CN116064241A - 盾壳霉yafef037菌株及其分离方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，尤其公开一种盾壳霉YAFEF037菌株及其分离方法和应用，保藏名称为盾壳霉YAFEF037(Coniothyrium sp.YAFEF037)；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2022610，本发明对多种致病细菌有较好的抑制作用，能有效的缓解耐药菌株带来的危机，为探究新的抗细菌药物提供新的途径，并对开发新型生物农药提供重要指导依据。

Description

盾壳霉YAFEF037菌株及其分离方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种盾壳霉YAFEF037菌株及其分离方法和应用。
背景技术
共生真菌(Plant symbiotic fungi)是植物生活史的特定阶段或全部阶段寄生在植物组织内，而不引起植物产生有害症状的微生物，包括菌根真菌以及生活在植物表面的内生真菌和潜伏性病原菌。研究表明，在长期共进化过程中，共生菌与宿主植物形成了特殊的生理代谢途径，产生出各种结构新颖的活性化合物，目前还有很多活性共生菌未被开发，对我们开发新的抗菌药物有重要的作用，能有效缓解耐药菌株带来的危机。
目前共生菌的初级代谢和次生代谢产物已成为研究热点，已经有学者在苦楝、香椿、黄芪和党参等多种植物共生菌中发现具有抗细菌、抗氧化、抗真菌等的天然活性物质。植物的各个部位如叶、花、树皮和根等均含有丰富的次生代谢产物，部分次生代谢产物具有优良的抗菌活性，尤其对一些耐药性细菌具有较强的拮抗活性，如生物碱类、萜类、黄酮类和醌类等。为了杀死植物病菌或者抑制病菌活性，人们发明了抗生素和合成抗菌药物，随着抗菌药物的广泛应用，致病细菌对抗生素产生耐药性，甚至出现了多重耐药性，致病菌耐药性的发生和蔓延已构成对人类健康的严重威胁，研究新的抗菌药物已经成为一个重大的科研命题。
哈巴乌头(Aconitum habaense)系毛茛科(Ranunculaceae)乌头属(Aconitum L.)草本植物，产于云南省西北部，生于海拔4000米左右的山地林边灌丛或草丛，是藏区常用的药用植物。乌头属植物具有显著的生理活性，如：镇痛、局麻、镇静、解热和强心等功效，含有二萜生物碱、4-甲氧基苯甲酸、，3,4-二甲氧基苯甲酸和β-谷甾醇等化合物。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种盾壳霉YAFEF037菌株及其分离方法和应用，本发明通过分离筛选哈巴乌头的共生菌，得到一株具有抗菌活性的真菌 YAFEF037，通过实验发现，YAFEF037菌丝体提取物对蜡样芽孢杆菌、无乳链球菌、藤黄微球菌、大肠埃希菌等细菌具有较好的耐药性，为研究开发新的抗细菌药物提供新的途径。
为了实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：
本发明的盾壳霉YAFEF037菌株，该菌株为哈巴乌头根部共生真菌；保藏名称为盾壳霉YAFEF037(Coniothyrium sp.YAFEF037)；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉大学；保藏日期：2022年5月12日；保藏编号:CCTCC M 2022610。所述的盾壳霉YAFEF037菌株的ITS基因序列包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种菌剂，包括盾壳霉YAFEF037菌株的培养物或其加工物。
进一步的，一种菌剂，其活性成分包括如下(a)(b)(c)中的至少一种：
(a)盾壳霉YAFEF037菌株的菌丝体粗提物；
(b)盾壳霉YAFEF037菌株细胞的超声裂解上清；
(c)盾壳霉YAFEF037菌株细胞的超声裂解沉淀。
优选的，培养盾壳霉YAFEF037菌株的培养基为OSMM培养基。
优选的，所述OSMM培养基包括如下组分：大米10g/瓶，MM液体培养基 15mL/瓶，所述MM液体培养基包括：硝酸钠6g/L，氯化钾0.52g/L，七水硫酸镁0.52g/L，磷酸二氢钾1.52g/L。
进一步的，盾壳霉YAFEF037菌株其培养物或者加工物在制备抑制致病菌的药物中的应用中具有良好的抑菌效果。
优选的，所述致病菌为蜡样芽孢杆菌、无乳链球菌、藤黄微球菌或大肠埃希菌。
本发明还提供了一种分离权利要求1或2所述的盾壳霉YAFEF037菌株的方法，包括以下步骤：
(1)采集的哈巴乌头根部样品；
(2)将样品组织块等距离放在PDAKAS抗细菌培养基上培养；
(3)将菌丝转接的到固体PDA培养基，培养后，对菌株进行分子鉴定，得到盾壳霉YAFEF037菌株。
进一步的，所述PDAKAS抗细菌培养基包括：马铃薯粉葡萄糖琼脂培养基+ 氨苄青霉素50ug/mL+卡那霉素50ug/mL，所述PDA固体培养基包括：马铃薯浸粉5g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖20g/L，七水硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，维生素B1 0.1g/L，琼脂16g/L。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明通过分离筛选哈巴乌头根部的共生菌，得到一种新的盾壳霉属真菌(Coniothyrium sp.)YAFEF037，真菌在PDA培养基上生长良好，菌丝是青灰色呈放射状向周围生长，菌丝密集，且菌层较薄，菌落呈规则的圆形状，通过实验发现，YAFEF037菌丝体粗提物对蜡样芽孢杆菌、无乳链球菌、藤黄微球菌、大肠埃希菌等细菌具有较好的抗细菌活性，能有效的缓解耐药菌株带来的危机，为探究新的抗细菌药物提供新的途径。
附图说明
图1为本发明所述的YAFEF037菌丝生长情况图；
图2为本发明YAFEF037与已知抗生素活性检测结果图；(注：a.氨苄青霉素； b.四环素；c.卡拉霉素；d.YAFEF037菌株。)
图3为本发明不同的培养基培养YAFEF037菌株抑菌效果图；(注：1.LMM液体培养基；2.PDA液体培养基；3.JRMM固体培养基；4.OSMM固体培养基；5.MY 液体培养基；6.PSA液体培养基；7.CCMM固体培养基；8.SBMM固体培养基； 9.OMAM固体培养基。)
图4为本发明的YAFEF037荧光显微镜下菌丝体图；
图5为本发明的YAFEF037对蜡样芽孢杆菌的抑制作用图，a、b、d表示对照组，c表示实验组；
图6为本发明的YAFEF037对无乳链球菌的抑制作用图，a、b、d表示对照组， c表示实验组；
图7为本发明的YAFEF037对藤黄微球菌的抑制作用图，a、b、d表示对照组， c表示实验组；
图8为本发明的YAFEF037对大肠埃希菌的抑制作用图，a、b、d表示对照组， c表示实验组；
图9本发明基于ITS构建了哈巴乌头共生真菌YAFEF037的系统发育树显示图。
具体实施方式
下面本发明结合附图和具体实施例作进一步说明，本发明中使用的化学物均为分析纯级别，均可以由市场购买。
实施例1
YAFEF037，该菌株为哈巴乌头根部共生真菌；保藏名称为盾壳霉YAFEF037(Coniothyrium sp.YAFEF037)；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉大学；保藏日期：2022年5月12日；保藏编号:CCTCC M 2022610。该培养物于2022年05月12日由保藏中心收到，并登记入册，由该日起保存三十年，在期满前收到提供培养物样品的请求后再延续保存五年，该培养物的存活性由保藏中心于2022年05月19日检测完毕，结果为存活。
该菌株形态如图1所示，真菌在PDA培养基上生长良好，菌丝是青灰色呈放射状向周围生长，菌丝密集，且菌层较薄，菌落呈规则的圆形状，经过测试其效果如图5-8所示，菌株培养后的菌丝体粗提物对蜡样芽孢杆菌、无乳链球菌、藤黄微球菌、大肠埃希菌等致病细菌都具有较好的抗细菌活性，致病细菌购于广东省细菌耐药性监测和质量控制中心。为缓解致病菌耐药性对人类健康构成的威胁，研究开发新的抗细菌药物提供新的途径。
实施例2
盾壳霉YAFEF037菌株的分离和鉴定
1、盾壳霉YAFEF037菌株的分离
将采集的哈巴乌头根部样品用自来水冲洗12h，清除样品表面的真菌或者其他微生物，然后转入无菌工作台进行消毒处理，先用1L无菌水冲洗样品，放在培养皿中用接种刀切成小段放于50mL无菌离心管中；然后用75％的乙醇浸泡 1min(期间不断震荡)，倒掉乙醇后，用无菌水冲洗3次；无菌水冲洗后，倒入10mL 配置好的5％H2O2，浸泡3min(期间不断震荡)，倒掉H2O2后，再用无菌水冲洗3 次；将消毒后的样品用无菌滤纸吸干表面多余的水分，晾干备用。
然后在超净工作台中用已经高压灭菌的剪子或解剖刀把哈巴乌头根部切成0.5cm大小的组织块，将组织块等距离放在PDAKAS抗细菌培养基上(PDAKAS 抗细菌培养基：马铃薯粉葡萄糖琼脂培养基+氨苄青霉素50ug/mL+卡那霉素 50ug/mL)培养，每个培养皿放置8个组织块，把培养皿做好标记，将培养皿倒置放于26℃培养箱中培养，培养15d左右，期间不定期观察。
最后将培养基中长出的菌丝，在显微镜下把长出的菌丝转接的到PDA培养基上培养，持续观察15d后，将所挑取的菌株进行后续分子鉴定后得到哈巴乌头共生真菌YAFEF037。
2、哈巴乌头共生菌的鉴定
(1)形态的鉴定
真菌在PDA培养基上生长良好，菌丝是青灰色呈放射状向周围生长，菌丝密集，且菌层较薄，菌落呈规则的圆形状。
(2)DNA提取
试验前先CTAB在65℃水浴锅中加热30min以上；取哈巴乌头共生菌分离纯化培养的菌丝体于2mL的离心管中，并将离心管放到装有液氮的不锈钢罐中浸泡6min，用破碎机破碎1.5min，将菌丝体打碎；离心管中加入1mL的CTAB、 20uLβ-巯基乙醇，摇匀(10min)，放到水浴锅水浴1h；水浴结束后，放入离心机离心10min·4℃·12000r/min；取上清液，加入1mL(酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1)，振摇10min，离心10min(重复两次)；取上清液，加入50uLNaAc和1mL无水乙醇(-20℃)，摇匀放入-20℃冰箱沉淀1h；沉淀完离心10min，加入500uL75％酒精洗脱2次(3min/次)，加入500uL无水乙醇洗脱1次；离心3min，弃乙醇，放置干；加入40uL洗脱缓冲剂，瞬时离心，得到真菌YAFEF037基因组DNA。
(3)ITS分析鉴定
用真菌通用引物ITS1(5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)和ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)扩增真菌rDNA的间隔序列(含ITS1区、 5.8S区、ITS4区)序列，所得得ITS测序序列如SEQ ID No.1所示。
(4)构建发育树
基于ITS构建哈巴乌头共生菌的系统发育树(图9)，综合菌株形态学鉴定和分子生物学鉴定结果，该真菌与盾壳霉属真菌(Coniothyrium sp.)亲缘关系最近，所以将YAFEF037菌株鉴定为盾壳霉属真菌(Coniothyrium sp.)。
实施例3
盾壳霉YAFEF037菌株活性物质的提取
1、固体发酵培养
将已长成型的盾壳霉YAFEF037菌株菌丝体刮取适量放入2mL灭菌离心管中，再加入1mL无菌水，破碎90S，然后将破碎样品液取500μL分别接种到每个装有OSMM培养基的组培瓶中，置于恒温培养箱26℃，培养15d。OSMM培养基包括如下组分：大米10g/瓶，MM液体培养基15mL/瓶(硝酸钠6g/L，氯化钾0.52g/L，七水硫酸镁0.52g/L，磷酸二氢钾1.52g/L)，混匀至350mL组培瓶中。
2、培养物菌丝体提取
将组培瓶培养的菌丝体置于60℃烘箱中干燥7h，去除培养基中的水分后，加入100mL乙醇超声震荡40min后静置48h，然后将菌液用漏斗进行分离，萃取溶液用旋转蒸发仪冷凝回流干燥，制得盾壳霉YAFEF037菌株培养的菌丝体粗提物。
试验例1
盾壳霉YAFEF037菌株培养物的菌丝体粗提物的抗菌活性检测
1、致病菌的活化
将购于广东省细菌耐药性监测和质量控制中心的致病菌蜡样芽孢杆菌、无乳链球菌、藤黄微球菌、大肠埃希菌等致病细菌分别取少量加入2mL离心管中，再加入700ul的LB液体培养基，然后将离心管放入37℃，转速为180r·min-1恒温摇床中培养12h，得到致病菌菌液，置于4℃冰箱备用，取出活化好的细菌进行稀释1/10倍。
2、阳性对照所用抗生素及配制
氨苄青霉素(Ampicillin)(批号：0339，纯度：95％)，购于昆明硕阳科技有限公司。精密称取氨苄青霉素50mg，分别置于离心管中，加入1mL DMSO溶液配置成50mg/ml的抗生素DMSO溶液，备用,其他抗生素四环素；卡拉霉素购置时纯度不小于95％，实验配置方式同氨苄青霉素一致。
3、滤纸片法检测抗菌活性
取适量盾壳霉YAFEF037菌株菌丝体粗提物，称重后加入适量DMSO(二甲基亚砜)溶液，稀释到50mg/mL。将活化得到的致病菌液分别均匀涂抹在LB 固体培养基上，晾干后，将吸取了已溶解的盾壳霉YAFEF037菌株菌丝体粗提物的5mm的滤纸圆片放在培养基的对应标记处，并用5mm滤纸圆片蘸取DMSO 溶液和氨苄青霉素作为阴性对照，将培养基正放置于37℃的恒温培养箱中培养 12h，观察是否出现抑菌圈并用十字交叉法量出抑菌圈的直径大小。盾壳霉 YAFEF037菌株培养物的菌丝体粗提物(50mg/mL)的抗细菌活性结果。如表1 所示和图5-8所示，盾壳霉YAFEF037菌株粗提物具有显著的抑菌活性：
表1哈巴乌头共生真菌YAFEF037粗提物抗菌活性与阳性对照比较
对比例
为进一步确定盾壳霉YAFEF037菌株粗提物的抗菌效果，大肠埃希菌为致病菌，将盾壳霉YAFEF037菌株与其它已知抗生素做抑菌活性检测，并对不同培养基培养的YAFEF037菌株进行抑菌活性检测，以及不同种属的抑菌活性性进行检测，同上述试验采用滤纸圆片法观察是否出现抑菌圈，并用十字交叉法量出抑菌圈的直径大小，结果如下所示。
1、盾壳霉YAFEF037菌株与已知抗生素活性检测结果显示(图2)，盾壳霉YAFEF037菌株抑制大肠埃希菌的活性结果明显，且抑菌圈直径达到1.8cm具有显著抑菌效果。
2、通过不同的培养基培养YAFEF037菌株，并对其粗提物进行抑菌活性检测，结果发现在OSMM培养基液体发酵培养菌株生长效果最佳，且抑菌活性最明显(图3)。
固体培养基培养获取培养物方法与上述实施例3固体发酵获取培养物方法一样，而液体培养基获取培养物方法为刮取适量YAFEF037菌株菌丝体放入2mL 离心管，加入500uL无菌水，放入细胞破碎匀浆机破碎1min，取破碎液接种到每个装有液体培养基的锥形瓶中，置于恒温震荡培养箱培养8d(150r·min-1，28℃)；发酵培养完成后，用分液漏斗将菌丝体和菌液分离，在菌液中加入1:1乙酸乙酯摇匀，静置12h，充分萃取后取上清液溶液用旋转蒸发仪冷凝回流干燥，制得 YAFEF037菌株培养的发酵液提取物，活性检测方法与上述方法一致。
培养基配方：
LMM液体培养基：乳糖15g/L，硝酸钠6g/L，氯化钾0.52g/L，七水硫酸镁 0.52g/L，磷酸二氢钾1.52g/L，微量元素1mL/L；
PDA液体培养基：马铃薯浸粉5g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖20g/L，七水硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，维生素B1 0.1g/L；
JRMM固体培养基：核桃渣8g瓶+MM培养基15mL/瓶(硝酸钠6g/L，氯化钾0.52g/L，七水硫酸镁0.52g/L，磷酸二氢钾1.52g/L)核桃渣为干的核桃仁榨油后的剩余油渣；
OSMM固体培养基：大米10g/瓶+MM培养基15mL/瓶(硝酸钠6g/L，氯化钾0.52g/L，七水硫酸镁0.52g/L，磷酸二氢钾1.52g/L)；
MY液体培养基：酵母麦芽浸粉肉汤21g/L；
PSA液体培养基：马铃薯浸粉5g/L，酵母粉5g/L，蔗糖20g/L，七水硫酸镁 0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，维生素B1 0.1g/L；
CCMM固体培养基:山核桃渣8g/瓶+MM培养基15mL/瓶(硝酸钠6g/L，氯化钾0.52g/L，七水硫酸镁0.52g/L，磷酸二氢钾1.52g/L)山核桃渣为干的山核桃仁榨油后的剩余油渣；
SBMM固体培养基:高粱粉7g/瓶+MM培养基15mL/瓶(硝酸钠6g/L，氯化钾0.52g/L，七水硫酸镁0.52g/L，磷酸二氢钾1.52g/L)；
OMAM固体培养基:大豆蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，酵母粉1g/L，蔗糖 20g/L。
本发明筛选得到一种盾壳霉YAFEF037菌株(盾壳霉属真菌Coniothyrium sp.)，其菌株培养物的菌丝体粗提物对蜡样芽孢杆菌、无乳链球菌、藤黄微球菌、大肠埃希菌等致病细菌都具有较好的抗细菌活性，致病细菌购于广东省细菌耐药性监测和质量控制中心。为缓解致病菌耐药性对人类健康构成的威胁，研究开发新的抗细菌药物提供新的途径。
其他培养或者加工方法，如盾壳霉YAFEF037菌株细胞的超声裂解上清；超声裂解沉淀，基于真菌YAFEF037的抗菌效果下，其加工物或者培养物均具备相应的抗菌活性，使用本菌制备相关抗菌活性药物、菌剂等，均在本发明的保护范围内。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims (10)

1.盾壳霉YAFEF037菌株，其特征在于，保藏名称为盾壳霉YAFEF037(Coniothyriumsp.YAFEF037)，保藏编号为CCTCC M 2022610。
2.根据权利要求1所述的盾壳霉YAFEF037菌株，其特征在于，所述的盾壳霉YAFEF037的ITS基因序列包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
3.一种菌剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述的盾壳霉YAFEF037菌株的培养物或其加工物。
4.根据权利要求3所述的一种菌剂，其特征在于，其活性成分包括如下(a)(b)(c)中的至少一种：
(a)盾壳霉YAFEF037菌株的菌丝体粗提物；
(b)盾壳霉YAFEF037菌株细胞的超声裂解上清；
(c)盾壳霉YAFEF037菌株细胞的超声裂解沉淀。
5.根据权利要求3或4所述的一种菌剂，其特征在于，培养盾壳霉YAFEF037菌株的培养基为OSMM培养基。
6.根据权利要求5所述的一种菌剂，其特征在于，所述OSMM固体培养基包括如下组分：大米10g/瓶，MM液体培养基15mL/瓶，所述MM液体培养基包括：硝酸钠6g/L，氯化钾0.52g/L，七水硫酸镁0.52g/L，磷酸二氢钾1.52g/L。
7.一种根据权利要求1或2所述的哈巴乌头共生真菌YAFEF037或权利要求3或4所述的菌剂在制备抑制致病菌的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述致病菌为蜡样芽孢杆菌、无乳链球菌、藤黄微球菌或大肠埃希菌。
9.一种分离权利要求1或2所述的盾壳霉YAFEF037菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采集的哈巴乌头根部样品；
(2)将样品组织块等距离放在PDAKAS抗细菌培养基上培养；
(3)将菌丝转接的到固体PDA培养基，培养后，对菌株进行分子鉴定，得到盾壳霉YAFEF037菌株。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述PDAKAS抗细菌培养基包括：马铃薯粉葡萄糖琼脂培养基+氨苄青霉素50ug/mL+卡那霉素50ug/mL，所述PDA固体培养基包括：马铃薯浸粉5g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖20g/L，七水硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，维生素B10.1g/L，琼脂16g/L。
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