CN102408995A - 防治菌核病生防菌盾壳霉Chy-1C-1悬浮剂及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一种防治菌核病的生防菌盾壳霉菌株的分离筛选，由该菌株生产的悬浮剂及应用。所述盾壳霉(Coniothyrium minitans)Chy-1C-1菌株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2010238。该悬浮剂是将盾壳霉Chy-1C-1菌株通过固体发酵生产的含菌孢子液，与润湿分散剂、粘度调节剂、防腐剂、防冻剂和消泡剂混合制得。本发明还提供了该悬浮剂的制备方法及盾壳霉Chy-1C-1悬浮剂在防治油菜菌核病中的应用。本发明的盾壳霉Chy-1C-1菌株及其悬浮剂对油菜菌核病具有良好的生防效果。

Description

防治菌核病生防菌盾壳霉Chy-1C-1悬浮剂及其制备与应用

技术领域

本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一株防治菌核病的生防菌盾壳霉Chy-1C-1菌株的选育，包含该菌株的微生物制剂即悬浮剂，其制备方法与应用。 

背景技术

由核盘菌[Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary]引起的油菜菌核病是世界性分布的重要病害(Purdy，1979)。这种病菌对一些重要的经济作物如油菜、大豆、向日葵、莴苣等作物的产量和品质构成了极大威胁。核盘菌引起的油菜菌核病同时也是我国油菜上的一种重要病害，尤其是长江流域及东南沿海油菜产区发生严重。一般年份发病率为10％-30％，严重年份可达80％以上。油菜感病后减产11％-73％，含油量降低1％-5％，严重影响油菜的产量和品质(李丽丽，1994)。目前防治菌核病的主要手段是花期喷施化学农药。防治菌核病的杀菌剂有多菌灵、农利灵、速克灵等单剂以及二十多种复配制剂。但杀菌剂的长期使用产生了一些问题如核盘菌形成抗药和杀菌剂在环境中残留，并引起环境污染等(杨谦，1995；潘以楼等，1997；石志琦等，2000；Gossen et al.，2001)。 

近年来，生物防治已成为一种重要的防治措施，越来越受到研究者的青睐。使用生物农药既可有效地防治病虫害，又不杀伤天敌，病原菌和害虫不易产生抗性，对人畜无毒，有利于可持续发展和农业的生产。 

盾壳霉(Coniothyrium minitans)的分类地位，属于半知菌亚门、腔孢纲、球壳孢目，是菌核病病菌上一种重要的重寄生菌，世界范围内分布广泛。Campbell(1947)首次报道了盾壳霉这种核盘菌重寄生菌。在国内，罗宽等(1987)在我国南方油菜产区土壤中分离鉴定出盾壳霉。李国庆等(1995)从黑龙江、江西、重庆和湖北等地采集的土壤中分离到这种真菌。前人的研究报道中盾壳霉防治作物菌核病的方法有两种：土壤处理和植物地上部分处理。具体的使用方式可以有：播种或移植前进行土壤处理降低病原接种体数量；作物收获后翻耕前在病植株或病残体上喷雾孢子以净化作物；对作物种子进行拌种或包衣；作物生长期进行地上部分喷雾等(de Vrije et al.，2001；McQuilken et al.，1997)。在田间和温室的许多作物如莴苣、油菜、向日葵、大豆、菜豆、胡萝卜、芹菜、菊苣、马铃薯和洋葱等所进行的试验都证明了盾壳霉的应用价值(deVrije et al.，2001)。盾壳霉分生孢子作为生防菌已得到广泛深入的研究，在国外已被开发成多个商品制剂并用于防治蔬菜及大田作物菌核病(Filippov，1989；Budge et al.，2001)。而我国盾壳霉制剂的生产技术却未见报道。目前把盾壳霉制成制剂是商业化应用的关键一步。本发明将盾壳霉Chy-1C-1分生孢子纯化并制成制剂为盾壳霉的广泛应用奠定了重要基础。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一株对核盘菌有强寄生致腐作用的盾壳霉菌株 Chy-1C-1，本发明还提供了利用该菌株制备的盾壳霉Chy-1C-1的微生物制剂，其中包括悬浮剂，其制备方法与应用。 

一、菌株的分离与筛选 

分离与鉴定：1995年5月申请人的发明人从中国湖北省长阳县蔬菜种植园土壤中分离、筛选得到一株对核盘菌菌核具有强寄生致腐作用的盾壳霉菌株，申请人将其命名为盾壳霉(Coniothyrium minitans)Chy-1C-1。本发明的盾壳霉Chy-1C-1分离和筛选采用核盘菌菌核诱捕法(Adames等，1980)和稀释平板方法，菌种鉴定工作参照魏景超《真菌鉴定手册》上海科学技术出版社，1979版介绍的方法。 

本发明分离筛选的盾壳霉(Coniothyrium minitans)Chy-1C-1菌株，已于2010年9月17日送交用于专利程序的湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(英文简称CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCC NO：M 2010238。 

盾壳霉Chy-1C-1的菌学特征： 

分生孢子黑褐色、椭球形、表面不平，大小为3.5-4.7μm×5.3-8.8μm(平均3.9×6.4μm)，取幼嫩(白色小点)的分生孢子器压片可见成排排列的基部宽阔的产孢细胞。在PDA平板上，菌丝初期无色，气生菌丝不发达，菌丝一边扩展，菌落表面一边形成白色分生孢子器，随培养时间的延长，菌落逐渐变褐，孢子器吐出黑色水滴即溢出分生孢子。盾壳霉的菌丝在10-28℃范围内均能生长，最适生长温度为20℃，最高生长温度为30℃，在pH2-11的环境中均能生长，适宜生长的pH为3-4，在pH为4的PDA平板上菌落日扩展0.7cm。 

二、利用盾壳霉Chy-1C-1菌株制备悬浮剂 

将上述盾壳霉Chy-1C-1进行固体发酵(见图1)12天后，将发酵料(见实施例2所述)加水清洗，过滤去除固体杂质，得孢子液离心浓缩，再稀释到合适浓度。再加入润湿分散剂、粘度调节剂、防腐剂、防冻剂、消泡剂和紫外保护剂。 

申请人利用上述保藏号为CCTCC NO：M 2010238生防菌盾壳霉Chy-1C-1生产了一种防治菌核病的的微生物制剂，该制剂是一种悬浮剂，其包含如下组分，按质量百分比计： 

保藏号为CCTCC NO：M 2010238盾壳霉Chy-1C-1分生孢子：2×10⁹ml^-1； 

润湿分散剂3～5％； 

粘度调节剂0.3～0.4％； 

防腐剂0.1～0.2％； 

防冻剂0～5％； 

消泡剂0～5％； 

紫外保护剂0.05～0.2％； 

其中所述的润湿分散剂为木质素磺酸钠或木质素磺酸钙；粘度调节剂为黄原胶；防腐剂为链霉素；防冻剂为乙二醇；消泡剂为二甲基硅油；紫外保护剂为维生素C。 

盾壳霉Chy-1C-1分生孢子悬浮剂的制备方法： 

先将润湿分散剂木质素磺酸钠或木质素磺酸钙、粘度调节剂黄原胶、防腐剂链霉素、紫外保护剂抗坏 血酸混合均匀，再缓慢倒入搅拌的盾壳霉Chy-1C-1孢子液中，再结合天气和加工情况添加适量防冻剂乙二醇和消泡剂二甲基硅油，使助剂溶化，搅拌均匀即可。 

本发明具有以下特点： 

1、本发明筛选的盾壳霉菌株Chy-1C-1在油菜花瓣和叶片上抑制子囊孢子侵染，在土壤中可以有效地控制核盘菌菌核存活及其子囊盘萌发，从而控制核盘菌的初侵染源数量。 

2、制剂中的润湿分散剂极大提高了孢子在水中的分散能力和在油菜花瓣叶片上的润湿能力；制剂中的粘度调节剂提高了孢子悬浮剂的悬浮稳定性；紫外保护剂的加入，真菌生物活性保持时间长，抗紫外线能力强，产品质量稳定。 

3、加工过程和田间应用过程无粉尘污染，对作业者安全。 

4、所用助剂都是水溶性物质，而且田间用量非常少(亩用量只需要1～10g)，对环境非常友好，是绿色环保的微生物杀菌剂产品。 

5、上述的微生物制剂能有效的防治油菜菌核病。 

附图说明

图1：是盾壳霉Chy-1C-1固体浅盘发酵情况。其中：图1A是发酵前和发酵后对比，图1B和图1C是在发酵室固体浅盘发酵的情形。 

图2：是盾壳霉Chy-1C-1悬浮剂。其中：图2A是装瓶的盾壳霉Chy-1C-1悬浮剂，图2B是倾倒的盾壳霉Chy-1C-1悬浮剂。 

图3：是盾壳霉Chy-1C-1悬浮剂对核盘菌菌核寄生致腐情况。其中：图3A是悬浮剂中孢子寄生菌核的情形，图3B是菌核组织中的盾壳霉Chy-1C-1分生孢子器。 

具体实施方式

在下面的实施例中，申请人分离和鉴定盾壳霉Chy-1C-1菌株，在实验室对盾壳霉(Coniothyriumminitans)Chy-1C-1菌株进行固体发酵，悬浮剂的制备，悬浮剂中盾壳霉Chy-1C-1活孢率的测定，制剂对核盘菌菌核寄生致腐活性的试验，同时将制备的悬浮剂进行油菜菌核病的大田防治试验，以确定其对菌核病的控制作用。 

实施例1：盾壳霉Chy-1C-1菌株的分离与鉴定 

申请人于1995年5月从中国湖北省长阳县蔬菜种植园土壤中分离、筛选得到一株对核盘菌菌核具有强寄生致腐作用的盾壳霉菌株，申请人将其命名为盾壳霉(Coniothyrium minitans)Chy-1C-1。本发明的盾壳霉Chy-1C-1分离和筛选采用核盘菌菌核诱捕法(Adames等，1980)和稀释平板方法，菌种鉴定工作参照魏景超《真菌鉴定手册》上海科学技术出版社，1979版介绍的方法。 

该菌株已于2010年9月17日送交用于专利程序的位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(英文简称CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCC NO：M 2010238。 

实施例2：盾壳霉Chy-1C-1的固体发酵 

按照常规报道的固体发酵方法进行生产，其中固体发酵料配方(按质量百分比)为麦麸42.31％、玉米粉36.53％、稻壳21.16％，补充水分至含水量为85.12％，将上述发酵料在121℃下高压蒸汽灭菌2h，灭菌后立即接种1×10⁶ml^-1浓度盾壳霉Chy-1C-1孢子液，搅拌均匀，将其进行浅盘发酵，培养室温度为20℃，发酵培养12天，即得到本发明的盾壳霉Chy-1C-1孢子(1×10¹⁰g^-1)混合物。 

实施例3：盾壳霉Chy-1C-1悬浮剂配方的制备 

将实施例2中得到的盾壳霉Chy-1C-1的孢子混合物加水清洗，过滤去除固体杂质，得孢子液离心浓缩，再将盾壳霉Chy-1C-1固体发酵所得孢子液调整至浓度为2×10⁹ml^-1。本实施例中的盾壳霉Chy-1C-1悬浮剂所述百分比均为质量百分比。在所述的盾壳霉Chy-1C-1孢子液中加入木质素磺酸钠或木质素磺酸钙3％，黄原胶0.3％，链霉素0.1％，乙二醇0％，二甲基硅油1％，抗坏血酸(维生素C)0.05％，经搅拌混合均匀后得到所述的悬浮剂(注意在悬浮剂配制的时候要缓慢且不停搅动地加入上述助剂)。 

实施例4：盾壳霉Chy-1C-1悬浮剂中活孢率的测定 

取实施例3中悬浮剂样品，用无菌水稀释配至10⁶个孢子/ml的盾壳霉Chy-1C-1孢子悬液，取其0.1ml均匀涂布在含乳酸的PDA平板上，于20℃培养。之后，分别在24h和36h后用光学显微镜(40×10倍视野)观察孢子萌发情况，重复3次。每个平板上随机检查100个以上的孢子，当芽管长度大于孢子直径时即计为萌发。 

结果：经检测盾壳霉Chy-1C-1孢子萌发率均达95％以上。 

实施例5：盾壳霉Chy-1C-1悬浮剂寄生致腐核盘菌菌核的活性试验 

1、核盘菌菌核的培养 

将新鲜的胡萝卜用水冲洗干净后，切成小块装入三角瓶中湿热灭菌(即121℃下高压蒸汽灭菌)1h，倒出瓶中多于水分，冷却后，再将活化的核盘菌(田间采集，位于湖北武汉市华中农业大学实验田，但不限于此，长江中下游甘蓝型油菜秆内均附生有核盘菌菌核)菌丝块接种于三角瓶中，在18～20℃下培养1个月后，收集菌核，风干后挑选大小一致(0.5～1.0cm)的菌核，贮存于冰箱中(4℃)备用。 

2、盾壳霉Chy-1C-1悬浮剂对核盘菌菌核的寄生致腐作用测定 

取过筛(孔径为80目)的河沙，用自来水冲洗干净，装入培养皿(直径90mm)中在121℃下高压蒸汽灭菌3h，加适量无菌水至沙潮湿，然后将经过表面消毒的核盘菌菌核(用70％乙醇溶液和0.1％(w/v)升汞溶液将菌核样品各处理3min和5min，接着用无菌水浸洗3次，每次1min。)浸泡在浓度为1.0×10⁷个孢 子/ml的盾壳霉Chy-1C-1分生孢子液中(由实施例3中盾壳霉Chy-1C-1分生孢子悬浮液稀释所得，100粒菌核：10ml盾壳霉Chy-1C-1分生孢子悬浮液)30min，以浸泡在水中的核盘菌菌核为对照。 

然后将各处理的的核盘菌菌核半埋入装有灭菌细沙的培养皿中，每皿放20粒菌核，各处理设5次重复。用封口膜将培养皿逐个封口，并将这些培养皿置于20℃下培养2个月，培养期间不断向皿中添加适量的无菌水以保持沙湿度，最后逐个检查各菌核被盾壳霉Chy-1C-1寄生后的腐烂状况。根据盾壳霉Chy-1C-1产生的白色绒毛状菌丝、黑色分生孢子器及其分泌的分生孢子液等特征来鉴定被盾壳霉Chy-1C-1寄生的菌核，并将菌核的腐烂程度分成4级(即0，1，2和3级)：0级菌核没有被盾壳霉寄生；1级菌核表皮完好，但有明显的盾壳霉孢子液滴溢出；2级菌核被盾壳霉寄生，皮层完全腐烂，但髓部完好；3级菌核被盾壳霉寄生，皮层和髓部完全腐烂。 

3、实验结果：培养2个月后，检测发现100粒核盘菌菌核均发生腐烂，腐烂程度为4级。说明该盾壳霉Chy-1C-1悬浮剂能有效寄生致腐菌核。盾壳霉Chy-1C-1悬浮剂对核盘菌菌核寄生致腐情况见图3。 

实施例6：盾壳霉Chy-1C-1悬浮剂防治甘蓝型油菜菌核病的田间试验 

2010年春季的小区试验安排在湖北省鄂州市泽林镇翁垴村进行。供试油菜品种为甘蓝型油菜中双8号(为中国全国推广种植品种，由中国农业科学院油料作物研究所选育)。该试验用的甘蓝型油菜长势均匀一致。试验设3个处理：(1)实施例3制备的盾壳霉Chy-1C-1悬浮剂(浓度2×10⁹ml^-1)，用量为30ml/亩；(2)菌核净70％可湿性粉剂(美国巨邦农资国际贸易公司)，用量为30g/亩；(3)对照为喷清水。每一处理设4个小区，每一小区面积为20m²，各处理小区按完全随机区组排列。用背负式手动喷雾器于3月12日和3月19日分两次将各处理制剂或对照的清水均匀喷在甘蓝型油菜株冠上(花、枝条)。 

2010年春季的大田试验安排在湖北省大冶市。供试油菜品种为甘蓝型油菜中双8号(为中国全国推广种植品种，由中国农业科学院油料作物研究所选育)。油菜长势均匀一致。分别进行了2处大田试验。第一处大田试验设3个处理：(1)菌核净40％可湿性粉剂(山东省青岛金正农药有限公司生产)42g/亩，(2)实施例3所述盾壳霉Chy-1C-1悬浮剂(浓度2×10⁹ml^-1)63ml/亩，(3)对照(喷水)。每一处理面积为2亩。第二处大田试验设3个处理：(1)菌核净40％可湿性粉剂(山东省青岛金正农药有限公司生产)220g/亩，(2)实施例3所述盾壳霉Chy-1C-1悬浮剂(浓度2×10⁹ml^-1)45ml/亩，(3)对照喷清水。每一处理面积为2亩。用背负式手动喷雾器于3月12日将各处理制剂或清水均匀喷在甘蓝型油菜株冠上(花、枝条)。 

甘蓝型油菜收获前对各处理小区油菜逐株调查，记载菌核病发病油菜植株及其病级。将油菜菌核病病级分为5级(0，1，2，3，4)，各病级发病情况如下：0级：油菜植株没有发生菌核病。1级：油菜植株1/3以下分枝数发生菌核病或主茎病斑长度不超过3cm。2级：油菜植株1/3-2/3的分枝发生菌核病或发病分枝数在1/3以下，但主茎病斑超过3cm。3级：油菜植株2/3以上分枝数发病或发病分枝数在2/3以下及主茎中下部病斑超过3cm。4级：油菜植株2/3的分枝发生菌核病或主茎的病斑长度超过10cm。根据病级、发 病植株数和调查的植株总数计算各小区的发病率、病情指数和相对防治效果。结果如下： 

表1本发明的盾壳霉Chy-1C-1悬浮剂对甘蓝型油菜菌核病小区试验的防治效果 

表2本发明的盾壳霉Chy-1C-1悬浮剂对甘蓝型油菜菌核病大田试验的防治效果(第1示范点) 

表3本发明的盾壳霉Chy-1C-1悬浮剂对甘蓝型油菜菌核病大田试验的防治效果(第2示范点) 

由表1、2和3可知，本发明制备的盾壳霉Chy-1C-1悬浮剂处理的甘蓝型油菜植株发病率和发病指数都比对照低，且本发明的盾壳霉Chy-1C-1悬浮剂的防效与商品菌核净可湿性粉剂没有显著差异。田间实验结果表明本发明制备的盾壳霉Chy-1C-1悬浮剂对油菜菌核病具有较好的防治作用，具有良好的生防价值，可以对其进行开发应用。 

主要参考文献 

1.李丽丽.世界油菜病害研究概述.中国油料，1994，(1)：79-81 

2.杨谦，张翼鹏.核盘菌子囊盘形成的影响因子.东北林业大学学报，1995，3：126-130 

3.潘以楼，汪智渊，吴汉章.油菜菌核病对多菌灵的抗药性及其稳定性.江苏农业科学，1997，13：32-35 

4.石志琦，周明国，叶钟音，油菜菌核病菌对多菌灵、菌核净抗药性菌株性质研究.中国油料作物学报，2000，22：54-57 

5.李国庆，王道本，张顺和，但汉鸿.菌核寄生菌盾壳霉的研究I：生物学特性及在湖北省的自然分布.华中农业大学学报，1995a，14：125-129 

6.罗宽，周必文.油菜菌核病菌核上寄生真菌的研究.中国油料，1987，3：40-44 

7.Campbell W A.A new species of Coniothyrium minitans parasitic on sclerotia.Mycologia，1947，39：190-195 

8.Purdy L H.Sclerotinia sclerotiorum：history，diseases and symptomatology，host range，geographicdistribution，and impact.Phytopathology，1979，69：875-880 

9.Gossen B D，Rimmer S R，Holley J D.First report of resistance to benomyl fungicide in Sclerotiniasclerotiorum.Plant Disease，2001，85：1206-1209 

10.de Vrije T，Antoine N，Buitelaar R M，Bruckner S，Dissevelt M，Durand A，Gerlagh M，Jones E E，Lüth P， 

Oostra J，Ravensberg W J，Renaud R，Rinzema A，Weber F J，Whipps J M.The fungal biocontrol agent 

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Claims (4)

1.一种防治菌核病的生防菌菌株盾壳霉(Coniothyrium minitans)Chy-1C-1，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO：M 2010238。

2.包含保藏号为CCTCC NO：M 2010238的防治菌核病的生防菌盾壳霉Chy-1C-1的微生物制剂，该制剂是一种悬浮剂，其特征还包含如下组分，按质量百分比计：

保藏号为CCTCC NO：M 2010238盾壳霉Chy-1C-1分生孢子：2×10⁹ml^-1；

润湿分散剂3％～5％；

粘度调节剂0.3％～0.4％；

防腐剂0.1％～0.2％；

防冻剂0～5％；

消泡剂0～5％；

紫外保护剂0.05％～0.2％；

其中，所述的润湿分散剂为木质素磺酸钠或木质素磺酸钙；粘度调节剂为黄原胶；防腐剂为链霉素；防冻剂为乙二醇；消泡剂为二甲基硅油，紫外保护剂为维生素C。

3.权利要求1所述的菌株在制备在防治油菜菌核病悬浮剂中的应用。

4.权利要求2所述悬浮剂在油菜菌核病防治中的应用。

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