 혼합하였다. 여기에 550nm에서 분당흡광도의 변화가 0.02가 되도록 희석한 xanthine oxidase 0.2ml를 가하여 3분간 흡광도 변화를 측정하였다. 이 때 superoxide anion의 소거능은 아래의 식으로 구하였다
Superoxide anion scavenging activity = (1-Abs/Abc) X 100
Abc : Absorbance of control at 550nm
Abs : Absorbance after sample treatment at 550nm
생체 내 항산화 효소 중의 하나인 SOD는 세포 내 활성산소를 과산화수소로 전환시키는 반응을 촉진하는 효소이며 SOD에 의해 생성된 과산화수소는 catalase 또는 peroxidase에 의해 물분자와 산소분자로 전환되는 중요한 효소의 하나이다(2O2 -+2H+ H2O2 + O2). 개량종국발효물과 일반발효물의 SOD유사활성을 측정한 결과, 1,000rpm농도에서 일반발효물(25.4%)보다 개량종국발효물이 81.6%의 SOD 유사활성을 보여 개량종국발효물에서 크게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예
10 :
개량종국발효물의
아토피에 대한 임상적 효능평가
서울 알레르기 클리닉을 내원한 환자 중 피부단자 시험과 항원특이 IgE항체검사 결과에서 양성반응을 보인 아토피피부염 환자 중 10명을 선별하여 이중맹검시험법(Double-blind Placebo-Controlled Food Challenge, DBPCFC)으로 알레르기 반응을 검사하였다. 대상자 중에서 질병, 과거력이나 다른 질환으로 6개월 이상 약물 치료중인 사람, 혈액검사 상 혈당, 지질, 간효소 등에 문제가 있는 사람, 하루에 한 갑 이상의 흡연자나 일주일에 3회 이상의 알코올을 섭취하는 사람은 제외하였다.
일반발효물과 개량종국발효물을 일정 기간을 사이에 두고 동일한 사람에게 직접 섭취시켜 아토피피부염의 악화와 호전 정도를 관찰하였다. 각 해당 기능성식품의 임상적 중증도 및 호전도 평가는 임상적 중증도의 scoring system을 이용하여 평가하였다. 10% 이상일 경우 양성으로 판정하였다.
서울 알레르기 클리닉에 내원한 아토피 환자 중 피부단자 시험과 항원특이 IgE 항체검사 결과에서 양성반응을 보인 아토피 환자 10명(M: 5, F: 5)을 대상으로 임상적 효능평가를 시행하였다. 실시한 결과는 표 9와 같다.
DBPCFC결과 7명의 환자 (M;2, F: 5)는 대두에 알레르기 양성반응으로 보였고, 3명의 환자 (M: 3, F: 0)는 음성반응을 보였다. 일반발효물과 개량종국발효물의 cross-over study 결과 6명의 환자 (M: 3, F: 3)는 일반발효물과 개량종국발효물에 모두 알레르기 음성반응을 나타내었고, 알레르기 증상 또한 호전을 보였다.
대두에 알레르기 양성반응을 보인 환자 7명 중 일반발효물에 4명의 환자 (M: 2, F: 2)가 양성반응을 보였고, 3명의 환자 (M: 0, F: 3)는 음성반응을 보였다. 또한 개량종국발효물은 2명의 환자 (M: 1, F: 1)가 양성반응을 보였고, 8명의 환자 (M: 4, F: 4)가 음성반응을 보였다. 대두에 알레르기 음성반응을 보인 3명의 환자는 일반발효물과 개량종국발효물 모두에서 음성반응을 보였다.
| Subject | Sex | Age | Height(cm) | Weight(Kg) | Soybean | 일반발효물 | 개량종국발효물 |
| 1 | F | 2 | 75 | 10 | + | + | - |
| 2 | M | 30 | 168 | 55 | + | + | - |
| 3 | M | 4 | 113 | 24 | + | + | + |
| 4 | F | 4 | 97 | 17 | + | - | - |
| 5 | F | 5 | 110 | 20 | + | + | + |
| 6 | F | 5 | 92 | 15 | + | - | - |
| 7 | F | 13 | 160 | 60 | + | - | - |
| 8 | M | 14 | 170 | 58 | - | - | - |
| 9 | M | 20 | 180 | 67 | - | - | - |
| 10 | M | 6 | 114 | 22 | - | - | - |
실시예
11 :
Tyrosinase
Inhibition
Tyrosinase저해활성은 시료액 0.5ml에 5mM L-DOPA 0.2ml, 0.1M sodium phosphate buffer(pH6.0) 0.2ml를 혼합한 후 tyrosinase를 첨가하여 35에서 2분간 반응시킨 수 475nm에서 흡광도를 측정하여 시료액 무첨가군과 비교하였다.
Tyrosinase는 동물, 식물 및 곰팡이 등에 널리 존재하는 검정색 색소인 멜라닌의 합성에 가장 중요한 효소로서 이 효소의 활성을 저해하는 물질을 이용하여 미백효과를 가진 화장품을 생산하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 따라서 본 실험의 개량종국발효물도 각종 생약제제를 부원료로 제조되므로 이들의 활성이 우수할 것으로 생각되어 숙성기간에 따른 tyrosinase저해활성을 조사하였다.
먼저 개량종국발효물의 경우 제조직후 17.2%의 활성을 보였으나 숙성기간이 길어짐에 따라 증가하여 25일 숙성 후에는 92.5%의 높은 활성을 보였다. 그러나 일반발효물에서는 제조직후 38.4%에서 숙성 25일 후에는 56.9%로 활성이 낮았다. 이와같이 개량종국발효물과 일반발효물 간에 이들 활성이 크게 차이나는 것은 개량종국의 사용으로 인해 부원료로 사용한 각종 약초류로 부터 tyrosinase의 활성에 미치는 활성제나 저해제의 추출정도의 차이에 의한 것으로 확인하였고 개량종국발효물의 높은 tyrosinse저해활성은 피부미용에 매우 효과가 있음을 의미하는 것으로 산업적 가치가 매우 클 것으로 생각된다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시 예에 대해 설명하였으나, 본 발명은 상술한 특정의 바람직한 실시예에 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 다양한 변형실시가 가능한 것은 물론이고, 그와 같은 변경은 청구범위 기재의 기술적 범위 내에 포함된다 할 수 있다.
Claims (10)
- i) 주원료인 곡류에 부원료인 생약원료를 혼합한 곡물 배지에 황국균(Aspergillus), 백국균(Rhizopus), 홍국균(Monascus) 중 1종 또는 2종 이상을 혼합한 종균을 균일하게 접종하고 혼합한 후, 배양하여 개량 종국을 준비하는 제1단계;
ii) 상기 개량 종국을 이용하여 곡류를 발효시킴으로써, 1차 곡류 발효액을 제조하는 제2단계;
iii) 상기 1차 곡류 발효액에 생약제제, 과일, 곡류 등의 기능물질을 투입하여 2차 발효시키는 제3단계; 및
iv) 상기 2차 발효액을 숙성 및 안정화시켜 기능성을 배가시키는 제4단계;
를 포함하는 생약 발효물의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 제1단계의 생약원료가 비타민나무(Hippophae rhamnoides L.), 가시오가피, 당귀, 산수유, 감초, 박하, 오미자, 알로에, 계피, 상황버섯, 영지버섯, 표고버섯, 인삼, 쑥 중 1종 또는 2종 이상을 혼합한 것임을 특징으로 하는 생약 발효물의 제조방법.
- 제2항에 있어서, 상기 곡물 배지를 이루는 곡류와 생약원료가 9:1의 중량비율로 혼합되는 것을 특징으로 하는 생약 발효물의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 곡물 배지에서 배양되는 종균이 Rhizopus microsporus var. oligosporus, Rhizopus oligosporus, Monascus ruber, Monascus purpureus, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus kawachii 중 1종 또는 2종 이상을 혼합한 것이며, 상기 종균이 곡물 배지에 0.1 내지 1%의 비율로 접종되는 것을 특징으로 하는 생약 발효물의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제1단계의 종균이 접종, 혼합된 곡물 배지를 30 내지 40℃의 온도, 50 내지 80%의 습도 조건에서 12 내지 36시간 배양시키는 것을 특징으로 하는 생약 발효물의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제2단계의 1차 곡류 발효액의 제조가 물에 중량대비 0.1 내지 1%의 개량종국과 쌀겨와 쌀과 같은 발효배지를 투입하여 20 내지 30℃의 온도를 유지하며 배양함으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 생약 발효물의 제조방법.
- 제7항에 있어서, 상기 배양이 기포기를 가동과 정지비율을 4:1로 하여 분당 100 내지 150리터가 되게 반복적으로 가동하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 생약 발효물의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 제3단계의 2차 발효가 곡류 발효를 마친 1차 곡류 발효액에 가시오가피, 당귀, 산수유, 감초, 박하, 오미자, 알로에, 계피, 상황버섯, 영지버섯, 표고버섯, 인삼, 쑥 등의 생약제제, 각종 과일 또는 곡류과 같은 기능물질을 단독으로 혹은 2종 이상의 복수로 투입하여 20 내지 30℃의 온도를 유지하며 10 내지 20일간 배양하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 생약 발효물의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 제4단계의 숙성 및 안정화 단계가 생약제제 발효를 마친 2차 발효액을 15 내지 18℃의 온도를 유지하며 계속 반복적으로 기포기를 가동과 정지비율을 4:1로 하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 생약 발효물의 제조방법.
- 상기 제1항 내지 10항의 방법으로 제조된 생약 발효물.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20170009100A (ko) * | 2015-07-15 | 2017-01-25 | 유니젠, 인크. | 간 치료 및 간 건강 유지를 위한 조성물과 의학 조성물 |
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| KR102356517B1 (ko) * | 2021-04-20 | 2022-02-08 | 신현제 | 생약재를 이용한 건강보조식품 조성물 및 이를 이용한 건강보조식품 |
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2010
- 2010-04-15 KR KR1020100034641A patent/KR20110115252A/ko not_active Application Discontinuation
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