KR101866468B1 - 미생물 곡물 배양을 통해 얻은 효소 농축 발효물을 이용한 효소식품 및 다이어트 식품과 이들의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미생물 곡물 배양을 통해 얻은 효소 농축 발효물을 이용한 효소식품 및 다이어트 식품과 이들의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 효소식품 제조방법은, 종국의 제조단계; 백미, 현미, 보리, 통밀 중 어느 하나 이상의 곡물에 종국을 접종하고 배양하는 입국의 제조단계; 황국균을 이용한 대두의 발효 단계; 및 상기 제조된 입국과 발효된 대두로부터 조효소를 추출하여 농축시킨 후 다시 분리했던 불용성 성분과 혼합하여 효소 활성이 높은 효소 농축 발효물을 제조하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따르면, 효소활성이 높은 효소 농축 발효물을 통해 효소활성이 높은 효소식품과 여기에 항산화활성이 높은 식품 소재를 첨가한 다이어트 효소식품 등을 용이하게 제조할 수 있다. 본 발명에 따르면, 효소활성이 높은 새로운 효소식품을 식사대용으로 섭취할 수 있어, 간편하게 건강을 증진을 도모하고 비만을 예방 및 개선할 수 있다.

Description

미생물 곡물 배양을 통해 얻은 효소 농축 발효물을 이용한 효소식품 및 다이어트 식품과 이들의 제조방법 {Enzyme food and diet enzyme food comprising concentrated product by fermentation of grains, and their preparation method}

본 발명은 효소식품 및 다이어트 식품에 관한 것으로, 특히 미생물 곡물 배양을 통해 얻은 효소 농축 발효물을 이용한 효소식품 및 다이어트 식품과 이들의 제조방법에 관한 것이다.

식품공전에 따르면 효소식품이란 식물성 원료에 식용 미생물을 배양시켜 효소를 다량 함유하게 하거나 식품에서 효소함유 부분을 추출한 것, 또는 이를 주원료로 하여 섭취가 용이하도록 가공한 것으로 정의되고 있으며, 유형은 제조원료에 따라 곡류효소함유제품, 배아효소함유제품, 과·채류효소함유제품, 기타식물효소함유제품의 4가지로 나뉜다.

그러나 일반 소비자들이 흔히 효소식품으로 일컫고 있는 제품들은, 이러한 효소 식품의 정의나 유형, 특질에 부합하지 않는 경우가 많다. 이렇게 효소식품의 기준에 부합하지 않으면서 효소를 표방하는 식품의 제조 과정을 보면, 설탕-식품-설탕 순으로 덮고 숙성시켜 만드는 일종의 설탕절임 보존식품이 대부분인데, 이는 일본식 식문화에서 전파된 일종의 '청'에 해당된다. 2014.01.22 한국소비자원에서 발표한 보도자료에 따르면 3대 오픈마켓에서 효소식품류로 판매되고 있는 100개의 효소(표방)식품을 선정하여 분류해본 결과 24개(24%)만이 효소식품이었고, 나머지는 효소식품이 아닌 것으로 나타났다.

비만은 에너지 섭취량과 소비량의 불균형으로 인해 체내에 지방이 과잉 축적되어 있는 상태로, 세계적으로 심각한 사회문제가 되고 있다. 비만은 당뇨, 고혈압, 심혈관계 질환, 고지혈증과 같은 성인병을 일으키는 주요 인자로 밝혀지면서 세계보건기구(World Health Organization, WHO)에서는 2000년부터 비만을 주요 보건의료 문제로 지정하고 있다.

비만인은 장기적이고 습관적인 과식, 운동부족 등이 주요 원인이라 이를 개선하는 것이 가장 좋은 치료법이지만 바쁜 현대인에 있어 식습관 개선과 운동은 쉬운 처방이 아니다. 따라서 차선책으로 부작용이 없는 천연 항비만 소재를 이용하여 비만을 개선하고 이러한 비만 개선에 의해 비만관련 질환을 예방 및 개선할 수 있다면 국민 보건 향상과 국가 의료비 절감에 크게 기여할 수 있다.

그 동안의 비만 치료에 대한 조사 결과, 다양한 다이어트 제품 중 식이요법으로 인한 다이어트를 선호하고 있으며, 축적된 노폐물과 지방의 제거에 관한 디톡스 다이어트(Detox Diet)에 관심을 가지는 것으로 나타났다. 특히, 효소는 체내에 쌓여 있는 독소를 제거하도록 도와주는 중요한 기능을 하므로, 다이어트 시장에서 한축을 차지하고 있다.

또한, 연구에 의하면 비만은 산화적 스트레스를 유발하여 체내 활성산소종(ROS, reactive oxygen species)을 증가 시키고 체내에 존재하는 항산화 시스템에 의해 ROS가 제거되지 않으면 노화, 당뇨 등과 같은 다양한 질병을 유발시킨다. 따라서 항비만 기능 및 항산화 효과를 가지고 있으면서 부작용이 거의 없는 천연소재 함유 항비만 및 항산화 제품을 개발하면 비만 예방 및 비만 개선 효과뿐만 아니라 노화방지 등 산화적 스트레스에 의한 질병들을 예방 및 개선에 도움을 줄 수 있다. 따라서 현재 지방축척 억제 및 ROS 소거작용을 나타내는 항비만 및 항산화 효과를 가진 천연소재를 찾고자 하는 노력들이 활발하게 진행되고 있다.

효소식품 및 효소를 이용한 다이어트 식품과 관련한 선행특허로, 대한민국 등록특허공보 10-1338929 "곡류발효 효소를 포함한 식품 보조제", 대한민국 공개특허공보 10-2015-0018027 "곡물발효 효소분말을 주재로 한 다이어트 보조식품 및 그 제조방법", 대한민국 등록특허공보 10-1261823 "미생물발효에 의한 활성 효소식품의 제조방법" 등이 있다.

1. 대한민국 등록특허공보 10-1338929 2. 대한민국 공개특허공보 10-2015-0018027 3. 대한민국 등록특허공보 10-1261823 4. 대한민국 등록특허공보 10-1284578 5. 대한민국 등록특허공보 10-1429366 6. 대한민국 등록특허공보 10-1220131 7. 대한민국 등록특허공보 10-0443880

본 발명에서는 미생물 곡물 배양을 통해 효소활성이 높은 효소 농축 발효물을 얻는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명에서는, 상기 효소 농축 발효물을 이용하여 식사대용이 가능하고 효소활성을 지닌 또는 이와 함께 항산화 활성 등의 기능성을 구비한 효소식품과 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명에서는, 상기 곡물 효소 농축 발효물과 함께 비만을 억제하거나 개선할 수 있는 천연소재를 이용하여 식사대용이 가능하고 효소활성 및 항산화 활성이 있으면서 비만을 억제 또는 개선할 수 있는 효소 다이어트 식품과 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명에서는,

(a) 백미, 현미, 보리, 통밀 중 어느 하나 이상의 곡물을 증자하여 고두밥을 만든 후 백국균과 황국균을 접종하고 배양하여 포자를 생성시킨 후 생성된 포자를 건조시켜 종국으로 회수하는 종국의 제조단계;

(b) 백미, 현미, 보리, 통밀 중 어느 하나 이상의 곡물을 증자한 후 상온으로 냉각시키고 상기 (a) 단계에서 얻은 종국을 0.4~0.6중량%로 접종하고 25~32℃에서 2~5일간 배양하는 입국의 제조단계;

(c) 대두를 증자한 후 건조시키고 조분쇄하여 얻은 대두분을 수분 함량 40~60%로 조정한 후 황국균을 4~0.6중량%로 접종하고 25~32℃에서 일정 시간 간격으로 뒤집어 주면서 3~6일간 발효시키는, 황국균을 이용한 대두의 발효 단계; 및

(d) 상기 (a) 단계에서 얻어진 입국과 (b) 단계에서 얻어진 발효된 대두에 물을 가해 가용성 성분을 추출한 후 가용성 성분이 포함된 상등액과 불용성 성분을 분리하고, 상기 상등액을 한외여과시켜 부피가 1/3 이하로 감소될 때까지 농축시킨 후 동결건조시켜 조효소 농축물을 얻고, 상기 동결건조된 조효소 농축물에 상기 분리한 불용성 성분을 8~12배 중량으로 혼합한 후 균질화하여 효소 농축 발효물을 제조하는 단계를 포함하는, 효소 농축 발효물을 유효성분으로 함유하는 효소식품의 제조방법이 제공되며,

상기 (a) 내지 (d) 단계에 이어, (e) 율무, 탱자, 옥수수 수염 및 표고버섯의 건조분말을 상기 (d) 단계에서 얻어진 효소 농축 발효물 100 중량부에 대하여 각각 30~80 중량부로 혼합하는 단계를 더 포함하는, 효소 농축 발효물과 항산화활성 식품소재를 유효성분으로 함유하는, 다이어트를 위한 효소식품의 제조방법이 제공된다.

또한, 본 발명에서는,

상기 (a) 내지 (d) 단계를 포함하는 방법으로 얻은 효소 농축 발효물을 유효성분으로 함유하는 효소식품과, 상기 농축 발효물 100 중량부에 대하여 율무, 탱자, 옥수수 수염 및 표고버섯의 건조분말을 각각 30~80 중량부로 더 포함하는, 다이어트를 위한 효소식품이 제공된다.

본 발명에서는 효소활성이 높은 효소 농축 발효물을 통해 효소활성이 높은 효소식품과 여기에 기능성 식품소재를 첨가한 기능성 효소식품 등을 용이하게 제조할 수 있다.

또한, 본 발명에서는 상기 효소 농축 발효물을 항산화활성이 높은 식품 소재와 결합하여 효소활성과 항산화 활성이 높으며 비만을 억제 또는 개선할 수 있는 다이어트 효소식품을 제공한다.

본 발명에 따르면, 효소활성이 높은 효소 농축 발효물과 천연소재를 이용한 새로운 효소식품을 식사대용으로 섭취할 수 있어, 간편하게 건강을 증진을 도모하고 비만을 예방 및 개선할 수 있다.

또한, 본 발명의 효소 농축 발효물은 다른 기능성 식품소재에 결합되어 다양한 형태의 기능성 효소식품으로도 개발될 수 있다.

도 1은 종국 제조에서 입국 제조까지의 바람직한 실시예를 나타낸 블록도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 완성된 입국의 사진이다.
도 3은 대두 발효 단계의 바람직한 실시예를 나타낸 블록도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 발효된 대부분말 발효물의 사진이다.
도 5는 효소 농축 발효물 제조단계의 바람직한 실시예를 나타낸 블록도이다.

본 발명의 효소식품의 제조방법을 각 단계별로 상세히 설명한다.

종국의 제조단계

먼저, 곡물로 백미, 현미, 보리, 통밀 중 어느 하나 이상을 선택하여 사용한다. 바람직하게는 백미, 현미, 보리, 통밀의 혼합곡물을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 선택된 곡물을 수세한 후 바람직하게는 1~3시간 정도 침지시킨 후 물기를 빼고 사용한다.

위와 같이 준비된 곡물을 증자하여 고두밥을 만든다. 고두밥은 덩어리가 없도록 고르게 한 후 상온으로 식혀서 백국균과 황국균을 접종한다. 바람직하게는 26~35℃ 정도로 식었을 때 접종하여 배양하며, 백국균과 황국균은 0.1~0.3중량%로 접종한다. 적절하게 뒤집어 주면서 포자가 충분히 생성되도록 배양하는데, 48시간 정도면 보통 출국할 수 있다.

출국한 시료는 무균상태에서 30~45℃ 정도로 충분히 건조시킨 다음 건열멸균한 전분을 첨가하고 고루 혼합한 다음 멸균된 100mesh 체로 쳐서 곰팡이 포자를 함유한 전분을 회수하여 종국으로 사용한다.

입국의 제조단계

곡물로 백미, 현미, 보리, 통밀 중 어느 하나 이상을 선택하여 사용한다. 바람직하게는 백미, 현미, 보리, 통밀의 혼합곡물을 혼합 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 선택된 곡물을 수세하고 바람직하게는 1~3시간 정도 침지시킨 사용한다. .

곡물을 증자시킨 후 상온으로 냉각시키고 상기 단계에서 제조한 종국을 곡물대비 0.4~0.6중량%로 접종하고 25~32℃에서 2~5일간 배양한다. 이때 보다 바람직하게는, 수분함량 50±5%, pH 4.0±0.5, 28±1℃에서, 제조 후 30일 이내의 냉장보관된 종국으로 3일간 단기간 발효시킨다.

상기 단계의 종국 제조에서 입국 제조까지의 바람직한 실시예는 도 1과 같으며, 도 2는 완성된 입국의 사진이다.

대두의 발효 단계

쌀 등의 곡물 입국에서는 amylase의 활성은 좋으나 protease와 lipase의 활성이 떨어지기 때문에, 본 발명에서는 potease와 lipase의 활성이 좋은 발효물을 얻기 위해 대두를 황국균(Aspergillus oryzae)으로 발효시켜 위의 입국과 함께 사용한다.

대두를 증자한 후 건조시키고 조분쇄한 대두분을 수분 함량 40~60%로 조정한 후 황국균을 접종한다. 증자된 대두를 낱알로 그냥 발효시킬 경우 효소활성이 증가하기까지 최소 9일에서 30일 이상의 긴 기간이 소요되므로, 본 발명에서는 발효기간을 단축하기 위해 증자된 대두를 건조하고 거칠게 조분쇄한 후 위와 같이 수분함량을 조정하여 사용한다.

위와 같이 준비된 대두분에 황국균을 4~0.6중량%로 접종하고 25~32℃에서 일정 시간 간격으로 뒤집어 주면서 3~6일간 발효시킨다.

본 단계의 바람직한 실시예는 도 3과 같으며, 도 4는 실시예에서 발효된 대두분말 발효물의 사진이다.

효소 농축 발효물을 제조하는 단계

위에서 얻은 입국 및 대두 발효물과 같이 효소활성을 지닌 발효물 자체를 분말화하여 제품화할 경우 제품 중의 효소 활성이 낮다는 문제가 있다. 본 발명에서는 제품 중의 효소활성을 높이고 아울러 제품의 표준화를 가능하도록 발효물로부터 조효소를 분리하여 농축한 다음, 얻어진 조효소 농축물을 다시 분리시켰던 불용성 발효물(전분질)에 적절한 비율로 첨가 조정함으로써 효소활성이 높은 효소 농축 발효물을 만든다. 본 발명에서 "효소 농축 발효물"은 발효물로부터 효소를 분리 농축한 후 다시 효소를 분리시킨 발효물에 혼합하여 농축 전 발효물 대비 효소활성을 높인 발효물로 정의된다.

먼저, 위에서 얻은 발효물인 입국과 발효된 대두에 물을 가해 가용성 성분을 추출한다. 그런 다음 가용성 성분이 포함된 상등액과 불용성 성분을 분리하고, 상기 상등액을 한외여과시켜 부피가 1/3 이하, 바람직하게는 1/4 정도로 감소될 때까지 농축시킨 후 동결건조시켜 조효소 농축물을 얻는다.

이렇게 얻어진 조효소 농축물에 상기 분리했던 불용성 성분(전분질)을 8~12배 중량으로 혼합한 후 균질화하면 본 발명의 효소 농축 발효물이 얻어진다. 이때 보다 바람직하게는 조효소 농축물에 상기 분리했던 불용성 성분을 10±1배 중량으로 혼합한다.

본 단계의 바람직한 실시예는 도 5와 같다.

다이어트를 위한 효소식품의 제조단계

상기와 같이 얻어진 본 발명의 효소 농축 발효물에, 항산화활성 식품소재, 식이섬유, 기타 다이어트에 유효한 식품소재를 혼합하여 다양한 다이어트 효소식품을 만들 수 있다.

본 발명에서는, 다양한 천연 소재들을 탐색한 결과, 맛과 활성, 건강식품으로서의 소비자 인식 등을 고려하여 옥수수 수염, 탱자, 율무 그리고 표고버섯을 선정하였다.

옥수수(Zea mays L.)수염은 옥수수의 부산물로 옥수수의 열매 부분을 싸고 있는 실 같은 부분으로 주요생리활성 물질은 메이신(maysin)으로 알려져 있다. 옥수수수염은 항산화 효과, 이뇨작용, 당뇨억제효과 등이 있는 것으로 알려져 있으며, 메이신은 페놀(phenol)성 물질인 플라보노이드(flavonoid)의 하나로서 산화에 비교적 안정적이고 항비만 효과, 종양 세포주에 대한 세포독성 효과 및 항산화 효과 등이 있는 것으로 알려져 있다.

율무(Coix lachryma-jobi L.)는 다른 곡류에 비하여 고단백, 고지방의 곡류이고, 전분의 대부분이 amylopectin으로 되어 있으며, 섬유소뿐만 아니라 무기질과 비타민이 풍부하게 함유되어 있어 건강에 유익하고, 고지혈증 개선효과 및 면역증진 효과 등이 알려져 있다.

표고버섯(Lentinus edodes)은 3대 주요 식용버섯 중의 하나로, 한국, 일본, 중국 등 동남아시아 지역에서 주로 재배되며, 특유의 향과 다양한 약리작용을 가지고 있다. 식용 및 약용으로 널리 이용되어져 오고 있는 표고버섯은 항산화, 성인병 예방, 암세포 증식 억제, 고혈압, 당뇨병 등에 효능이 있는 것으로 알려져 있다.

탱자는 항균활성이 있는 linalool, camphene 등의 terpene류가 다양하게 존재한다. Flavonone 등과 hesperidin, neohesperidin, naringin, naringenin, tangeritin,nobiletin, neodiosmin, flavone, auranetin, quercetin 등이 함유되어 있어 항산화 활성 및 지질 저하효과를 나타낸다.

먼저, 율무, 탱자, 옥수수 수염 및 표고버섯을 각각 건조시켜 분말화한 후, 본 발명의 효소 농축 발효물 100 중량부에 대하여 율무, 탱자, 옥수수 수염 및 표고버섯 분말을 각각 30~80 중량부로 혼합하여, 본 발명의 다이어트 효소식품을 만든다.

이때 식품으로 허용 가능한 첨가제가 추가될 수 있다. 예를 들면, 전분, 소맥분, 부형제, 감미제, 산미제, 가향제 등이 필요에 따라 더 추가될 수 있다.

또한, 본 단계는 식품으로 허용 가능한 일반적인 제제화 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 부형제 등 제제화에 필요한 통상의 첨가제를 추가하여 용해가 용이한 분말제형이나, 그래뉼제, 정제, 캡슐제, 액제, 시럽제 등의 제형으로 제제화하는 단계를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서는, 본 발명의 효소 농축 발효물을 유효성분으로 함유하는 효소식품을 제공한다.

본 발명의 효소식품은 필요에 따라 기능성을 가진 식품소재를 첨가하여 다양한 기능성 식품으로 제조될 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 효소 농축 발효물에 기존의 건강기능식품을 추가하여 효소 기능성을 지닌 건강기능식품으로 제조할 수도 있으며, 천연 비타민이나 무기질 등을 추가하여 효소와 비타민 또는 무기질을 함유하는 기능성 식품으로 만들 수도 있다.

[ 실시예 ]

이하 구체적인 실시예 및 실험예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 아래의 실시예 및 실험예를 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

1. 쌀입국의 제조

(1) 재료 및 방법

① 종국의 제조

본 발명에 사용된 백국균(Aspergillus kawachi)은 ㈜충무발효에서 구입하였고, 황국균(Aspergillus oryzae)은 ㈜수원종국에서 구입하였다. 곡류들은 시중에서 구입하였다. 백국균을 이용한 종국의 제조는 아래와 같이 실시하였다. 백미를 110℃에서 30분간 증자하여 고두밥을 만든 다음 잘 비벼서 덩어리가 없도록 고르게 하였고 32℃기 되었을 때 백국균과 황국균을 0.2%(w/w) 접종하고 균일하게 혼합한 다음 배양하였다. 18시간 후 1차 뒤집기를 하였으며 5시간 후 다시 2차 뒤집기를 하여 전체적으로 포자가 충분히 생성된 48시간 후 출국하였다. 시료는 무균상태에서 넓게 펼쳐 40℃에서 이틀간 충분히 건조시킨 다음 건열멸균한 전분을 동량을 첨가하고 고루 혼합한 다음 멸균된 100mesh 체로 쳐서 곰팡이 포자를 함유한 전분을 회수하여 종국으로 사용하였다.

② 입국의 제조

백미를 세척하고 수돗물에 2시간 동안 침지한 다음 증기로 쪘으며 30℃로 냉각하였다. 상기 ①에서 준비한 백국균 종국을 곡물대비 0.5% 비율로 접종하고 28℃에서 95%의 습도를 유지하면서 5일간 배양하였고 12시간 간격으로 효소활성을 측정하였다. 도 4는 완성된 입국의 사진이다.

③ 효소의 활성 분석

ⅰ) 효소액의 조제

입국 시료 10 g을 250 ㎖ 삼각 플라스크에 넣고 0.5% 식염수 100 ㎖를 가한 다음 25℃에서 3시간 동안 천천히 교반하여 효소성분을 추출하였다. 추출액은 10,000g에서 20분간 원심분리하였으며 그 상등액을 실험용 조효소액으로 사용하였다.

ⅱ) α-amylase 활성 측정

α-amylase 활성 측정은 식품공전의 효소식품에 대한 시험법에 준해 실시하였다. 시험용 시험관에 1% 가용성 전분용액 5 ㎖, 맥바인완충액(pH 7.0) 13 ㎖와 0.1% NaCl용액 1 ㎖를 넣고 37℃로 가온하고 조효소액 1 ㎖를 넣은 후 37℃에서 20분간 반응시켰다. 반응 후, 100℃에서 10분간 가열하여 효소를 불활성화시킨 다음 실온으로 냉각하였고, 10,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액 중의 환원당 량을 측정하였다. 별도로 100℃에서 10분간 가열하여 활성을 잃은 조효소액 1 ㎖를 위와 같이 조작하여 공시험용으로 하였다. 효소 반응액 0.4 ㎖에 DNS 용액 1.2 ㎖를 넣은 다음 100℃에서 5분간 가열였고 상온으로 냉각한 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 D-glucose를 사용하여 검량선을 작성하였고 α-amylase의 활성도(unit/g)는 입국 1 g이 함유하는 역가로 1분간 효소가 반응하여 생성되는 D-glucose의 양을 검량선을 이용하여 D-glucose의 ㎍수로 환산하여 계산하였다.

ⅲ) Protease 활성 측정

Protease 활성 측정은 식품공전의 효소식품에 대한 시험방법에 준해 실시하였으며 이는 Anson 변법(2)과 동일한 방법으로 단백질분해효소활성 측정에 일반적으로 이용되는 방법이다. 0.6% casein을 0.2 M phosphate buffer에 녹인 기질(pH 7.0) 5 mL에 효소액 1 mL를 넣어 37℃ water bath에서 10분간 반응시킨 다음, 0.44 M Trichloroacetic acid(TCA) 5 mL를 가하여 반응을 정지시켰다. 30분간 실온에서 방치시킨 다음, 여과(Whatman No.2)한 여액 2 mL를 취하여 0.55 M Na2CO3 용액 5 mL를 첨가시킨 후, folin 시약 1 mL를 첨가하여 30분간 발색시켜서 660 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 반응 정지를 먼저 시킨 다음, 위와 같은 방법으로 측정하였고 별도로 작성한 tyrosine 표준곡선으로부터 측정치에 대한 tyrosine 량으로 계산하여 시료 1 g당 tyrosine μg수로 나타내었고, tyrosine 1 μg을 생성하는 능력을 1 unit으로 하였다.

ⅳ) Lipase 활성 측정

Lipase의 활성도는 Winkler and Stuckman , 기질로 p-nitrophenyl palmitate를 사용하여 측정하였다. p-nitrophenyl palmitate를 acetonitrile에 10mM로 용해하였으며 0.1M Tris-HCl(pH 7.5) 완충용액 950㎕에 기질용액 10㎕, alsolute ethanol 40㎕, 그리고 효소용액을 5~10㎕를 가해 37℃에서 20분간 방치한 다음 유리된 p-nitrophenol의 양을 410 nm에서 흡광도로 측정하였다. Lipase의 활성도(unit/g)는 입국 1 g이 1분간 반응하여 생성되는 p-nitrophenol의 ㎍수로 환산하여 계산하였다.

(2) 결과 및 요약

Asp. kawachii를 종국으로 이용한 입국의 효소 활성을 분석한 결과는 아래 표 1과 같다. 전분의 가수분해를 돕는 α-amylase 활성은 36시간까지 서서히 증가하다 그 후 가파르게 상승하여 48시간이 지나면서 1,200unit/g 에 달했으며 그 후 완만한 증가를 나타냈다. Proteasee 활성은 발효기간 동안 증가하였으며 발효 시작 48시간 최고치인 200 unit/g에 도달 한 후 그 후 약간 감소하였다. 한편 Lipase의 활성을 측정한 결과 발효기간 동안 활성이 확인되지 않았다. 일반적으로 amylase, protease 그리고 lipase 등의 가수분해효소들은 기질이 존재할 때 그 활성이 나타나는 유도효소로, 이들의 활성은 기질의 존재여부 및 양에 따라 영향을 받은 것으로 생각된다. 따라서 쌀입국에는 지방함량이 미미하여 Asp. kawachii가 lipase를 생성하지 못하는 것으로 사료된다.

[표 1]

2. 황국균을 이용한 대두의 발효

일반적으로 황국균에 의한 Protease 생산은 메주발효와 같이 증자한 콩을 발효시키는 방법을 주로 이용하나 이 경우 발효기간이 1 개월에서 길게는 수 개월이 걸린다는 점에서 본 발명의 목적 중 하나인 생산성 향상을 위한 발효기간 단축과는 차이가 있었다. 따라서, 본 발명에서는 단기간에 단백질 분해효소생산이 가능한 최적발효조건을 조사하였다.

(1) 재료 및 방법

① 종국의 제조

대두의 발효를 위한 황국균(Aspergillus oryzae)은 ㈜수원종국에서 구입하였으며 곡류들은 시중에서 구입하였다.

② 대두의 발효

대두를 증자한 후 건조시켜 거칠게 분쇄한 대두분을 수분 함량 50%로 조정한 다음 준비된 황국균을 0.5%(w/w) 비율로 접종하였고 28℃에서 일주일간 발효를 진행하면서 24시간 간격 뒤집기를 하면서 발효물의 α-Amylase와 Protease 그리고 Lipase의 활성을 측정하였다. 발효된 대두분말 발효물의 사진은 도 4와 같다.

(2) 결과 및 요약

1) 발효를 시작한 후 4,5일째에 모든 효소활성이 최고치에 달했으며 그 후에는 소폭 감소하거나 큰 변화가 없었다(표 2). 따라서 본 발효조건에서 4일간 발효를 하는 것이 효소생산을 위해서는 가장 효율적인 것으로 판단되었다. 본 발명에서는 액체배지가 아닌 반고체 배지 형태로 발효가 진행되었으며, Lipase의 생산을 유도하기 위해 탈지하지 않은 대두를 사용하였고, 최고 활성은 발효 4, 5일째에서 나타났다. 한편 Lipase 활성은 α-amylase나 Protease의 활성에 비해 매우 낮게 나타났다. Lipase의 활성은 발효 5일째 10.4 unit/g을 나타냈으며, 그 이후에는 점차 감소하거나 변화가 나타나지 않았다.

[표 2] Asp. oryzea 를 종국으로 이용한 대두의 발효 중 효소 활성 변화

2) 발효 시간 단축

쌀입국 발효시간 단축을 위해 발효조건을 분석한 결과 수분함량 50%, pH 4.0, 28℃에서 최적 발효가 일어났으며 종국의 품질 유지가 가장 중요한 요소로 나타났다. 종국의 품질은 종국 제조 후 건조상태, 보관상태 그리고 보관기간에 따라 영향을 받는 것으로 보이며 따라서 사용 전까지 충분히 건조된 상태에서 냉장보관하며 제조 후 1개월 이내에 사용하는 것이 입국제조시간을 단축시키는데 도움이 되는 것으로 나타났다. 본 발명에서 쌀 입국의 최적 효소생산기간은 3일로 확인되었다. 대두 발효의 경우 증자한 대두를 그대로 낱알로 발효시켰을 때 효소활성이 발효 9일까지 급격히 증가한 후 한 달 이상 지속적으로 증가하는 결과들을 보인다. 그러나 본 발명에서는 증자된 대두를 건조하고 분쇄한 후 수분함량을 조정하여 발효시킨 결과 발효시간을 5일로 단축할 수 있었다.

3. 발효물로 부터 조효소 분리 및 농축

(1) 조효소 추출 및 농축 방법

발효물 무게의 20배에 해당하는 4℃의 멸균수를 가한 다음 4℃에서 3시간 동안 서서히 교반하여 효소들이 포함된 가용성 성분들을 추출하였다. 그 후 다시 4℃에서 24시간 동안 방치하여 불용성 물질들을 침전시켜 제거한 다음 10,000g에서 30분간 원심분리하여 상등액만을 취했다. 상등액은 Ultrafiltration(Amicon ultracel Membrane MWCO5kDa)을 이용하여 부피가 1/4로 감소될 때 까지 농축하였으며, 그 후 동결건조를 통해 수분을 제거하였다. 동결건조물은 동결건조물 무게의 10배에 해당하는 분리된 불용성 물질(전분질)을 혼합하여 균질화하여 100mesh의 체로 걸러 본 발명의 효소 농축 발효물을 얻었다. 얻어진 효소 농축 발효물은 4℃에 보관하였다.

(2) 조효소 농축물의 α-Amylase와 Protease 및 Lipase 활성

조효소 농축물의 α-Amylase와 Protease 및 Lipase 활성을 측정한 결과 각각 800,500 unit/g, 250,000 unit/g 그리고 550 unit/g 으로 나타났다. 이는 농축하기 전의 발효물에서의 활성에 비해 약 50～100배에 해당하였다. 결과는 아래 표 3과 같다.

[표 3] 조효소 농축물의 효소활성 측정

4. 천연물의 항산화 활성 분석

(1) 재료 및 방법

1) 재료의 전처리

율무, 탱자, 옥수수 수염과 표고버섯은 50℃에서 3일간 충분히 건조하였으며, 건조 후 분쇄한 다음 100 mesh 체로 걸러 통과한 분말을 시료로 이용하였다.

2) 총페놀 함량 측정

총 페놀 화합물의 함량은 Folin-Denis법을 응용하여 측정하였다. 4종의 시료분말들은 70% 주정에 일정 농도로 현탁한 다음 24시간 동안 4℃에서 서서히 교반하였으며 13,000g 에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 분석시료로 이용하였다. 분석시료 0.2 ㎖을 시험관에 넣고 증류수를 1.8 ㎖과 Foli-ciocalteu’s phenol reagent(SigmaAldrich Co., St. Louis, MO, USA) 0.2 ㎖을 첨가하여 혼합한 다음 실온에서 3분간 방치하였다. 그리고 10% Na₂CO₃(Deajung, Korea) 포화용액 0.4 ㎖ 가하여 혼합하고 증류수 1.4 ㎖을 첨가한 후 실온에서 1시간 반응시켜 상등액을 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질은 카페인산(caffeic acid)(Sigma-aldrich, USA)을 0∼100 μg/㎖의 농도로 제조하여 시료와 동일한 방법으로 분석하였으며, 표준검량곡선으로부터 추출물의 총 페놀 함량을 계산하였다.

3) 총 플라보노이드 함량 측정

총 플라보노이드는 Moreno 등의 방법에 따라 시료 0.5 ㎖에 10% aluminum nitrate(SigmaAldrich Co.) 0.1 ㎖, 1 M potassium acetate(SigmaAldrich Co.) 0.1 ㎖ 및 80% ethanol 4.3 ㎖를 차례로 가하여 혼합하고 실온에서 40분간 방치한 다음 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질은 quercetin(SigmaAldrich Co.)을 0∼100 μg/㎖의 농도로 제조하여 시료와 동일한 방법으로 분석하였으며, 표준검량곡선으로부터 추출물의 총 플라보노이드 함량을 계산하였다.

(2) 결과 및 요약

식물성 식품 속에 함유되어 있는 많은 생리활성 물질 중 페놀성 화합물들은 식물계에 존재하는 2차 대사산물의 하나이며 분자 내에 phenolic hydroxyl기를 가지고 있는 방향족 화합물을 총칭하는 것으로, 폴리페놀 화합물은 세포벽, 다당류, 리그닌 등과 에스테르 결합되어 있거나 중합체로 존재하며, 수산기를 통한 수소공여와 페놀고리구조의 공명안정화에 의해 항산화 능력을 나타낸다고 보고되어 있다. 플라보노이드는 페놀성 화합물 중에서 자연적으로 생성되는 가장 큰 그룹 중의 하나로써 효과적인 free radical scavenger로서 항산화 효과를 가진다. 또한 DPPH는 수소를 공여 받아 환원되어 짙은 자색이 노란색으로 탈색하는 원리를 이용하여 흡광도를 측정하는데 주로 phenol성 화합물 및 aromatic amine 화합물의 항산화 활성을 측정하는데 많이 사용한다.

본 발명에서 사용된 율무, 탱자, 옥수수수염과 표고버섯 분말시료들에 대한 항산화활성을 분석하기 위해 총 페놀 함량, 총 플라보노이드 함량을 측정하였다. 시료들에 대한 분석 결과는 표 14서 나타난 것처럼 3가지 분석 값이 탱자분말 추출물에서 가장 높게 나타났으며 그 다음 옥수수수염 분말 추출물이었고 율무와 표고버섯 분말 추출물은 다른 시료들에 비해 상대적으로 낮았다.

[표 4] 율무, 탱자, 옥수수 수염, 표고버섯 추출물의 항산화 활성 분석

5. 다이어트 효소 식품의 제조

위 3.(1)에서 얻은 효소 농출 발효물과 위 4.(1)의 1)에서 준비된 탱자분말, 옥수수수염 분말 등을 아래 표 5의 구성비로 혼합하여 다이어트 효소식품을 제조하였다. 제조된 다이어트 효소식품에 대한 효소활성분석 및 항산화활성, 아플라톡신 분석 등을 실시하였다.

[표 5]

1) 효소활성 및 항산화활성 분석

제조된 다이어트 효소식품(이하 '제조된 다이어트 효소식품'이라 함)에 대한 α-Amylase와 Protease 및 Lipase 활성을 분석한 결과 각각 7,500 unit/g, 410 unit/g 그리고 43 unit/g으로 나타났다(표 6). 이는 시판 제품에 비해 효소활성이 상대적으로 매우 높은 것이다.

[표 6] 효소활성 및 항산활성

2) 영양성분분석

제조된 다이어트 효소식품에 대해 조단백질을 포함한 9가지 성분의 영양성분을 분석하였다. 분석한 결과는 아래 표 7과 같다. 열량은 405kcal/100g였으며, 탄수화물, 조단백질, 그리고 조지방의 함량은 100g 당 각각 약 43g(43%), 42g(42%) 그리고 4g(4%)으로 나타났다. 다이어트 효소식품의 Quercetin 함량은 한 팩(120g)당 약 30mg을 함유하고 있어 일반 음료의 두 배에 달했다. 따라서 다이어트 효소식품은 일반 양파음료와 비교할 때 Quercetin 함량이 오히려 높고 맛, 향 등에서 매우 긍정적인 차별성을 지님으로써 새로운 대체 기능성제품으로서의 역할을 충분히 할 수 있을 것으로 판단되었다.

[표 7]

4) 아플라톡신 분석

아플라톡신은 곰팡이독소 중에서 독성이 가장 강하고 견과류, 곡류, 향신료 등 많은 식품에서 검출되고 있기 때문에 식품위생에서 가장 중요한 곰팡이독소이다. 이는 천연물질 중 가장 강한 발암물질의 하나이며 WHO 국제암연구소는 그룹 1(인체 발암물질)로 분류하고 있다. 더욱이 아플라톡신은 본 발명에서 이용한 백국균(Asp. kawachi) 및 황국균(Asp. oryzea)과 같은 속인 Asp. flavus가 생산하는 독소로, 곰팡이 발효식품에서는 주의 깊게 관찰되어야 하는 중요한 위생적 지표이다. 아플라톡신은 10종류 이상의 동족체가 있지만 독성 때문에 식품위생상 중요하다. 본 발명의 다이어트 효소식품은 곰팡이를 이용한 발효제품이므로, 제품의 안전성을 확인하기 위해 아플라톡신분석을 한국기능식품연구원에 의뢰하였다. 분석결과, 아플라톡신 '불검출'로 판정됨으로써 본 발명의 다이어트 효소식품의 아플라톡신에 대한 안전성이 확인되었다.

5) 기타 안전성 검사

제조된 다이어트 효소식품에 대한 중금속과 대장균에 대한 검사를 실시하였다. 결과는 아래 표 8과 같다. 본 제품은 제품 특성상 열처리를 할 수 없는 발효 효소식품이므로 무엇보다도 제조과정 중의 위생상태가 중요하다. 따라서 미생물 오염 방지는 제품의 안전성에 매우 중요한 요소이다. 중금속으로 납과 카트늄을 검사하였으며 미생물은 일반세균과 대장균을 검사하였다. 검사 결과 대장균은 불검출로 판정되었고 일반세균은 680cpu/kg, 중금속은 납의 경우 0.032ppm, 카드늄은 0.024ppm의 미량으로 검출되어 안전성에 문제가 없는 것으로 나타났다.

[표 8] 중금속과 미생물 검사결과

6) 유통기간 확인

본 발명 효소식품의 유통기간을 확인하기 위해 제조된 다이어트 효소식품에 대해 8개월 동안 2달 간격으로 효소활성 및 항산화활성을 측정하여 활성의 변화를 분석하였다. 결과는 아래 표 9와 같다. 제조된 다이어트 효소식품 시료는 수분함량을 1%로 조정하였으며 냉암소에 보관하면서 각각의 활성을 측정하였다. α-Amylase를 포함한 나머지 효소활성과 항산화활성이 연구기간 중인 8개월간 큰 변화없이 유지되었으며 효소특성상 고온에서의 강제실험을 할 수 없어 그 이상의 저강기간 중의 활성변화는 추후 지속되도록 하였다. 본 실험 결과를 바탕으로 분석할 때, 본 발명의 다이어트 효소식품의 유통기한은 2년 이상이 가능한 것으로 판단되었다.

[표 9] 장기간 저장시 개발제품의 효소활성 및 항산화활성 변화

6. 관능검사 및 체중감소효과 확인

제조된 다이어트 효소식품에 대한 소비자들의 평가를 위해 관능검사 및 섭취 후 체중감소효과 여부를 확인하였다.

(1) 관능검사 방법

제조된 다이어트 효소식품의 관능검사는 일반인들을 대상으로 50명을 선정하여 본 실험의 목적과 평가방법에 대한 교육 후 5점 척도법으로 실시하였다. 관능검사 설문조사의 대상자들은 본인이 비만하다고 생각하거나 다이어트의 필요성을 느끼고 있는 성인들을 선발하였으며 시제품을 제공한 후 1개월 후의 표준체중감소율, 외관(appearance), 색상(color), 향미(flavor), 부드러움(softness), 맛(taste) 및 종합적인 기호도(overall acceptability)로 나누었고 기호도 평가 항목은 매우 좋다는 5점, 좋다는 4점, 보통이다는 3점, 나쁘다는 2점 그리고 매우 나쁘다는 1점으로 나타냈다. 표준체중은 신장에서 100을 뺀 다음 0.9를 곱해 산출하였다.

(2) 통계처리

본 실험의 통계분석은 SPSS(statistical package for the social science) version 18.0 프로그램(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 실시하였다. 먼저, 조사대상자의 일반적인 사항과 제품에 대한 만족도는 빈도(Frequency, N)와 퍼센트(Percentage, %)를 구하였고, 전체적인 몸무게 변화율의 평균값은 평균(Mean, M)과 표준편차(Standard Deviation, SD)를 구하였다. 또한 효소 음료 체험 전과 후의 체중에 대한 만족도의 변화와 몸무게 변화량의 차이를 살펴보기 위해 paired t-test를 실시하였다.

(3) 결과 및 요약

조사대상자의 일반적인 사항은 표 10과 같다. 조사대상자는 20세 이상 성인 남성과 여성 각각 25명씩이었고, 연령은 20대가 22명(44.0%), 30대가 19명(38%), 40대가 9명(18%)이었다.

[표 10] 체험 대상자의 일반 사항

효소 제품 체험 후의 체중 감량 효과를 살펴본 결과는 표 11과 같다. 음료 체험 전에 비해 체험 후에 평균적으로 4.10±1.91kg의 체중 감량 효과가 있었으며, t값은 15.13으로 체험 전과 체험 후의 몸무게는 p<0.001 수준에서 통계적으로 유의미한 차이가 있는 것으로 나타났다. 즉 제품 체험 후 체중 감량 효과가 있었다.

[표 11] 제품 체험 후 감량 효과

또한 몸무게의 변화율을 살펴본 결과, 표 12와 같이 몸무게의 감소량이 최소 2%에서 최대 13.56%로 나타났으며, 전체적인 몸무게 변화율의 평균값은 5.94±2.16%로 5%이상 체중 감량 효과가 있었다.

[표 12] 제품 체험 후 체중변화율

제품을 체험하기 전과 체험 후의 자신의 체중에 대한 만족감의 차이를 살펴보면, 표 13과 같이 제품 체험 후 자신의 체중에 대한 만족감이 제품 체험 전에 비해 평균적으로 1.50±1.15점 만큼 상승했으며, t값은 9.25로 체험 전후 자신의 몸무게에 대한 만족도는 p<0.001 수준에서 통계적으로 유의미한 차이가 있는 것으로 나타났다. 즉 제품 체험 후 자신의 체중에 대한 만족도가 높았다.

[표 13] 제품 체험과 관련한 대한 체중 만족도 변화

제품 만족도에 관한 조사에서는 표 14와 같이 장의 편안함이나 소화율에 있어서는 98%가 만족하였고, 맛과 향 등 전반적인 이용성에 대한 만족도에서는 100% 만족한다는 결과가 나왔다.

[표 14] 제품 만족도 조사

Claims (6)

1. (a) 백미, 현미, 보리, 통밀 중 어느 하나 이상의 곡물을 증자하여 고두밥을 만든 후 백국균과 황국균을 접종하고 배양하여 포자를 생성시킨 후 생성된 포자를 건조시켜 종국으로 회수하는 종국의 제조단계;
   (b) 백미, 현미, 보리, 통밀 중 어느 하나 이상의 곡물을 증자한 후 상온으로 냉각시키고 상기 (a) 단계에서 얻은 종국을 0.4~0.6중량%로 접종하고 25~32℃에서 2~5일간 배양하는 입국의 제조단계;
   (c) 대두를 증자한 후 건조시키고 조분쇄하여 얻은 대두분을 수분 함량 40~60%로 조정한 후 황국균을 4~0.6중량%로 접종하고 25~32℃에서 일정 시간 간격으로 뒤집어 주면서 3~6일간 발효시키는, 황국균을 이용한 대두의 발효 단계; 및
   (d) 상기 (b) 단계에서 얻어진 입국과 (c) 단계에서 얻어진 발효된 대두에 물을 가해 가용성 성분을 추출한 후 가용성 성분이 포함된 상등액과 불용성 성분을 분리하고, 상기 상등액을 한외여과시켜 부피가 1/3 이하로 감소될 때까지 농축시킨 후 동결건조시켜 조효소 농축물을 얻고, 상기 동결건조된 조효소 농축물에 상기 분리한 불용성 성분을 8~12배 중량으로 혼합한 후 균질화하여 효소 농축 발효물을 제조하는 단계를 포함하는, 효소 농축 발효물을 유효성분으로 함유하는 효소식품의 제조방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 입국의 제조단계는 곡물로 백미, 현미, 보리 및 통밀의 혼합곡물을 사용하여, 수분함량 50±5%, pH 4.0±0.5, 28±1℃에서, 제조 후 30일 이내의 냉장보관된 종국으로 3일간 발효시키는 것을 특징으로 하는 효소식품의 제조방법.
3. (a) 백미, 현미, 보리, 통밀 중 어느 하나 이상의 곡물을 증자하여 고두밥을 만든 후 백국균과 황국균을 접종하고 배양하여 포자를 생성시킨 후 생성된 포자를 건조시켜 종국으로 회수하는 종국의 제조단계;
   (b) 백미, 현미, 보리, 통밀 중 어느 하나 이상의 곡물을 증자한 후 상온으로 냉각시키고 상기 (a) 단계에서 얻은 종국을 0.4~0.6중량%로 접종하고 25~32℃에서 2~5일간 배양하는 입국의 제조단계;
   (c) 대두를 증자한 후 건조시키고 조분쇄하여 얻은 대두분을 수분 함량 40~60%로 조정한 후 황국균을 4~0.6중량%로 접종하고 25~32℃에서 일정 시간 간격으로 뒤집어 주면서 3~6일간 발효시키는, 황국균을 이용한 대두의 발효 단계;
   (d) 상기 (b) 단계에서 얻어진 입국과 (c) 단계에서 얻어진 발효된 대두에 물을 가해 가용성 성분을 추출한 후 가용성 성분이 포함된 상등액과 불용성 성분을 분리하고, 상기 상등액을 한외여과시켜 부피가 1/3 이하로 감소될 때까지 농축시킨 후 동결건조시켜 조효소 농축물을 얻고, 상기 동결건조된 조효소 농축물에 상기 분리한 불용성 성분을 8~12배 중량으로 혼합한 후 균질화하여 효소 농축 발효물을 제조하는 단계; 및
   (e) 율무, 탱자, 옥수수 수염 및 표고버섯의 건조분말을 상기 (d) 단계에서 얻어진 효소 농축 발효물 100 중량부에 대하여 각각 30~80 중량부로 혼합하는 단계를 포함하는, 효소 농축 발효물과 항산화활성 식품소재를 유효성분으로 함유하는, 다이어트를 위한 효소식품의 제조방법.
4. 제3항에 있어서,
   상기 입국의 제조단계는 곡물로 백미, 현미, 보리 및 통밀의 혼합곡물을 사용하여, 수분함량 50±5%, pH 4.0±0.5, 28±1℃에서, 제조 후 30일 이내의 냉장보관된 종국으로 3일간 발효시키는 것을 특징으로 하는, 다이어트를 위한 효소식품의 제조방법.
5. 제1항의 (a) 내지 (d) 단계를 포함하는 방법으로 얻은 효소 농축 발효물을 유효성분으로 함유하는 효소식품.
6. 제5항에서 있어서, 상기 효소식품은 효소 농축 발효물 100 중량부에 대하여 율무, 탱자, 옥수수 수염 및 표고버섯의 건조분말을 각각 30~80 중량부로 더 포함하는, 다이어트를 위한 효소식품.
   

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